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1、PCR技术技术课程安排课程安排PCR扩增：人HLA-DRB基因（基因组DNA为模板）人-actin基因（cDNA为模板）PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析（-actin）PCR产物的SSCPPAGE分析（HLA-DRB）PCRPCR基本原理及相关知识基本原理及相关知识基本原理及相关知识基本原理及相关知识n概念概念聚聚 合合 酶酶 链链 反反 应应（polymerase chainreaction，PCR）是是一一种种体体外外扩扩增增特特异异DNA片片断断的的技技术术,能能在在短短时时间间内内获获得得数数百百万万个个特特异异DNA序列的拷贝。序列的拷贝。Kary MullisKary Mullisl
2、 PCRPCR技技术术最最早早由由美美国国CetusCetus公公司司人人类类遗遗传传研研究究室室Kary Kary MullisMullis及及同同事于事于19851985年发现并研制成功的。年发现并研制成功的。lKary Kary MullisMullis因因发发明明了了“聚聚合合酶酶链链式式反反应应”而而获获得得19931993年年度度诺诺贝贝尔尔化学奖。化学奖。相相相相对对对对DNADNA克克克克隆隆隆隆而而而而言言言言，这这这这种种种种方方方方法法法法的的的的特特特特点点点点：操操操操作作作作简便、时间短、特异性高、灵敏度高、实用性强；简便、时间短、特异性高、灵敏度高、实用性强；简便
3、、时间短、特异性高、灵敏度高、实用性强；简便、时间短、特异性高、灵敏度高、实用性强；广广广广泛泛泛泛的的的的应应应应用用用用于于于于医医医医学学学学诊诊诊诊断断断断、分分分分子子子子生生生生物物物物学学学学、分分分分子子子子克隆、基因诊断、法医学、考古学等各个领域。克隆、基因诊断、法医学、考古学等各个领域。克隆、基因诊断、法医学、考古学等各个领域。克隆、基因诊断、法医学、考古学等各个领域。nPCR扩增扩增DNA片段的原理片段的原理 PCRPCR是是是是在在在在模模模模板板板板DNADNA、引引引引物物物物和和和和四四四四种种种种脱脱脱脱氧氧氧氧核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸等等等等存存存存在在在在的
4、的的的情情情情况况况况下下下下，DNADNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶依依依依赖赖赖赖的的的的酶酶酶酶促合成反应，整个扩增过程分三步：促合成反应，整个扩增过程分三步：促合成反应，整个扩增过程分三步：促合成反应，整个扩增过程分三步：变性：加热，模板变性：加热，模板变性：加热，模板变性：加热，模板DNADNA形成两条单链形成两条单链形成两条单链形成两条单链 退火：降温，模板单链退火：降温，模板单链退火：降温，模板单链退火：降温，模板单链DNADNA与引物配对结合与引物配对结合与引物配对结合与引物配对结合 延伸：在延伸：在延伸：在延伸：在DNADNA聚合酶及镁离子等存在的条件下，聚合酶及镁离子等存在的
5、条件下，聚合酶及镁离子等存在的条件下，聚合酶及镁离子等存在的条件下，引物引物引物引物3-3-端向前延伸，合成与模板配对的新链端向前延伸，合成与模板配对的新链端向前延伸，合成与模板配对的新链端向前延伸，合成与模板配对的新链 上述三步为一个循环，经过一个循环上述三步为一个循环，经过一个循环上述三步为一个循环，经过一个循环上述三步为一个循环，经过一个循环DNADNA量增加一倍。新合成的链又可以成为新一轮循量增加一倍。新合成的链又可以成为新一轮循量增加一倍。新合成的链又可以成为新一轮循量增加一倍。新合成的链又可以成为新一轮循环的模板，经过环的模板，经过环的模板，经过环的模板，经过25-3025-30个
6、循环后目的个循环后目的个循环后目的个循环后目的DNADNA就可就可就可就可以扩增以扩增以扩增以扩增10106 6101099倍。倍。倍。倍。通过循环可以提高通过循环可以提高通过循环可以提高通过循环可以提高PCRPCR的特异性。的特异性。的特异性。的特异性。n nPCR反应体系的组成及功能反应体系的组成及功能 一个完整的一个完整的PCRPCR反应体系应包括以下成分：反应体系应包括以下成分：引引引引物物物物：是是预预扩扩增增DNADNA片片段段两两端端的的已已知知序序列列，是是保保证证PCRPCR特特异异性性的的关关键键因因素素，PCRPCR引引物物设设计计的的原原则则：1717；目的是提高扩增的
7、效率与特异性。；目的是提高扩增的效率与特异性。终浓度为终浓度为0.10.5umol/L0.10.5umol/L 引物设计的一般步骤及其原则引物设计的一般步骤及其原则引物设计的一般步骤及其原则引物设计的一般步骤及其原则1.1.1.1.获取目的基因序列，获取目的基因序列，获取目的基因序列，获取目的基因序列，或者或者或者或者 2.2.2.2.采用引物设计软件如采用引物设计软件如采用引物设计软件如采用引物设计软件如Primer premier 5.0Primer premier 5.0Primer premier 5.0Primer premier 5.0、Oligo 6.0Oligo 6.0Olig
8、o 6.0Oligo 6.0获取适合于该目的基因的所有可能的引物集。获取适合于该目的基因的所有可能的引物集。获取适合于该目的基因的所有可能的引物集。获取适合于该目的基因的所有可能的引物集。3.3.3.3.按照下列原则挑选出你认为最合适的引物。按照下列原则挑选出你认为最合适的引物。按照下列原则挑选出你认为最合适的引物。按照下列原则挑选出你认为最合适的引物。4.4.一般评分大于一般评分大于一般评分大于一般评分大于80805.5.扩增产物长度扩增产物长度扩增产物长度扩增产物长度 以以以以200-500bp200-500bp为宜，为宜，为宜，为宜，6.6.G+CG+C的含量在的含量在的含量在的含量在4
9、060%4060%之间，正向引物、反向引物以及内参引物之间，正向引物、反向引物以及内参引物之间，正向引物、反向引物以及内参引物之间，正向引物、反向引物以及内参引物的的的的G+CG+C含量和含量和含量和含量和TmTm值应接近值应接近值应接近值应接近 引物长度一般引物长度一般引物长度一般引物长度一般1827bpATGC1827bpATGC最好随机分布，避免最好随机分布，避免最好随机分布，避免最好随机分布，避免5 5个以上的嘌个以上的嘌个以上的嘌个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。呤或嘧啶核苷酸的成串排列。呤或嘧啶核苷酸的成串排列。呤或嘧啶核苷酸的成串排列。33端第一个碱基尽量不要是端第一个碱基尽量
10、不要是端第一个碱基尽量不要是端第一个碱基尽量不要是A A，也不要出现，也不要出现，也不要出现，也不要出现3 3个以上的连续碱基个以上的连续碱基个以上的连续碱基个以上的连续碱基序列，如序列，如序列，如序列，如GGGGGG等，等，等，等，33端与模板严格配对。端与模板严格配对。端与模板严格配对。端与模板严格配对。尽量减少发夹结构和引物二聚体的形成，特别是在引物的尽量减少发夹结构和引物二聚体的形成，特别是在引物的尽量减少发夹结构和引物二聚体的形成，特别是在引物的尽量减少发夹结构和引物二聚体的形成，特别是在引物的33端端端端Primer5Primer5未端可修饰、突和增加额外碱基（限制性核酸内切酶未端
11、可修饰、突和增加额外碱基（限制性核酸内切酶未端可修饰、突和增加额外碱基（限制性核酸内切酶未端可修饰、突和增加额外碱基（限制性核酸内切酶识别位点），但绝不可以在识别位点），但绝不可以在识别位点），但绝不可以在识别位点），但绝不可以在33端进行这些改造。端进行这些改造。端进行这些改造。端进行这些改造。RT-PCRRT-PCR两引物间序列要跨一个内含子两引物间序列要跨一个内含子两引物间序列要跨一个内含子两引物间序列要跨一个内含子设计好后对引物进行数据库设计好后对引物进行数据库设计好后对引物进行数据库设计好后对引物进行数据库blastblast，应与核酸序列数据库的其它，应与核酸序列数据库的其它，应与
12、核酸序列数据库的其它，应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。序列无明显同源性。序列无明显同源性。序列无明显同源性。Taq DNA Taq DNA聚合酶聚合酶 TaqDNATaqDNA聚聚合合酶酶具具有有5353聚聚合合酶酶活活性性和和5353外外切切酶酶活活性性，而而无无3535外外切切活活性性，它它不不具具有有KlenowKlenow酶酶的的3535校校对对活活性性.因因而而，在在PCRPCR反反应应中中如如发发生生某某些些碱碱基基的的错错配配，该该酶酶是是没没有有校校正正功功能能的的.Taq.Taq DNADNA聚聚合合酶酶的的碱碱基基错错配配机机率率为为2.1102.110-4-4.
13、其其活活性性对对MgMg2+2+浓度非常敏感浓度非常敏感 终浓度一般为：终浓度一般为：2.5u/100ul2.5u/100ul 模板模板模板模板DNADNA 相相相相对对对对于于于于分分分分子子子子克克克克隆隆隆隆、酶酶酶酶切切切切、连连连连接接接接、标标标标记记记记等等等等，PCRPCR对对对对DNADNA模板纯度的要求并不严格。模板纯度的要求并不严格。模板纯度的要求并不严格。模板纯度的要求并不严格。模模模模板板板板用用用用量量量量也也也也是是是是很很很很低低低低的的的的，一一一一般般般般认认认认为为为为10102 210104 4拷拷拷拷贝贝贝贝模模模模板板板板就可以满足要求。就可以满足要
14、求。就可以满足要求。就可以满足要求。dNTPdNTP(dATP dCTP dGTP dTTP)(dATP dCTP dGTP dTTP)(dATP dCTP dGTP dTTP)(dATP dCTP dGTP dTTP)已已已已 有有有有 商商商商 品品品品 化化化化 的的的的 混混混混 合合合合 液液液液，终终终终 浓浓浓浓 度度度度 一一一一 般般般般 为为为为 2020200umol/L200umol/L。yy1010PCRPCR反应反应反应反应bufferbuffer：已作成商品化的产品，它包括：已作成商品化的产品，它包括：已作成商品化的产品，它包括：已作成商品化的产品，它包括：250
15、500mmol/LKCl250500mmol/LKCl；100500mmol/LTris-HCl100500mmol/LTris-HCl（pH8.4pH8.4）；1520mmol/L1520mmol/LMgClMgCl2 2（对对对对TaqTaq酶酶酶酶的的的的活活活活性性性性影影影影响响响响很很很很大大大大，一一一一般般般般浓浓浓浓度度度度为为为为1.51.52.0mmol/L2.0mmol/L，实实实实际际际际应应应应用用用用时时时时根根根根据据据据反反反反应应应应体体体体系系系系的的的的情情情情况况况况进进进进行行行行调调调调整。）；整。）；整。）；整。）；0.1%0.1%明胶或牛血清白
16、蛋白明胶或牛血清白蛋白明胶或牛血清白蛋白明胶或牛血清白蛋白ddH2O调节反应体积调节反应体积液液体体石石蜡蜡油油（PCR仪仪有有热热盖则不用加）盖则不用加）n影响影响PCR的主要因素的主要因素 PCRPCR反应体系的各个组分反应体系的各个组分反应体系的各个组分反应体系的各个组分 PCRPCR循环的温度（预变性、变性、退火、延伸）循环的温度（预变性、变性、退火、延伸）循环的温度（预变性、变性、退火、延伸）循环的温度（预变性、变性、退火、延伸）PCRPCR循环的次数和平台效应循环的次数和平台效应循环的次数和平台效应循环的次数和平台效应 操作环境操作环境操作环境操作环境 平台效应及其原因实验一实验一
17、PCR常用的常用的PCR反应体系：反应体系：10PCR Buffer 5ul上下游引物（上下游引物（25M）2uldNTPs（2.5mM）4ulTaq DNA聚合酶聚合酶 0.5ul（2U）模板模板DNA 0.1至至1ugddH2O 补足体积至补足体积至50ul实验试剂：实验试剂：2PCR Mix:Taq2PCR Mix:Taq酶，四种酶，四种dNTPdNTP，PCRPCR反应反应bufferbuffer引物：上下游特异性引物引物：上下游特异性引物水（水（dd Hdd H2 2O O）：用以补足体积）：用以补足体积基因组基因组DNADNAcDNAcDNA 实验操作及注意事项实验操作及注意事项实
18、验操作及注意事项实验操作及注意事项n 建立建立PCRPCR反应体系反应体系1.1.扩增扩增-actin-actin基因基因 -actin -actin引物引物 2 2 l l cDNA 4 cDNA 4 l l 2PCR Mix 15 2PCR Mix 15 l l 水水 9 9 l l total volume 30 total volume 30 l l 2.2.扩增扩增 HLA-DRB HLA-DRB 基因基因 HLA-DRB HLA-DRB引物引物 2 2 l l 基因组基因组DNA 4 DNA 4 l l 2PCR Mix 15 2PCR Mix 15 l l 水水 9 9 l l
19、total volume 30 total volume 30 l l 此步注意事项此步注意事项此步注意事项此步注意事项：1.每次加样要换每次加样要换Tip头，以防试剂的互相污染头，以防试剂的互相污染2.避免重复避免重复加样加样或漏加样或漏加样。3.加样一定要准确，正确使用微量移液器是关键。加样一定要准确，正确使用微量移液器是关键。4.加完试剂后离心将液体汇集管底。加完试剂后离心将液体汇集管底。5.对没有热盖的对没有热盖的PCR仪要加封石蜡油。仪要加封石蜡油。n扩增扩增-actin-actin基因基因程序的建立程序的建立预变性预变性94 5min变性变性94 45s复性复性59 45s延伸延伸
20、72 1min续延伸续延伸72 10min保存保存43 3 3 30 0 0 0 cycles cycles cycles cyclesn扩增扩增 HLA-DRB HLA-DRB 基因基因程序的建立程序的建立预变性预变性94 5min变性变性94 45s复性复性55 45s延伸延伸72 1min续延伸续延伸72 10min保存保存43 3 3 35 5 5 5 cycles cycles cycles cycles实验二实验二DNA琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测DNA常用常用常用常用DNADNA分析技术分析技术分析技术分析技术定性分析：定性分析：定性分析：定性分析：琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝
21、胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电、聚丙烯酰胺凝胶电、聚丙烯酰胺凝胶电、聚丙烯酰胺凝胶电 泳、泳、泳、泳、southern-blottingsouthern-blotting、芯片技术等、芯片技术等、芯片技术等、芯片技术等定量分析：分光光度法、荧光分光光度法定量分析：分光光度法、荧光分光光度法定量分析：分光光度法、荧光分光光度法定量分析：分光光度法、荧光分光光度法序列分析：末端终止法、化学裂解法序列分析：末端终止法、化学裂解法序列分析：末端终止法、化学裂解法序列分析：末端终止法、化学裂解法一、关于电泳与琼脂糖凝胶电泳一、关于电泳与琼脂糖凝胶电泳 电泳及其基本原理电泳及其基本原
22、理电泳及其基本原理电泳及其基本原理 常用的电泳方法常用的电泳方法常用的电泳方法常用的电泳方法 琼脂糖凝胶电泳的特性及其应用（分琼脂糖凝胶电泳的特性及其应用（分琼脂糖凝胶电泳的特性及其应用（分琼脂糖凝胶电泳的特性及其应用（分离、鉴定和纯化）离、鉴定和纯化）离、鉴定和纯化）离、鉴定和纯化）利用物质的两个差异来分离物质利用物质的两个差异来分离物质利用物质的两个差异来分离物质利用物质的两个差异来分离物质电荷差异电荷差异电荷性质电荷性质 电荷数量电荷数量分子差异分子差异分子大小分子大小 分子形状分子形状二、关于电泳与琼脂糖凝胶电泳二、关于电泳与琼脂糖凝胶电泳电泳及其基本原理电泳及其基本原理电泳及其基本原
23、理电泳及其基本原理 常用的电泳方法常用的电泳方法常用的电泳方法常用的电泳方法 琼脂糖凝胶电泳的特性及其应用（分琼脂糖凝胶电泳的特性及其应用（分琼脂糖凝胶电泳的特性及其应用（分琼脂糖凝胶电泳的特性及其应用（分离、鉴定和纯化）离、鉴定和纯化）离、鉴定和纯化）离、鉴定和纯化）三、三、DNA琼脂糖凝胶电泳原理琼脂糖凝胶电泳原理 在在pH8.0pH8.0（碱碱性性）的的环环境境中中DNADNA的的磷磷酸酸基基团团解解离离，使使DNADNA在在该该环环境境中中带带上上负负电电荷荷，在在电电场场中中向向正正极极方方向向泳泳动动，因因为为各各种种DNADNA分分子子的的电电荷荷数数、构构象象、分分子子量量不不
24、同同，它它们们在在通通过过凝凝胶胶立立体体网网络络是是所所受受的的动动力力和和阻阻力力不不同同，所所以以泳泳动动的的速速度度有有差差异异，达达到到分分离离的目的。的目的。四、四、DNA琼脂糖凝胶电泳实验操作琼脂糖凝胶电泳实验操作n 实验目的及意义实验目的及意义实验目的及意义实验目的及意义1.1.-actin-actin基因扩增基因扩增基因扩增基因扩增产物的鉴定产物的鉴定产物的鉴定产物的鉴定2.2.掌握掌握掌握掌握DNADNA琼脂糖凝胶电泳实验方法琼脂糖凝胶电泳实验方法琼脂糖凝胶电泳实验方法琼脂糖凝胶电泳实验方法n实验材料及试剂实验材料及试剂实验材料及试剂实验材料及试剂 材料：材料：材料：材料：
25、-actin-actin基因基因基因基因扩增扩增扩增扩增产物产物产物产物 试剂：试剂：试剂：试剂：1%1%琼脂糖琼脂糖琼脂糖琼脂糖凝胶凝胶凝胶凝胶（配制配制配制配制方法方法方法方法）电泳缓冲液：电泳缓冲液：电泳缓冲液：电泳缓冲液：11 TAETAE（1010 上样缓冲液：溴酚蓝、二甲苯青、甘油上样缓冲液：溴酚蓝、二甲苯青、甘油上样缓冲液：溴酚蓝、二甲苯青、甘油上样缓冲液：溴酚蓝、二甲苯青、甘油）溴化乙锭溴化乙锭溴化乙锭溴化乙锭（其它荧光染料如花青类染料（其它荧光染料如花青类染料（其它荧光染料如花青类染料（其它荧光染料如花青类染料SYBRGreenISYBRGreenI及及及及GoldViewG
26、oldView等）等）等）等）琼脂糖凝胶板的制备（凝固后拔梳）琼脂糖凝胶板的制备（凝固后拔梳）琼脂糖凝胶板的放置（加样孔在负极）琼脂糖凝胶板的放置（加样孔在负极）-actin-actin 扩增产物扩增产物10ul10ul2ul2ul上样缓冲液上样缓冲液(每块胶留一孔加每块胶留一孔加Maker10ul)Maker10ul)，电泳（，电泳（100V,100V,约约1h1h）紫外检测紫外检测n实验操作及注意事项实验操作及注意事项实验操作及注意事项实验操作及注意事项 50bp100bp200bp300bp400bp实验三实验三PCR产物产物SSCPPAGE分析分析nSSCP-PAGE原理 单链单链DN
27、ADNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而在电场中迁移率不同，在聚丙烯酰胺凝胶中分子二级结构而在电场中迁移率不同，在聚丙烯酰胺凝胶中分子筛效应不同。通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳筛效应不同。通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)(PAGE)，可以，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开，为非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开，为DNADNA单链构象单链构象多态性多态性(Single-Strand Conformation polymo
28、rphism(Single-Strand Conformation polymorphism，SSCP)SSCP)分析分析.SSCP-PAGESSCP-PAGE检查检查PCRPCR扩增产物的基因突变十分广泛。扩增产物的基因突变十分广泛。SSCP-PAGE特点 1 1DNADNA长度为长度为150150-300bp(300bp(本实验中本实验中HLA-DRHLA-DRB B扩增片断扩增片断为为227bp)227bp)突变体检出效率最高。突变体检出效率最高。2 2理论上理论上讲讲SSCPSSCP能够能够100%100%的检测出突变体。的检测出突变体。(70(7080%)80%)3.3.要最后确定突
29、变的位置和类型，还需进一步测序要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序 PCR-SSCP基本过程 1 1PCRPCR扩增靶扩增靶DNADNA。2 2PCRPCR产物的快速变性而后快速复性，形成特定产物的快速变性而后快速复性，形成特定 空间结构的空间结构的DNADNA单链分子。单链分子。3.3.非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳（非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEPAGE）4.4.PAGEPAGE胶的银染胶的银染n PCR-SSCP结果判定 单链单链DNADNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，存在碱基突变判定该链构象发生改变，存在
30、碱基突变.有时正常链与突变链的迁移率很接近，很难有时正常链与突变链的迁移率很接近，很难 看出两者之看出两者之间的差别间的差别,因此一般要求电泳长度在因此一般要求电泳长度在16-18cm16-18cm以上以上.以检测限为指标来判以检测限为指标来判,检测限是指突变检测限是指突变DNADNA片段与正常片段与正常DNADNA片段可分辨的电泳距离差的最小值片段可分辨的电泳距离差的最小值,一般检测限定为一般检测限定为3mm3mm。大于检测限则判定链的迁移率有改变，说明该。大于检测限则判定链的迁移率有改变，说明该DNADNA序列有变化。序列有变化。nSSCP-PAGE应用 在遗传学方面的有广泛的应用，在遗传
31、学方面的有广泛的应用，例如，癌基因或抑癌基因的基因突变的筛查，例如，癌基因或抑癌基因的基因突变的筛查，遗传病的致病基因的突变筛查和基因诊断，遗传病的致病基因的突变筛查和基因诊断，法医的亲子鉴定和个体识别。法医的亲子鉴定和个体识别。人类白细胞抗原系统人类白细胞抗原系统人类白细胞抗原系统人类白细胞抗原系统(HLA)(HLA)(HLA)(HLA)，存在多，存在多，存在多，存在多态性：态性：态性：态性：器官移植配型器官移植配型器官移植配型器官移植配型 疾病发生有关疾病发生有关疾病发生有关疾病发生有关 个体鉴定个体鉴定个体鉴定个体鉴定 亲子鉴定亲子鉴定亲子鉴定亲子鉴定PCR-SSCP检测HLA-DRB用
32、于亲子鉴定(通用引物扩增HLA-DRB及其7个假性基因)n实验材料及试剂实验材料及试剂实验材料及试剂实验材料及试剂 材料：材料：材料：材料：人人人人HLA-DRHLA-DR的的的的PCRPCR产物产物产物产物 试剂及其功能：试剂及其功能：试剂及其功能：试剂及其功能：丙烯酰胺混合液：丙烯酰胺混合液：丙烯酰胺混合液：丙烯酰胺混合液：30%(Acr:Bis,29:1)30%(Acr:Bis,29:1)10%AP(10%AP(新鲜配制新鲜配制新鲜配制新鲜配制)TEMED(TEMED(四甲基乙二胺四甲基乙二胺四甲基乙二胺四甲基乙二胺)55 TBETBE缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液变性上样液：变性上样液：变性
33、上样液：变性上样液：95%95%甲酰胺，指示剂，甲酰胺，指示剂，甲酰胺，指示剂，甲酰胺，指示剂，EDTAEDTA玻璃板的组装和封边，电泳槽及电泳玻璃板的固定玻璃板的组装和封边，电泳槽及电泳玻璃板的固定（已准备已准备）8%非变性非变性PAGE胶胶的的制胶：制胶：30%丙烯酰胺混合液丙烯酰胺混合液8mldH2O15.7ml5 TBE6ml10%AP280 lTEMED20 l用吸管用吸管迅速迅速将配好的将配好的PAGE胶灌满电泳玻璃板的空隙胶灌满电泳玻璃板的空隙n实验操作及注意事项实验操作及注意事项实验操作及注意事项实验操作及注意事项 立即立即插入点样梳（不要带进气泡），等待胶聚合（约插入点样梳（
34、不要带进气泡），等待胶聚合（约30min1h）多余的胶留置烧杯，观察聚合情况，用以判断玻璃板中是否多余的胶留置烧杯，观察聚合情况，用以判断玻璃板中是否聚合聚合待胶凝聚后，小心拔梳，用电泳缓冲液冲洗上样孔待胶凝聚后，小心拔梳，用电泳缓冲液冲洗上样孔取取10ulHLA-DRB扩增产物与扩增产物与10ul甲酰胺甲酰胺变性液在变性液在0.2mlEp管中混匀。管中混匀。上样前上样前98加热加热10min，后，后立即冰浴骤冷立即冰浴骤冷取取10 l变性处理样品上样（速度要快），变性处理样品上样（速度要快），100V电泳电泳34h银染银染实验实验四四聚丙烯酰胺凝胶中聚丙烯酰胺凝胶中DNA的银染的银染n 原理
35、 在弱酸环境下银离子可以与在弱酸环境下银离子可以与DNADNA结合，碱性甲结合，碱性甲醛溶液可以将结合的银离子还原成金属银，显影成醛溶液可以将结合的银离子还原成金属银，显影成DNADNA区带。区带。n实验材料及试剂实验材料及试剂实验材料及试剂实验材料及试剂材料：材料：材料：材料：DNADNA非变性非变性非变性非变性PAGEPAGE胶胶胶胶试剂及其功能：试剂及其功能：试剂及其功能：试剂及其功能：10%10%乙醇乙醇乙醇乙醇1 1%硝酸硝酸硝酸硝酸0.2%0.2%硝酸银硝酸银硝酸银硝酸银显色液（显色液（显色液（显色液（3 3%NaNa2 2COCO3 3，1%1%甲醛，新鲜配制）甲醛，新鲜配制）甲
36、醛，新鲜配制）甲醛，新鲜配制）3%3%乙酸乙酸乙酸乙酸电泳完毕后，撬开玻璃板，将粘有凝胶的玻璃板置于塑料盘电泳完毕后，撬开玻璃板，将粘有凝胶的玻璃板置于塑料盘（不要碰凝胶表面！）（不要碰凝胶表面！）用蒸馏水漂洗两次，并取出玻璃板用蒸馏水漂洗两次，并取出玻璃板去水后，用去水后，用10%乙醇进行凝胶固定乙醇进行凝胶固定10min，轻摇，轻摇去乙醇，水洗、加入去乙醇，水洗、加入1%硝酸，轻摇硝酸，轻摇5min吸出硝酸，用蒸馏水漂洗吸出硝酸，用蒸馏水漂洗2次次n实验操作及注意事项实验操作及注意事项实验操作及注意事项实验操作及注意事项（下列加液量以刚好覆盖凝胶为宜）（下列加液量以刚好覆盖凝胶为宜）加入加
37、入0.2%硝酸银溶液，轻摇硝酸银溶液，轻摇20min蒸馏水漂洗蒸馏水漂洗3次次去水后，加入显色液，在非直射光线下观察显色去水后，加入显色液，在非直射光线下观察显色观察区带出现，效果最佳时移除显色液观察区带出现，效果最佳时移除显色液加入加入3%乙酸，轻摇乙酸，轻摇5min移除移除3%的乙酸溶液，的乙酸溶液，10%乙醇洗涤乙醇洗涤1次次观察结果观察结果结果分析与问题讨论结果分析与问题讨论 SSCP-PAGESSCP-PAGE影响因素影响因素 1 1用于分析的核酸片段越小，敏感性越高，一用于分析的核酸片段越小，敏感性越高，一 般般 150 150-300bp300bp 2 2游离的引物可与游离的引物可与PCRPCR产物结合影响其泳动产物结合影响其泳动 3.3.保持胶内温度恒定保持胶内温度恒定可保证可保证SSCPSSCP结果的稳定结果的稳定 4.4.凝胶的长度凝胶的长度:一般凝胶板长度在一般凝胶板长度在40cm40cm以上以上 6.6.关于对照的设置。判断突变时一定要有阳性对照。假关于对照的设置。判断突变时一定要有阳性对照。假 阴性结果是阴性结果是SSCPSSCP的主要缺点的主要缺点 7.7.结果分析：结果至少显示结果分析：结果至少显示3 3条带，甚至可以出现更多条条带，甚至可以出现更多条 带（一种带（一种DNADNA单链有时可形成两种或多种构象）单链有时可形成两种或多种构象）。