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1、大肠菌群大肠菌群Coliform bacteria1.1.概念及卫生学意义概念及卫生学意义o1.11.1概念概念o大肠菌群系指一群能在36 24小时内发酵乳糖产酸产气，需氧、兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。包括肠杆菌科中4种常见的细菌：o埃希氏菌属、o柠檬酸杆菌属、o克雷伯氏菌属o肠杆菌属（实际上还包括产气肠杆菌）o所以，大肠菌群是作为卫生指标而选择的一类细菌。1.2 1.2 卫生学意义卫生学意义o肠道传染病的传播，主要是通过粪便污染水及食品或其他物品来实现，但从这些样品中直接检查病源菌是非常困难的，也是难以做到的，主要有以下原因：1.2 1.2 卫生学意义卫生学意义o病原菌在粪便中含量较多，
2、但经过污染物品（食品和水等）的稀释，一般难以检出。o粪便中的非病原菌数量比病原菌数量大得多，即使采用强抑制性选择培养基，也无法与数量占绝对优势的非病原菌相竞争，势必影响病原菌的发育和增殖。o肠道病原菌种类较多，生物学性状也不尽相同，不可能全面检验，加之检验方法较为繁琐，设备及技术要求较高，难以普遍推广。1.2 1.2 卫生学意义卫生学意义o理想的粪便污染的指标菌，应具备下列条件：o（1）是人类肠道细菌丛的组成部分，在数量上占优势；o（2）排出体外后，在外界环境影响下，其存活时间应与肠道致病菌大致相似或稍长；o（3）检验方法简便，易于检出与计数；o（4）如用作饮用水时，对氯消毒的抵抗力应不低于肠
3、道致病菌，而且进入水中不再繁殖。1.2 1.2 卫生学意义卫生学意义o在卫生细菌学检验中，可以作为粪便污染指标菌的有三类细菌：即大肠菌群、粪链球菌和产气荚膜梭菌。o大肠菌群：o 数量最多；o 存活时间与肠道主要病原菌大致相似；o 检验方法简单易行。o故大肠菌群作为粪便污染指标菌较为适宜。1.2 1.2 卫生学意义卫生学意义o在大肠菌群中，大肠埃希氏菌是人、畜肠道内的优势菌类，另外三种只占少数。但值得注意的是在腹泻患者的粪便中，肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等也是大量存在的，因此，它们也具有同样的卫生学意义。1.2 1.2 卫生学意义卫生学意义o大肠菌群中4种细菌生长的适宜温度不相同。o夏季（气温3
4、033）：优势菌是大肠埃希氏菌；o冬季（气温710）：阴沟肠杆菌；o秋季（气温2023）：大肠埃希氏菌、阴沟肠杆菌两者数量相近。1.2 1.2 卫生学意义卫生学意义o通常可根据水中大肠菌群的数量来判断水源是否被粪便所污染，并可间接推测受肠道病原菌污染的可能性。o大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可
5、以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。2 2大肠菌群检验方法大肠菌群检验方法oGB/T 4789.3-2003GB/T 4789.3-2003（多管发酵法）（多管发酵法）oGB/T 4789.3-2008GB/T 4789.3-2008（多管发酵法）（多管发酵法）o纸片法纸片法多管发酵法o应用范围 各类食品中大肠菌群的测定。o原理 根据总大肠菌群应具有的生物特性，如革兰氏阴性无芽胞杆菌，在36，24小时内能发酵乳糖产酸产气，并在选择性培养基上产生典型菌落仪器o高压蒸汽灭菌器o恒温培养箱o显微镜o试管、平皿（直径9cm）、刻
6、度吸管等。检验程序检验程序361 24 2h 培养检样稀释乳糖胆盐发酵管检验程序检验程序伊红美蓝琼脂（EMB）培养基361，1824h 培养产酸产气报告大肠菌群阴性不产气不产气检验程序检验程序革兰氏阳性革兰氏阳性革兰氏染色革兰氏染色大肠菌群阴性大肠菌群阴性查查MPN表表乳糖发酵管乳糖发酵管 361，2422h产酸产气产酸产气不产酸不产气不产酸不产气大肠菌群阳性大肠菌群阳性大肠菌群阴性大肠菌群阴性报告报告报告报告革兰氏阴性革兰氏阴性无芽胞杆菌无芽胞杆菌挑取可疑菌落挑取可疑菌落报告报告查查MPN表表查查MPN表表检验步骤检验步骤o发酵法采样 食（饮具抽检碗、盘、口杯，将2.0cm2.5cm（5cm
7、2）灭菌滤纸片紧贴内面各10张（总面积50cm2）、碟、匙、酒杯以每5件为1份，每件内面紧贴灭菌滤纸片各2张（总面积50cm2/份），经1min，按序取置入50mL灭菌盐水试管中，充分振荡后，制成原液。筷：取每双的下段12cm处约50cm2（12cm 2cm 2cm），置入50mL灭菌盐水试管中，充分振荡20次，制成原液。检验步骤检验步骤n用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水或其它稀释液的试管内，振摇混匀，制成1：100的稀释液。n另取1mL灭菌吸管，按上项操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌吸管。n根据食品卫生标准要求或对检样污染情况
8、的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。检验步骤检验步骤o乳糖发酵（初发酵）：乳糖发酵（初发酵）：o 分离培养：分离培养：紫黑色有金属光泽菌落，紫黑色有金属光泽菌落，G-杆菌杆菌 粉红色和红色菌落粉红色和红色菌落检验步骤检验步骤o证实试验：乳糖发酵管发酵证实试验：乳糖发酵管发酵o结果报告结果报告 根据证实为总大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL（g）样品中总大肠菌群的MPN值。伊红美蓝琼脂伊红美蓝琼脂(EMB)(EMB)o制法：o将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正pH，分装于烧瓶内，121高压灭菌15min备用。临用时加入乳糖并加热溶化琼脂，冷却至5055，加入伊红
9、和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。3.23.2伊红美蓝琼脂伊红美蓝琼脂(EMB)(EMB)o质控：此培养基呈紫色，可有细微沉淀。质控菌株接种后，35 培养1824小时，观察结果应如下表：伊红美蓝琼脂伊红美蓝琼脂(EMB)(EMB)菌 株 菌 号 生长情况 菌落颜色 产气肠杆菌 ATCC 13048 好 粉红，无光泽 大肠埃希氏菌 ATCC 25922 好，极好 有紫绿金属光泽，黑心 肺炎克雷伯氏菌 ATCC 13883 好 绿金属光泽，有黑心 伊红美蓝琼脂伊红美蓝琼脂(EMB)(EMB)菌 株 菌 号 生长情况 菌落颜色奇异变形杆菌 ATCC 25933 好，极好 无色 鼠伤寒沙门氏菌 ATCC 1
10、4028 好，极好 无色 金黄色葡萄球菌 ATCC 25923 被抑制 伊红美蓝琼脂伊红美蓝琼脂(EMB)(EMB)o说明：o（1）本培养基为弱选择性，Difco手册第十版将配方中10g乳糖改为5g乳糖和5g蔗糖，认为效果更佳。o（2）伊红-Y又称曙红或四溴萤光素(CO2H8O5Br),为酸性染料。美蓝又称亚甲蓝(CH3)2N2C12H6NS(OH)，为碱性染料。当大肠杆菌分解乳糖产酸时，细菌带正电荷，染上红色，再与美蓝结合而形成紫黑色菌落，并有绿色金属光泽。二者除了作为指示剂外，还有抑制革兰氏阳性菌的作用。伊红美蓝琼脂伊红美蓝琼脂(EMB)(EMB)说明：（3）在碱性环境中，不分解乳糖产酸的
11、细菌不着色。伊红、美蓝不能结合，故沙门氏菌和志贺氏菌等为无色或琥珀色半透明菌落。（4）此培养基原为Levine氏设计，用于鉴别大肠杆菌和产气杆菌，并可快速鉴定白色念珠菌及凝固酶阳性葡萄球菌。美国公共卫生协会和美国细菌学会推荐，用于增殖或鉴别大肠杆菌的检查。但某些沙门氏菌、志贺氏菌可被抑制。培养基保存注意避光防止氧化。3.培养基培养基 3.1乳糖胆盐培养基：o成分：蛋白胨 20g猪胆盐 5g乳糖 10g 0.04%溴甲酚紫 25mL蒸馏水 1000mL pH 7.4 分装每管10mL，并放入一个小倒管，11515min高压灭菌。3.2 伊红美蓝琼脂o成分：蛋白胨 10g 乳糖 10g 磷酸氢二钾
12、 2g 琼脂 17g，2伊红Y溶液 20mL，0.65美蓝溶液 10mL，蒸馏水 1000mL，pH7.13.3乳糖发酵培养基：o成分：蛋白胨 20g 乳糖 10g 0.04%溴甲酚紫水溶液 25mL，蒸馏水1000mLpH7.4检验步骤检验步骤o纸片法采样纸片法采样 随机抽取消毒后准备使用的各类食具（碗、盘、杯等），取样量可根据大、中、小不同饮食行业，每次采样610件，每件贴纸片两张，每张纸面积25cm2，（5cm 5cm),用无菌生理盐水湿润大肠菌群检测纸片后，立即贴于食具内侧表面，30s后取下，置于无菌塑料袋内。筷子：以5只为一件样品，用毛细吸管取无菌生理盐水湿润纸片后，立即将筷子进口端（约5cm）摸拭纸片，每件样品摸拭两张，放入无菌塑料袋内。检验步骤检验步骤o检验（纸片法）检验（纸片法）将已采样的纸片置37 培养16 18小时。o结果判断（纸片法）结果判断（纸片法）若纸片保持紫蓝色不变为大肠菌群阴性，纸片变黄并在黄色背景上呈现红色斑点或片状红晕为阳性。