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1、 本课题学习目标本课题学习目标 体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。物大分子的基本原理。1 1 1 1、主要概念：、主要概念：、主要概念：、主要概念：凝胶色谱法凝胶色谱法 电泳法电泳法 缓冲溶液缓冲溶液 它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。2.2.主要原理：主要原理：主要原理：主要原理：凝胶色谱法分离蛋白质的原理凝胶色谱法分离蛋白质的原理 电泳法分离样品的原理电泳法分离样品的原理 缓冲溶液的组成和作用机理缓冲溶液的组
2、成和作用机理 本课题学习重点和难点本课题学习重点和难点 体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。物大分子的基本原理。3 3、课题重点：、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法凝胶色谱法的原理和方法 4 4、课题难点：课题难点：样品的预处理样品的预处理 色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。2003200320032003年年年年4 4 4 4月月月月14141414日宣布人类基因组序列图完成，这日宣布人类基因组序列图完成，这日宣布人类基因组序列
3、图完成，这日宣布人类基因组序列图完成，这标志着进入了后基因组和蛋白质组时代标志着进入了后基因组和蛋白质组时代标志着进入了后基因组和蛋白质组时代标志着进入了后基因组和蛋白质组时代人类基因组：人类基因组：人类基因组：人类基因组：指指指指DNADNADNADNA分子所携带的全部遗传信息分子所携带的全部遗传信息分子所携带的全部遗传信息分子所携带的全部遗传信息 蛋白质组：蛋白质组：蛋白质组：蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是对蛋白质功能的研究。是对蛋白质功能的研究。是对蛋白质功能的研
4、究。是对蛋白质功能的研究。血血血血液液液液血浆血浆血浆血浆水水水水 分分分分固体物质：固体物质：固体物质：固体物质：血浆蛋白、血浆蛋白、血浆蛋白、血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等血细血细血细血细 胞胞胞胞白细胞白细胞白细胞白细胞血小板血小板血小板血小板红细胞红细胞红细胞红细胞（最多）（最多）（最多）（最多）血红蛋白血红蛋白血红蛋白血红蛋白（90909090）两个两个两个两个肽链肽链肽链肽链两个两个两个两个一肽链一肽链一肽链一肽链四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团2.2.提问：提问：提问：提问：血液有
5、哪些成分？血液有哪些成分？血液有哪些成分？血液有哪些成分？1.1.1.1.提问：提问：提问：提问：用鸡的红细胞提取用鸡的红细胞提取用鸡的红细胞提取用鸡的红细胞提取DNADNADNADNA，用猪、牛、羊的，用猪、牛、羊的，用猪、牛、羊的，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？红细胞提取血红蛋白的原因是什么？红细胞提取血红蛋白的原因是什么？红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有DNADNADNADNA，便于进行，便于进行，便于进行，便于进行DNADNADNADNA的提取；人的红细胞无细胞核，结
6、构简单，血红蛋的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。白含量丰富，便于提取血红蛋白。白含量丰富，便于提取血红蛋白。白含量丰富，便于提取血红蛋白。血血血血红红红红蛋白蛋白蛋白蛋白血红蛋白血红蛋白血红蛋白血红蛋白两个两个两个两个肽链肽链肽链肽链两个两个两个两个一肽链一肽链一肽链一肽链四个亚铁四个亚铁四个亚铁四个亚铁血血红素基团红素基团红素基团红素基团每个肽链环绕一个每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，亚铁血红素基团，此基团可携带此基团可携带一分子氧或一分子二一分子氧或一分子二氧化碳
7、，氧化碳，血红蛋白因含有血红蛋白因含有血红素血红素而而呈呈红色。红色。血红蛋白的特点：血红蛋白的特点：血红蛋白的特点：血红蛋白的特点：1.1.分离生物大分子的基本思路：分离生物大分子的基本思路：选用一定的选用一定的物理或化学物理或化学的方法分离具有不同物的方法分离具有不同物理或化学性质的理或化学性质的生物大分子生物大分子。2.2.蛋白质分离和提取的原理：蛋白质分离和提取的原理：根据蛋白质根据蛋白质各种特性各种特性的差异，如的差异，如分子的形状和分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力和对其他分子的亲和力等等，可以用
8、来分离等等，可以用来分离不同种不同种类类的蛋白质。的蛋白质。一、血红蛋白的提取和分离一、血红蛋白的提取和分离3.3.高温灭菌和酒精灭菌的结果：高温灭菌和酒精灭菌的结果：使微生物的使微生物的蛋白质发生蛋白质发生变性变性、蛋白质的蛋白质的空间结构空间结构被被破坏。破坏。（一）（一）凝胶色谱法（凝胶色谱法（分配色谱法分配色谱法）2.凝胶：大多数凝胶是由大多数凝胶是由多糖类化合物多糖类化合物（如（如葡聚糖或葡聚糖或琼脂糖琼脂糖）构成的）构成的多孔多孔小球体，小球体，内部有许多贯穿的内部有许多贯穿的通道通道。根据被分离物质的蛋白质根据被分离物质的蛋白质相对分子质量相对分子质量的大的大 小，利用具有小，利
9、用具有网状结构网状结构的凝胶，来进行分离。的凝胶，来进行分离。1.概念：3.凝胶色谱法的原理 当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢移动速度较慢;而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。离。依据的特性是：依据的特性是：
10、依据的特性是：依据的特性是：蛋白质分子量的大小。蛋白质分子量的大小。蛋白质分子量的大小。蛋白质分子量的大小。4.4.凝胶色谱法分离蛋白质分离蛋白质的原理和具体过程具体过程凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示 （二）缓冲溶液（二）缓冲溶液 1.1.概念概念:在一定的范围内，凡是能够抵制在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强外加少量强酸或强碱酸或强碱的影响使原来溶液的影响使原来溶液PHPH值基本保持值基本保持不变的混不变的混合溶液。合溶液。能够抵制能够抵制外界的酸和碱外界的酸和碱对溶液对溶液PHPH值值的影响，的影响，维持维持PHPH基本不变。基本不变。2.2.作用
11、作用:3.3.缓冲溶液的配制缓冲溶液的配制:通常由通常由1 12 2 种缓冲剂种缓冲剂溶解于水溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的中配制而成。调节缓冲剂的使用比例使用比例就可以制得在就可以制得在不不同同PHPH范围内范围内使用的缓冲液。使用的缓冲液。4.4.4.4.提问：在本课题中使用的缓冲液是提问：在本课题中使用的缓冲液是提问：在本课题中使用的缓冲液是提问：在本课题中使用的缓冲液是:_:_:_:_,其目的是其目的是其目的是其目的是:利用缓冲液模拟细胞内的利用缓冲液模拟细胞内的PHPH环境，保证环境，保证 血红蛋白的正常结构和功能，便于观察血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色红色红色红色)和科
12、和科 学研究学研究(活性活性活性活性)磷酸缓冲液磷酸缓冲液 缓冲溶液的组成及分类缓冲溶液的组成及分类弱酸及其对应的盐：弱酸及其对应的盐：弱碱及其对应的盐：弱碱及其对应的盐：多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐:H H H H2 2 2 2COCOCOCO3 3 3 3NaHCONaHCONaHCONaHCO3 3 3 3；CHCHCHCH3 3 3 3COOHCHCOOHCHCOOHCHCOOHCH3 3 3 3COONaCOONaCOONaCOONaNHNHNHNH3 3 3 3 H H H H2 2 2 2ONHONHONHONH4 4 4 4CL;NHCL;N
13、HCL;NHCL;NH4 4 4 4OHNHOHNHOHNHOHNH4 4 4 4CLCLCLCLNaHCONaHCONaHCONaHCO3 3 3 3NaNaNaNa2 2 2 2COCOCOCO3 3 3 3 ；NaHNaHNaHNaH2 2 2 2POPOPOPO4 4 4 4NaNaNaNa2 2 2 2HPOHPOHPOHPO4 4 4 4 缓冲溶液由足够浓度的共轭酸碱对组成。其中，缓冲溶液由足够浓度的共轭酸碱对组成。其中，能对抗外来强碱的称为能对抗外来强碱的称为共轭酸共轭酸；能对抗外来强酸的称为能对抗外来强酸的称为共轭碱共轭碱。这一共轭酸碱通常称为这一共轭酸碱通常称为缓冲对、缓冲剂
14、或缓冲系缓冲对、缓冲剂或缓冲系。常见的缓冲对主要有如下三种类型：常见的缓冲对主要有如下三种类型：（三）（三）电泳：电泳：1.1.概念：概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.2.原理：原理：许多重要的生物大分子，如多肽、许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的核酸等都具有可解离的基团，在一定的PHPH下，这下，这些基团会带上正电或负电。些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性电泳利用了待
15、分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离各种分子的分离。3.3.类型类型:琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。在在在在电场电场电场电场的作用下，的作用下，的作用下，的作用下，这这这这些些些些带电带电带电带电分子分子分子分子会会会会向着向着向着向着与与与与其所其所其所其所带电带电带电带电荷相反的荷相反的荷相反的荷相反的电电电电极极极极移移移移动动动动琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝
16、胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 1、在测定蛋白质分子量时常用、在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸十二烷基硫酸钠（钠（SDSSDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,NN,N-亚甲基双丙亚甲基双丙烯酰胺在烯酰胺在引发剂引发剂和和催化剂催化剂的作用下聚合交联成的的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。具有三维网状结构的凝胶。N,N-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）丙烯酰胺和交联剂丙烯酰胺和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应亚甲基双
17、丙烯酰胺的交联共聚反应 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率迁移率取决取决于它所带于它所带净电荷净电荷的多少以及的多少以及分子的大小分子的大小等因素。等因素。（SDSSDSSDSSDS的作用）的作用）的作用）的作用）为了消除为了消除净电荷对迁移率的影响，净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入可以在凝胶中加入SDSSDS。2.2.原理：原理：SDSSDSSDSSDS能使蛋白质发生完全变性能使蛋白质发生完全变性能使蛋白质发生完全变性能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成。由几条肽链组成的的蛋白质复合体蛋白质复合体在在SDSSDS的作用下会的作用下会解聚成单条肽链解聚成单条肽链
18、解聚成单条肽链解聚成单条肽链，因此测定的结果只是因此测定的结果只是单条肽链的分子量单条肽链的分子量单条肽链的分子量单条肽链的分子量。SDSSDS能与各能与各种蛋白质形成种蛋白质形成蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质SDSSDSSDSSDS复合物复合物复合物复合物，SDSSDS所带负电荷所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量原有的电荷量原有的电荷量原有的电荷量。因而掩。因而掩盖了盖了不同种不同种不同种不同种蛋白质间的蛋白质间的蛋白质间的蛋白质间的电荷差别电荷差别电荷差别电荷差别，使电泳迁移率完，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。全取决于分子的大小。3.SDS3.SDS作用机
19、理作用机理:用用SDSSDS测定蛋白质分子量的方法测定蛋白质分子量的方法 使用使用SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋测定蛋白质的分子量时，可选用一组白质的分子量时，可选用一组已知分子量已知分子量的标准蛋白的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的量的标准蛋白的电泳区带位置电泳区带位置，用，用电泳迁电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线移率和分子量的对数作标准曲线，可以测，可以测定定未知蛋白质未知蛋白质的分子量。的分子量。市场上有高分子市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。剂出售。二、实验操
20、作二、实验操作样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定1.1.1.1.样品处理：样品处理：样品处理：样品处理：（一）蛋白质提取和分离步骤（一）蛋白质提取和分离步骤（二）操作过程（二）操作过程 本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎 动物的血液来分离血红蛋白。动物的血液来分离血红蛋白。(1)(1)(1)(1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤红细胞的洗涤红细胞的洗涤:洗涤目的洗涤目的洗涤目的洗涤目的:去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，洗涤次数不可过少。分离纯化，洗涤次数不可过少。洗涤操作：洗涤操作：洗涤操作：洗涤操作：1 1、采
21、集血样。、采集血样。2 2、低速短时间离心、低速短时间离心（速（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果），达不到分离的效果）3 3、吸取血浆：上层透明的黄色、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。血浆。4 4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.90.9的的氯化钠溶液洗涤。氯化钠溶液洗涤。5 5、低速离心、低速离心（低速短时间）（低速短时间）6 6、重复、重复4 4、5 5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。净。采集得到血液柜式离心机初
22、次离心后的结果3次洗涤后的结果(2)(2)(2)(2)血红蛋白的释放：血红蛋白的释放：血红蛋白的释放：血红蛋白的释放：加蒸馏水到加蒸馏水到原血液体积原血液体积，再加，再加4040体积的体积的甲苯甲苯 ，置于，置于磁力搅拌器磁力搅拌器上充分搅拌上充分搅拌1010分分钟（钟（加速细胞破裂加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。细胞破裂释放出血红蛋白。(3)(3)(3)(3)分离血红蛋白溶液：分离血红蛋白溶液：分离血红蛋白溶液：分离血红蛋白溶液：过程：过程：过程：过程：将搅拌好混合液转移到离将搅拌好混合液转移到离心管内，以心管内，以2000r/min2000r/min的速度离心的速度离心10 10
23、minmin。试管中溶液层次：试管中溶液层次：试管中溶液层次：试管中溶液层次：第第1 1层（最上层（最上层）：甲苯层（层）：甲苯层（无色透明无色透明）；第）；第2 2层层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色白色薄层固体薄层固体）；第）；第3 3层（中下层）：血红层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（蛋白的水溶液层（红色透明液体红色透明液体）；第）；第4 4层（最下层）：杂质沉淀层（层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色暗红色）。）。分离：分离：分离：分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的
24、层的红色透明液体红色透明液体。二、实验操作二、实验操作磁力搅拌器搅拌器转子搅拌器正在工作甲苯层甲苯层甲苯层甲苯层（无色透明无色透明无色透明无色透明）白色薄层固体白色薄层固体白色薄层固体白色薄层固体红色透明液体红色透明液体红色透明液体红色透明液体杂质沉淀层杂质沉淀层杂质沉淀层杂质沉淀层（暗红色暗红色暗红色暗红色）试管中溶液层次试管中溶液层次(4)(4)(4)(4)透透透透 析：析：析：析：过程：过程：过程：过程：取取1ml1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有透析袋放入盛有300ml300ml的物质的量浓度为的物质的量浓度为20mmol/l20mmol/
25、l的的磷酸缓冲液磷酸缓冲液中（中（pHpH为为7.07.0），透析），透析1212小时。小时。透析目的：透析目的：透析目的：透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。除去样品中分子量较小的杂质。二、实验操作二、实验操作透析过程动画演示透析过程动画演示利用透析袋透析2.2.凝胶色谱操作凝胶色谱操作:（1 1 1 1）凝胶色谱柱的制作：）凝胶色谱柱的制作：）凝胶色谱柱的制作：）凝胶色谱柱的制作：取长取长4040厘米，内径厘米，内径1.61.6厘米的玻璃管，厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨两端需用砂纸磨平。平。底塞的制作：底塞的制作：打孔打孔挖出凹穴挖出凹穴安装移液管头部安装移液管头部覆盖覆盖尼龙网，再用尼
26、龙网，再用100100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事注意事注意事注意事项项项项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。顶塞的制作：顶塞的制作：打孔打孔安装玻璃管安装玻璃管。组装：组装：将上述三者按相将上述三者按相应位置组装成一个整体应位置组装成一个整体。安装其他附属结构。安装其他附属结构。（2 2）凝胶色谱柱的装填）凝胶色谱柱的装填 凝胶的选择：凝胶的选择：凝胶的选择：凝胶的选择：A
27、A、材料：、材料：交联葡聚糖凝胶（交联葡聚糖凝胶（G-G-7575）。）。B B、代表意义：、代表意义：“G G”表示凝胶的交联程度，膨表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围胀程度及分离范围。7575表示凝胶的得水值，即每克凝表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水胶膨胀时吸水7.57.5克。克。凝胶的前处理：凝胶的前处理：凝胶的前处理：凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：配置凝胶悬浮液：计算并称取计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。配成凝胶悬浮液。凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色
28、谱柱的装填方法：A A、固定：、固定：将色谱柱装将色谱柱装置固定在支架上。置固定在支架上。B B、装填：、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。均匀。注意：注意：1 1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。粒之间的空隙。2 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果离效果。装配好的凝胶柱 洗涤平衡：洗涤平衡：洗涤平衡：洗涤平衡
29、：装填完毕后，装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm50cm高的操作压下，用高的操作压下，用300ml300ml的的20mmol/l20mmol/l的的磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pHpH为为7.07.0）充分洗涤平衡充分洗涤平衡1212小时小时。注意：注意：注意：注意：1 1、液面不要低于凝胶、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。生物大分子物质的分离效果。2 2、不能发生洗脱液流干，露、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象出凝胶颗粒的现象。（2 2）凝胶色谱柱
30、的装填）凝胶色谱柱的装填50cm50cm高高高高（3 3）样品加入与洗脱）样品加入与洗脱 调节缓冲液面：调节缓冲液面：调节缓冲液面：调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。到与凝胶面平齐，关闭出口。滴加透析样品：滴加透析样品：滴加透析样品：滴加透析样品：吸管吸吸管吸1ml1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。凝胶面。样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：加样后打开下端
31、出口，使样品渗入凝加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。洗脱：洗脱：洗脱：洗脱：小心加入小心加入pH=7.0 pH=7.0 的的20mmol/l20mmol/l的磷酸缓冲液到适当的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。收集：收集：收集：收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每流出液，每5ml5ml收集一试管，连续收集。收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如（在分离过程中，如果红色
32、区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）注意：注意：注意：注意：正确的加样操作：正确的加样操作：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁加样。贴壁加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。、使吸管管口沿管壁环绕移动。（3 3）样品加入与洗脱）样品加入与洗脱注意：注意：注意：注意：正确的加样操作是：正确的加样操作是：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁加样。、贴壁加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。、使吸管管口沿管壁环绕移动。开始进行层析开始进行层析收集得到的纯化后的蛋白思考下面的问题：思考下
33、面的问题：让血红蛋白处在稳定的让血红蛋白处在稳定的pHpH范围内，维持结构和功能。范围内，维持结构和功能。1 1 1 1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？是什么？是什么？是什么？2 2 2 2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？你进
34、行蛋白质得分离有什么意义？你进行蛋白质得分离有什么意义？你进行蛋白质得分离有什么意义？血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。非常直观，大大简化了实验操作。3 3 3 3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步
35、，包括：样品处样品处样品处样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定理、粗分离、纯化和纯度鉴定理、粗分离、纯化和纯度鉴定理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液血红蛋白溶液，即，即:样品的处理；样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通通通通过凝胶色谱法过凝胶色谱法过凝胶色谱法过凝胶色谱法将相对分子质量较大的将相对分子质量较大的杂质蛋白除去杂质蛋白除去，即，即:样品样品的纯化；最后经的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺
36、凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。进行纯度鉴定。（三）（三）SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）2.2.2.2.试剂的配制：试剂的配制：试剂的配制：试剂的配制：鉴定血红蛋白纯度。鉴定血红蛋白纯度。1.1.1.1.目的：目的：目的：目的：3.方法步骤：（略）方法步骤：（略）观察你处理的血液样品离心后观察你处理的血液样品离心后是否分层是否分层（见教科书图（见教科书图5-5-1818），），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋
37、此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。的提取纯度。三、实验结果分析与评价三、实验结果分析与评价 1 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？理后的样品发生了哪些变化吗？2 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？柱装填得成功吗？你是如何判断的？由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支由于凝胶是一种半透明的
38、介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖例如蓝色葡聚糖20002000或红色葡聚糖，或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。以消除气泡，消除不了时要重新装柱。如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的如
39、果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。3 3 3 3、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效动吗？请描述红色区带的移动情况，
40、并据此判断分离效动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？果？果？果？（三）（三）SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳2.2.2.2.试剂的配制：试剂的配制：试剂的配制：试剂的配制：鉴定血红蛋白纯度。鉴定血红蛋白纯度。1.1.1.1.目的：目的：目的：目的：丙烯酰胺和丙烯酰胺和丙烯酰胺和丙烯酰胺和N,NN,NN,NN,N-亚甲基双丙烯酰胺亚甲基双丙烯酰胺亚甲基双丙烯酰胺亚甲基双丙烯酰胺:用去离子水配制用去离子水配制29%29%（29 g/100 mL29 g/100 mL，下同）的丙烯酰胺和，下同）的丙烯酰胺和1%1%的的N
41、,NN,N-亚甲基双丙亚甲基双丙烯酰胺的贮存液。烯酰胺的贮存液。十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDSSDSSDSSDS）:用去离子水配成用去离子水配成10%10%的贮存液，于室温保存。的贮存液，于室温保存。用于制备分离胶和浓缩胶的用于制备分离胶和浓缩胶的用于制备分离胶和浓缩胶的用于制备分离胶和浓缩胶的TrisTrisTrisTris缓冲液。缓冲液。缓冲液。缓冲液。TEMED TEMED TEMED TEMED：作用通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙作用通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。用去离子水配制用去离子水
42、配制用去离子水配制用去离子水配制10%10%10%10%过硫酸铵：过硫酸铵：过硫酸铵：过硫酸铵：作用是提供驱动丙烯酰胺和双作用是提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液。此溶液须配制新鲜液。TrisTrisTrisTris甘氨酸电泳缓冲液：甘氨酸电泳缓冲液：甘氨酸电泳缓冲液：甘氨酸电泳缓冲液：25 25 mmol/L Trismmol/L Tris，250 mmol/L 250 mmol/L 甘氨酸甘氨酸(pH 8.3)(pH 8.3)，0.1%0.1%的的SDSSDS。样样样样品处理液：品处理液：品处理液：品处理液：50 mmol/L Tr
43、is 50 mmol/L TrisHCl(pH 6.8)HCl(pH 6.8)，100 mmol/L 100 mmol/L DTT(DTT(巯基苏糖醇巯基苏糖醇)或用或用5%5%的巯基乙醇，的巯基乙醇，2%2%的的SDSSDS，0.1%0.1%的溴酚蓝，的溴酚蓝，10%10%的甘油。的甘油。染色液：染色液：染色液：染色液：0.1%0.1%的考马斯亮蓝的考马斯亮蓝R250R250，40%40%的甲醇，的甲醇，10%10%的冰醋酸。的冰醋酸。脱色液：脱色液：脱色液：脱色液：10%10%的甲醇和的甲醇和10%10%的冰醋酸。的冰醋酸。1 1、由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺、由于制备凝胶的丙烯酰胺
44、和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。因此操作必须在通风橱内或通风处进行。2 2、TEMEDTEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。致命。3 3、在进行电泳操作时一定按照实验要求和、在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤完成。操作时要戴好一次性手套。步骤完成。操作时要戴好一次性手套。注意事项：注意事项：（三）（三）SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-SDS-SDS-SDS-
45、聚丙烯酰胺分离胶制备：聚丙烯酰胺分离胶制备：聚丙烯酰胺分离胶制备：聚丙烯酰胺分离胶制备：用去离子水用去离子水用去离子水用去离子水4.6 mL4.6 mL4.6 mL4.6 mL，30%30%30%30%的的的的丙烯酰胺丙烯酰胺丙烯酰胺丙烯酰胺2.7 mL2.7 mL2.7 mL2.7 mL，1.5mol1.5mol1.5mol1.5mol、pH 8.8pH 8.8pH 8.8pH 8.8的的的的TrisTrisTrisTris缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液2.5 mL2.5 mL2.5 mL2.5 mL，10%10%10%10%的的的的SDS 0.1 mLSDS 0.1 mLSDS 0.1 mLSD
46、S 0.1 mL，10%10%10%10%的过硫酸胺的过硫酸胺的过硫酸胺的过硫酸胺0.1 mL0.1 mL0.1 mL0.1 mL，TEMED 0.006mLTEMED 0.006mLTEMED 0.006mLTEMED 0.006mL，混合均匀，混合均匀，混合均匀，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加梳子的齿长再加梳子的齿长再加梳子的齿长再加0.5 cm)0.5 cm)0.5 cm)0.5
47、 cm)，再在胶液面上小心注入一层水（约高，再在胶液面上小心注入一层水（约高，再在胶液面上小心注入一层水（约高，再在胶液面上小心注入一层水（约高2 2 2 23 mm3 mm3 mm3 mm），以阻止氧气进入凝胶溶液。），以阻止氧气进入凝胶溶液。），以阻止氧气进入凝胶溶液。），以阻止氧气进入凝胶溶液。分离胶聚合完全后分离胶聚合完全后分离胶聚合完全后分离胶聚合完全后（约（约（约（约30 min30 min30 min30 min），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。配制配制配制配制S
48、DSSDSSDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液用去离子水聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液用去离子水聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液用去离子水聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液用去离子水2.7 mL2.7 mL2.7 mL2.7 mL，30%30%30%30%的的的的丙烯酰胺丙烯酰胺丙烯酰胺丙烯酰胺0.67 mL0.67 mL0.67 mL0.67 mL，1.0 mol1.0 mol1.0 mol1.0 mol、pH 6.8pH 6.8pH 6.8pH 6.8的的的的TrisTrisTrisTris缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液0.5 mL0.5 mL0.5 mL0.5 mL，10%10%10%10%的的的的S
49、DS0.041 mLSDS0.041 mLSDS0.041 mLSDS0.041 mL，10%10%10%10%的过硫酸胺的过硫酸胺的过硫酸胺的过硫酸胺0.04 mL0.04 mL0.04 mL0.04 mL，TEMED 0.004 mLTEMED 0.004 mLTEMED 0.004 mLTEMED 0.004 mL，混，混，混，混合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。入干净的梳子。入干净的梳
50、子。入干净的梳子。整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。温下聚合。温下聚合。温下聚合。（1 1 1 1）根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板）根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板）根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板）根据厂家说明书安装电泳用的玻璃