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1、食品微生物检验食品微生物检验规范操作基础培训规范操作基础培训5 制片、染色及显微观察制片、染色及显微观察福建出入境检验检疫局技术中心食品所微生物实验室福建出入境检验检疫局技术中心食品所微生物实验室福建出入境检验检疫局技术中心食品所微生物实验室福建出入境检验检疫局技术中心食品所微生物实验室2010.052010.05主要内容：主要内容：1清洗、消毒和灭菌操作清洗、消毒和灭菌操作 2培养基的制备培养基的制备 3采样和取、制样采样和取、制样 4接种、分离纯化接种、分离纯化 5制片、染色及显微观察制片、染色及显微观察 6实验室安全基础知识实验室安全基础知识 5.1显微操作显微操作 显微镜是微生物检验中
2、最常用的精密光学仪器。显微镜的种类很多，在实验室中常用的有：普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。食品微生物检验中最常用的是普通光学显微镜。显微镜的使用方法 用光学显微镜用光学显微镜观察微生物形观察微生物形态时，一般遵态时，一般遵循先循先低倍镜观低倍镜观察，察，后后高倍镜高倍镜观察，再油镜观察，再油镜观察观察。低倍镜操作方法1.两眼从侧面注视 低倍物镜对准通光孔，使用粗调焦螺旋将镜筒自上而下的调节，避免物镜镜头接触到玻片而损坏镜头和压破玻片。当物镜镜头与载物台的玻片相距23mm时停止；2.左眼注视（注意右眼应该同时睁着），并转动粗调焦螺旋，使镜筒徐徐上升，直到看清
3、物象为止；3.再用微调焦螺旋调至清晰。注意：注意：粗调调焦螺旋只用于上调载物台，如观察显微镜时，用粗调节器调节，有压碎载玻片、损坏物镜的危险。因此，用细调焦螺旋调节视野使其更清晰高倍镜操作方法1.将低倍镜观察到的目标移动至视野中央；2.将低倍镜镜头转换成高倍镜镜头。换用高倍镜后，视野内亮度变暗，因此一般选用较大的光圈并使用反光镜的凹面；3.用微调焦螺旋调至清晰。观看的物体数目变少，但是体积变大。注意：注意：高倍镜观察时，光线需增强。油镜操作方法1.将高倍镜观察到的目标移动至视野中央；2.将高倍镜镜头挪开，于载玻片上滴一滴香柏油；3.将油镜镜头移动至视野，让油镜镜头浸入香柏油（至油晕不再扩大为止
4、）；4.用微调焦螺旋调至清晰。注意：注意：油镜的操作需要较强的关线，故需将光线调至最强。用10倍和/或40倍物镜为随后的高倍油镜（90倍或100倍）选择合适的视野（油镜镜筒上通常刻有H.I.OIL或OEL等标志）油镜用后的处理：油镜用后的处理：第一遍：用擦镜纸拭去镜头上的油；第二遍：用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去头上残留的油迹；第三遍：再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。普通显微镜的保养(1)观察完后，移去观察的载玻片标本。(2)用过油镜的，应先用擦镜纸将镜头上的油擦去，再用擦镜纸蘸着二甲苯擦拭23次，最后再用擦镜纸将二甲苯擦去。(3)转动物镜转换器，放在低倍镜的位置。(4)将镜身
5、下降到最低位置，调节好镜台上标本移动器的位置，罩上防尘套。镜头清洁，只能用软而没有短绒毛的擦镜纸，物镜的清洗，可选用不同的溶剂，如酒精、丙酮和二甲苯等，其中最安全的是二甲苯。5.2 制片和染色 染色原理染色原理 由于微生物细胞含有大量水分，机体是无色透明的，与周围背景没有明显的反差,必须进行染色，使经染色后的菌体与背景菌体与背景形成明显的色差形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。微生物细胞是由蛋白质、核酸等两性电解质及其他化合物组成。所以，微生物细胞表现出两性电解质的性质。两性电解质兼有碱性基和酸性基，在酸性溶液中离解出碱性基呈碱性带正电。在碱性溶液中离解出酸性基呈酸性带负电。细菌
6、带负电荷多，容易与带正电荷的碱性染料结合，故用碱性染料染色的较多。微生物中细菌、致病菌是很小的生物体，必须通过染色的方法，在显微镜下才能看得清楚，并且还可以通过染色的方法鉴别革兰氏染色特性，以及是否长有鞭毛、周毛、荚膜和芽孢等。细菌的形态细菌的形态杆菌杆菌螺形菌螺形菌球菌球菌细菌的测量单位：细菌的测量单位：微米(m)细菌的大小与形态染色方法染色方法(一一)简单染色法简单染色法 简单染色法又叫作普通染色法，只用一种染料使细菌染上颜色，观察细菌的形态。(二二)复染色法复染色法 用两种或多种染料染细菌，目的是为了鉴别不同性质的细菌，所以又叫鉴别染色法。主要的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法。革兰
7、氏染色法：不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类：u染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；u染色反应呈红色的称为革兰氏阴性细菌，用G表示。细菌对革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞细胞壁的成分和结构壁的成分和结构不同而造成的。实验材料实验材料1.显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环、载玻片、酒精灯、蜡笔等。2.草酸铵结晶紫染液、碘液、95乙醇、蕃红染液、石炭酸复红染液3.菌株：大肠杆菌，金黄色葡萄球菌实验内容与步骤实验内容与步骤(一一)细菌的简单染色步骤细菌的简单染色步骤 涂片干燥固定染色水洗干燥镜检1涂片涂片 取干净的载玻片于实验台上，在载玻片的中央滴一
8、滴无菌蒸馏水，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量培养物与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。2干燥 涂片最好在室温下使其自然干燥，有时为了使之干得更快些，可将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。3固定 手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰外层尽快的来回通过23次，共约23秒钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60）,放置待冷后，进行染色。4染色 在涂片薄膜上滴加染色液(石炭酸复红、草酸铵结晶紫或美蓝任选一种)一滴，使染色液覆盖涂片，染色约1m
9、in。5水洗 斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。6干燥 用吸水纸吸去涂片边缘的水珠，置于室温下自然干燥。用吸水纸时切勿将菌体擦掉。7镜检(二二)细菌的革兰氏染色步骤细菌的革兰氏染色步骤 涂涂片片干干燥燥固固定定初初染染水水洗洗媒媒染染水水洗洗脱脱色色水水洗洗复复染染水水洗洗干燥干燥观察观察1取培养物分别做涂片、干燥、固定，方法均与简单染色的相同。2用草酸铵结晶紫染色1min后水洗。3加碘液媒染1min后水洗。4斜置载玻片，滴加95乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色 为止，大约需时2030s，随即水洗。5用蕃红染液复染1min，水洗。6用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置
10、显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后用油镜观察，注意细菌细胞的颜色。革兰氏染色图解革兰氏染色试剂 步骤1：用蒸馏水滴瓶滴一小滴蒸馏水于洁净的载玻片上 步骤2：用无菌操作法取少许培养物于蒸馏水滴上 步骤3：用接种环将培养物涂布成一薄层 步骤4：风干 步骤5：在酒精灯火焰外层尽快的来回通过3-4次固定步骤6：结晶紫染色1分钟 步骤7：用蒸馏轻轻冲洗玻片 步骤8：革兰氏碘液染色1分钟，再用蒸馏水轻轻冲洗 步骤9：酒精脱色至下滴液为无色，立即用蒸馏水冲洗 步骤10：番红复染1分钟，用蒸馏水轻轻冲洗 大肠杆菌（Escherichia coli）革兰氏染色图 革兰氏染色阴性杆菌（红色）金黄色葡萄球菌（金黄
11、色葡萄球菌（Staphylococcus Staphylococcus aureusaureus）革兰氏染色革兰氏染色 革兰氏染色阳性球菌（紫色）注意事项注意事项1革兰氏染色成败的关键是脱色时间关键是脱色时间，如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性菌。因此必须 严格把握脱色时间。2 选用培养18-24小时菌龄小时菌龄的细菌为宜，若细菌太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。3.干净的玻片、热固定、每一步水洗要彻底并且吸干等也是实验成功的关键。鞭毛化学组成：化学组成：鞭毛蛋白功能：功能：运动器官与致病有关鉴定分类细菌荚膜化学组成：化学组成：多糖或多肽功能：功能：抗吞噬作用粘附作用抗有害物质损伤作用芽孢脱水而成，为细菌休眠形式脱水而成，为细菌休眠形式功能与医学上意义：功能与医学上意义：对外界的抵抗力增加可发芽成繁殖体有致病性有鉴别作用应以杀死芽胞为灭菌效果的指标菌毛化学组成：化学组成：菌毛蛋白菌毛蛋白种类与功能：种类与功能：普通菌毛与致病有关性菌毛与遗传变异有关