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1、培养细胞的生物学特征培养细胞的生物学特征洋蔥的表皮細胞洋蔥的表皮細胞植物輸導水分的細胞植物輸導水分的細胞哺乳類的肌肉細胞哺乳類的肌肉細胞人類脊髓神經細胞人類脊髓神經細胞体外培养细胞的分型体外培养细胞的分型 （一）贴附型：（一）贴附型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能按照体内组织学标准判定，仅大致分成以下四型：粘附粘附:是大多数有机体是大多数有机体细胞细胞在体内在体内 生存生存和和生生长发育长发育的的基本存在方式基本存在方式 结果结果:基于粘附特性，使细胞与细胞之间相基于粘附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织，有机体的绝大多数细胞必须互结合形成组织，有机体的绝大
2、多数细胞必须 粘附粘附于一于一固相表面固相表面 才能才能生存生存和和生长生长。培养时培养时：这些细胞被放到体外环境中以后：这些细胞被放到体外环境中以后,同样同样需要粘附于某一固相表面才能生存和生长，需要粘附于某一固相表面才能生存和生长，因而因而属于粘附型细胞属于粘附型细胞粘附粘附(锚定或锚着锚定或锚着)依赖型依赖型(性性)细胞：细胞：唯有粘附唯有粘附于固相表面才能生存的细胞于固相表面才能生存的细胞 类型类型 细胞在体内、外细胞在体内、外的的粘附粘附方式：方式：存在差异存在差异 体内体内：粘附粘附是是全方位全方位,外形外形具有具有复杂的立体复杂的立体特征特征 体外体外：多数情况，细胞只有多数情况
3、，细胞只有一个附着平面一个附着平面 外形外形一般一般与体内时明显不同与体内时明显不同 按照培养细胞的主要形态，可分为按照培养细胞的主要形态，可分为几大类型几大类型 1 1、成纤维细胞型：、成纤维细胞型：胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。名称：名称：凡在凡在培养中形态与成纤维细胞类似培养中形态与成纤维细胞类似的的来源：来源：由由中胚层间充质组织起源中胚层间充质组织起源的组织如：的组织如：真正的成纤维细胞，
4、心肌，平滑肌，成骨细胞，真正的成纤维细胞，心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮血管内皮形态：形态：似体内成纤维细胞似体内成纤维细胞的形态，的形态，胞体梭形胞体梭形或不规则或不规则三角形，胞质向外伸出三角形，胞质向外伸出2 23 3个个长短不等的突起长短不等的突起，中有卵圆形核中有卵圆形核生长特点：生长特点：排列成放射状，漩涡状排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片并不紧靠连成片，细胞细胞细胞接触易断开而细胞接触易断开而单独行动，单独行动，游离的游离的单独单独的的成纤维样细胞，常有几个成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起伸长的细胞突起成纤维细胞成纤维细胞2 2、上皮型细胞：、上皮型细胞：细胞呈扁平不规
5、则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。名称：名称：仅形态上似体内仅形态上似体内，实际上不完全相同，实际上不完全相同来源：来源：来源于外胚层来源于外胚层、内胚层细胞、内胚层细胞,如：如：皮肤及其衍生物皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡消化道，乳腺，肺泡,上皮性肿瘤上皮性肿瘤形态：形态：类似类似体内的体内的上皮细胞扁平上皮细胞扁平，不规则多角形不规则多角形，中有圆，中有圆形核形核 生长特点：生长特点：易相连易相连成片，成片，相靠相靠紧密相连
6、紧密相连成薄层成薄层铺石状铺石状生长生长时呈时呈膜状膜状移动，移动，很少很少脱离细胞群而脱离细胞群而单个活动单个活动上皮型细胞上皮型细胞3 3、游走细胞型：、游走细胞型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。和其他细胞相区别。4 4、多型细胞型：、多型细胞型：有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。态，可统归于此类。（二）悬浮型：（二）悬浮型：见于少数特殊
7、的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。概念：概念：培养时培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长来源：来源：自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌肿细胞也可能自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌肿细胞也可能特点：特点：在在悬浮中生长良好悬浮中生长良好细胞细胞圆形圆形，单个或小细胞团，单个或小细胞团优点：优点：生存空间大，生存空间大，提供数量大，传代方便提供数量大，传代方便(不需消化不需消化)，易于收获，易于收获，可获得稳定状态可获得稳定状态缺点：缺点：观察不
8、方便，很多细胞不能悬浮生长观察不方便，很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细尤以正常细胞胞)Hepatocytes培养细胞的生长和增殖过程培养细胞的生长和增殖过程（一）培养细胞生命期（一）培养细胞生命期（Life Span of Culture Cells）所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。1 1原代培养原代培养（Primary Culture）期：）期：也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是异质的（Heterogeneous），也
9、即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂培养基中进行培养时，细胞克隆形成率（Cloning Efficiency）很低，即细胞独立生存性差。克隆形成率即细胞群被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群（克隆）的百分数。初代培养细胞多呈二倍体核型；由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。2 2传代期：传代期：初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系（Cell Line）。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系（Diploid Cell Line）
10、。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。当前世界上常用细胞均在不出十代内冻存。如不冻存，则需反复传代以维持细胞的适宜密度，以利于生存。但这样就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化。一般情况下当传代1050次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。3衰退期：衰退期：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点（多发生在传代末或衰退期），由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化（Spontaneous Transformation）。转化的标志之一是细胞可能获得永生性（Immortalit
11、y）或恶性性（Malignancy）。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系（Infinite Cell Line），也称连续细胞系（Continuous Cell Line）。无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体（Heteroploid）。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。细胞永生性和恶性性非同一性状。（二）组织培养细胞一代生存期（二）组织培养细胞一代生存期所谓细胞“一代”一词，系仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，这已成为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增一代非同一含义。如
12、某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细胞世代（Generation）或倍增Doubling）不同；在细胞一代中，细胞能倍增36次。细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段：1潜伏期（潜伏期（Latent Phase）：）：细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，悬浮期结束。各种细胞贴附速度不同，这与细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关。初代培养细胞贴附慢，可长达1024小时或更多；连续细胞系和恶性细胞系快，1030分钟即可贴附。细胞贴附现象是一个非常复杂和与多种因素相关的过
13、程。支持物能影响细胞的贴附；底物表面不洁不利贴附，底物表面带有阳性电荷利于贴附。另外在贴附过程中，有一些特殊物质如纤维连接素（Fibronectin），又称LETS（Larger External Transformation Substance），细胞表面蛋白（Cell Surface Protein：CSP）等也参与贴附过程。这些物质都是蛋白类成分，它们有的存在于细胞膜的表面（如 CSP），有的则来自培养基中的血清（LETS）。近年又从各种不同组织和生物成分中提取出了很多促贴附物质。贴附是贴附类细胞生长增殖条件之一。初代培养细胞潜伏期长，约2496小时或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，
14、仅624小时；细胞接种密度大时潜伏期短。当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数增生期。原因原因:操作时，细胞表面上与其它细胞及支持物黏附与连接操作时，细胞表面上与其它细胞及支持物黏附与连接的分子被破坏，细胞受到损伤的分子被破坏，细胞受到损伤 接种细胞接种细胞:适应，恢复，积累适应，恢复，积累(代谢中间产物代谢中间产物)组织块组织块:细胞迁移出细胞迁移出一般经数小时一般经数小时-几天几天过程过程:游离游离:悬浮悬浮,胞质回缩胞质回缩,全部细胞变为圆球形全部细胞变为圆球形吸附吸附:贴附底物贴附底物,一般一般2424小时内贴壁小时内贴壁潜伏期潜伏期:可有运动活动可有运动活动,基本无增殖
15、基本无增殖,少见分裂相少见分裂相 影响因素：影响因素：滞留期的长短与：滞留期的长短与：细胞种类、细胞种类、按种的细胞密度、按种的细胞密度、培养条件等因素有关。培养条件等因素有关。1.1.细胞密度细胞密度接种分散细胞接种分散细胞,接种的接种的密度越大密度越大、数量越多，细胞群体越容、数量越多，细胞群体越容易适应体外环境，易适应体外环境，潜伏期就短潜伏期就短。相反，即便是在很小的培。相反，即便是在很小的培养空间内，如接种的细胞数量不够大，潜伏期仍会较长养空间内，如接种的细胞数量不够大，潜伏期仍会较长2.2.细胞类型细胞类型传代传代培养的细胞之培养的细胞之潜伏期潜伏期比原代培养的比原代培养的细胞细胞
16、短短。传代培养期的细胞传代培养期的细胞,一般为一般为6-24h;6-24h;原代原代24-96h24-96h或更长或更长单个细胞快单个细胞快,细胞大团慢细胞大团慢,组织块慢组织块慢连续细胞系连续细胞系与发生恶性与发生恶性转化的细胞转化的细胞(6-24h)(6-24h)比有限细胞系比有限细胞系与正常二倍体细胞的与正常二倍体细胞的短短来源：胚胎来源：胚胎组织组织:短短,2,2天可见细胞生长天可见细胞生长成体成体:长长 3.3.细胞机能状态细胞机能状态 不良者慢不良者慢4.4.培养条件培养条件 培养液培养液,pH,pH,底物底物 不利不利:污染污染,有毒有毒 2指数增生期（指数增生期（Logarit
17、hmic growth Phase）：）：这是细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂指数（Mitotic Index：MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于0.1%0.5%，初代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%5%。在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续35天后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。细胞相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制（Contact Inhibition）。细
18、胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制（Density Inhibition），导致细胞分裂停止。特点：特点：是细胞是细胞增生最活跃增生最活跃、活力最旺盛活力最旺盛的阶段的阶段培养物中培养物中细胞数量呈指数增长细胞数量呈指数增长,细胞群体均一细胞群体均一是理想的实验用细胞是理想的实验用细胞判断细胞生长的指标：判断细胞生长的指标：指数生长期内细胞分裂活动的程度指数生长期内细胞分裂活动的程度(增殖活性增殖活性)可作为判断可作为判断细胞
19、生长是否旺盛的重要指标细胞生长是否旺盛的重要指标1.有丝分裂指数有丝分裂指数(MI):指培养物中指培养物中分裂相数量占全部细胞数量的百分比，分裂相数量占全部细胞数量的百分比，统计统计时，每瓶至少需计数时，每瓶至少需计数1000个细胞。个细胞。一般细胞的一般细胞的MI约为约为0.10.5%；原代培养物的原代培养物的MI比继代比继代培养物低。连续细胞系和肿瘤细胞高，可达培养物低。连续细胞系和肿瘤细胞高，可达3%5%。判断细胞生长的指标：判断细胞生长的指标：2.细胞细胞群体倍增时间群体倍增时间:培养物中细胞数量翻倍的平均时间培养物中细胞数量翻倍的平均时间3.MTT法法：反映细胞内一种酶活性程度反映细
20、胞内一种酶活性程度4.标记核苷酸标记核苷酸(3H-TdR)掺入量：掺入量：反映反映DNA细胞生长一定阶段细胞生长一定阶段(指数生长期一般持续指数生长期一般持续3 35 d5 d）,即可即可长满培养器皿，相互汇合成片长满培养器皿，相互汇合成片(铺满铺满 confluence)当细胞相互接触连接成片，出现当细胞相互接触连接成片，出现接触抑制接触抑制，接触抑制以，接触抑制以后，虽然运动受抑制，但只要营养成分充足，仍可短后，虽然运动受抑制，但只要营养成分充足，仍可短期的分裂增殖，只有当细胞密度增大到一定程度，细期的分裂增殖，只有当细胞密度增大到一定程度，细胞便不再分裂增殖。为胞便不再分裂增殖。为密度依
21、赖性细胞生长抑制密度依赖性细胞生长抑制当细胞分裂停止后，细胞数量即不再增加进入平台期当细胞分裂停止后，细胞数量即不再增加进入平台期 3停滞期（停滞期（Stagnate Phase）：）：细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平台期（Plateau）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH降低。此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡，故传代应越早越好。传代过晚（已有中毒迹象）能影响下一代细胞的机能状态。在这种情况下，虽进行了传代，因细胞已受损，需要恢复，至少还要再传12两代，通过换
22、液淘汰死细胞和使受损轻微的细胞得以恢复后，才能再用。概述概述 细胞细胞铺满后铺满后再再1-2倍增倍增,进入细胞达进入细胞达饱和密度饱和密度,可可存活存活仍有代谢活动，但仍有代谢活动，但基本不分裂基本不分裂，细胞数量维持在某一水平上，生长活动停滞细胞数量维持在某一水平上，生长活动停滞特点特点 (1)(1)细胞数量：细胞数量：细胞达细胞达饱和密度饱和密度，出现密度抑制，出现密度抑制。停止生长原因停止生长原因:细胞数量多、生长细胞数量多、生长地区占满地区占满、营养营养消耗消耗、培养液中代谢、培养液中代谢废物积聚渐多，细胞停止生长废物积聚渐多，细胞停止生长。即使经常更换培养液，细胞也会变性即使经常更换
23、培养液，细胞也会变性,从生长基质表面从生长基质表面脱落、死亡脱落、死亡唯有唯有进行进行传代传代方可缓解。方可缓解。(2)(2)细胞活动小细胞活动小,细胞膜的细胞膜的活动小活动小(3)(3)生长组分下降生长组分下降:0:010%10%(4)(4)及时传代：及时传代：细胞细胞已中毒已中毒，即使即使传代传代，也会，也会影响下一影响下一代细胞代细胞的功能状况的功能状况体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subcultu
24、re）。体外培养细胞的种类体外培养细胞的种类 （一）初代培养 初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。一旦已进行传代培养（Subculture）的细胞，便不再称为初代培养，而改称为细胞系。（二）细胞系 初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。无限细胞系有的只有永生性（或
25、不死性），但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性；有的不仅有永生性，异体接种也有致瘤性，说明已恶性化。（三）细胞株 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株（Substrain）（四）二倍体细胞 细胞群染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同（2n细胞占75或80以上）的细胞群，称二倍体细胞培养。如仅数目相同，而核型不同的即染色体形态有改变者为假二倍体。二倍体细胞在正常情况下具有限生命期，故属有限细胞系。但随供体年龄和组织细胞的不同，二倍体细胞的寿命长短各异。人胚
26、肺成纤维细胞可传50代土10代，人胚肾只有810代，人胚神经胶质细胞1530代。由不同年龄供体取材建立的二倍体细胞系可供研究衰老之用。为保持二倍体细胞能长期被利用，一般在初代或25代即大量冻存作为原种（Stook Cells），用时再进行繁殖，用后再继续冻存，可供长期使用或延缓细胞的衰老。（五）遗传缺陷细胞 从有先天遗传缺陷者取材（主要为成纤维细胞）培养的细胞，或用人工方法诱发突变的细胞，都属遗传缺欠细胞。这类细胞可能具有二倍体核型，也可呈异倍体。（六）肿瘤细胞系或株 这是现有细胞系中最多的一类，我国已建细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，常已传几十代或百代以上，并
27、具有不死性和异体接种致瘤性。细胞系或细胞株的命名 HeLa：为供体患者的姓名（来源于宫颈癌）：为供体患者的姓名（来源于宫颈癌）CHO：中国地鼠卵巢细胞（：中国地鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary）宫宫-743：宫颈癌上皮细胞，：宫颈癌上皮细胞，1974年年3月建立月建立NIH3T3：美国国立卫生研究院（：美国国立卫生研究院（National Institute of Health）建立；每）建立；每3天传代，每次接种天传代，每次接种3105细胞毫细胞毫升。升。细胞系或株的鉴定、管理和使用细胞系或株的鉴定、管理和使用 ATCC入库细胞要求检测项目如下：培养简历：培养简历：组织
28、来源日期、物种、组织起源、性别、年龄、供体正常或异常健康状态、细胞已传代数等 冻冻 存存 液：液：培养基和防冻液名称 细胞活力：细胞活力：融解前后细胞接种存活率和生长特性 培培 养养 液：液：培养基种类和名称（一般要求不含抗生素）、血清来源和含量 细胞形态：细胞形态：类型，如为上皮或成纤维细胞等，融解后细胞生长特性 核核 型：型：二倍体或多倍体，标记染色体的有无 无污染检测：无污染检测：包括细菌、真菌、支原体、原虫和病毒等 物种检测：物种检测：检测同工酶，主要为G6PD和LDH，以证明细胞有否交叉污染以及反转录酶检测 免疫检测：免疫检测：一两种血清学检测 细胞建立者：细胞建立者：建立者姓名；检测者姓名 细胞系或株的鉴定、管理和使用细胞系或株的鉴定、管理和使用