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1、实验十三、实验十三、PCR产物的纯化与克隆产物的纯化与克隆一、概述一、概述 扩增的PCR产物如利用T-Vector可直接进行克隆。如用自备的平末端或粘性末端载体连接，往往需要将产物纯化。克隆的主要方法有：1、平末端连接、平末端连接：由于TaqDNA聚合酶往往在PCR产物3端加上多余的非模块依赖碱基，在用平末端连接克隆PCR产物前，可用Klenow片段或T4DNA聚合酶处理补平末端。2、在、在PCR产物尾部加产物尾部加dT或或ddT：TaqDNA聚合酶会在3端加上多余的非模块依赖碱基，而且对A优先聚合，所以PCR产物末端的多余碱基大部分都是A。利用这一特点，载体平末端用酶加上dT或ddT，使载体
2、在PCR产物末端互补并进行连接。载体末端加dT尾可直接用TaqDNA聚合酶和dTTP或ddTTP。3粘性末端连接粘性末端连接：利用引物中附加在5端的限制酶位点，直接将PCR产物经适当的限制性内切酶切割后产生粘性末端，与载体连接，产生重组DNA。二、二、PCR产物的纯化产物的纯化 -V-gene DNA清洁试剂盒清洁试剂盒操作步骤操作步骤A.在PCR反应液中加三个体积的PCR-A溶液溶液（最终体积为100ul）;混匀后转移到制备管制备管中，将DNA制备管置于2ml离心管中，3600rpm离心l min。弃滤液；B.将制备管置回离心管，加0.5ml Wl溶液溶液，3600rpm离心30S，弃滤液；
3、C.将制备管置回离心管，加0.7ml W2溶液，溶液，3600rpm离心30s，弃滤液；以同样的方法再用0.7ml W 2溶液洗涤一次。D.将制备管置于离心管中，12000rpm离心1min.E.将制备管置于清净1.5ml离心管离心管中，在DNA制备膜正中央加25-30ul水或洗脱液，室温放置1min。12000rpm离心l min洗脱DNA。三、载体加三、载体加dT尾方法尾方法：实验步骤：实验步骤：1.将1ul pUC19用Sma I全酶切。2.在小管中按上述PCR反应，加入各种混合物，其中4ul4种dNTP改为4ul 25 mmol/L dTTP.3.加入1ul（5单位）的Taq DNA聚合酶在72下加热2小时。4.用酚：氯仿：异戊醇抽提两次。5.加入两倍体积无水乙醇，在-20下沉淀1小时。6.离心，用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于10 ul ddH2O中。目前一些公司已开发出可直接用于克隆目前一些公司已开发出可直接用于克隆PCR产物产物的带的带3-T-Vector。四、四、PCR产物与载体粘末端连接产物与载体粘末端连接1.在7ul PCR产物中加1ul带dT尾的pUC质粒(T-Vector)。2.加1ul T4DNA连接酶连接酶，1ul 10X连接缓冲液连接缓冲液，混匀，16连接过夜。3.取5ul连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。