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1、第七章第七章 遗传信息的传递遗传信息的传递复制、转录、翻译复制、转录、翻译DNARNA蛋白质蛋白质复制复制转录转录反转录反转录翻译翻译遗传信息传递的中心法则遗传信息传递的中心法则Central dogmaCentral dogma遗传信息传递的中心法则概述遗传信息传递的中心法则概述 生生物物的的遗遗传传信信息息以以密密码码的的形形式式储储存存在在DNADNA分分子子上上，表表现现为为特特定定的的核核苷苷酸酸排排列列顺顺序序。在在细细胞胞分分裂裂的的过过程程中中，通通过过DNADNA复复制制把把亲亲代代细细胞胞所所含含的的遗遗传传信信息息忠忠实实地地传传递递给给两两个个子子代代细细胞胞。在在子子
2、代代细细胞胞的的生生长长发发育育过过程程中中，这这些些遗遗传传信信息息通通过过转转录录传传递递给给RNARNA，再再由由RNARNA通通过过翻翻译译转转变变成成相相应应的的蛋蛋白白质质多多肽肽链链上上的的氨氨基基酸酸排排列列顺顺序序，由由蛋蛋白白质质执执行行各各种种各各样样的的生生物物学学功功能能，使使后后代代表表现现出出与与亲亲代代相相似似的的遗遗传传特特征征。后后来来人人们们又又发发现现，在在宿宿主主细细胞胞中中一一些些RNARNA病病毒毒能能以以自自己己的的RNARNA为为模模板板复复制制出出新新的的病病毒毒RNARNA，还还有有一一些些RNARNA病病毒毒能能以以其其RNARNA为为模
3、模板板合合成成DNADNA，称称为为逆逆转转录这是中心法则的补充。录这是中心法则的补充。中中心心法法则则总总结结了了生生物物体体内内遗遗传传信信息息的的流流动动规规律律，揭揭示示遗遗传传的的分分子子基基础础，不不仅仅使使人人们们对对细细胞胞的的生生长长、发发育育、遗遗传传、变变异异等等生生命命现现象象有有了了更更深深刻刻的的认认识识，而而且且以以这这方方面面的的理理论论和和技技术术为为基基础础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。遗传信息传递的中心法则遗传信息传递的中心法则第一部分第一部分 DNA DNA的生物合成的生物合成第二
4、部分第二部分 RNA RNA的生物合成的生物合成第三部分第三部分 蛋白质的生物合成蛋白质的生物合成vDNADNA为遗传信息的储存者为遗传信息的储存者vRNARNA为遗传信息的传递者为遗传信息的传递者v蛋白质为遗传信息的体现者蛋白质为遗传信息的体现者n原核生物每个细胞中只含有一个染色体，真核生原核生物每个细胞中只含有一个染色体，真核生物每个细胞含有多个染色体。染色体物每个细胞含有多个染色体。染色体DNADNA的复制与的复制与细胞分裂在密切的相互联系。一旦复制完成，就细胞分裂在密切的相互联系。一旦复制完成，就可发动细胞分裂，细胞分裂结束后又可开始新的可发动细胞分裂，细胞分裂结束后又可开始新的一轮一
5、轮DNADNA复制。复制。n细胞内存在极为复杂的系统，以确保细胞内存在极为复杂的系统，以确保DNADNA复制的正复制的正确性，并纠正可能出现的误差。确性，并纠正可能出现的误差。第一部分第一部分 DNA的生物合成的生物合成1 DNA1 DNA的半保留复制的半保留复制2 DNA2 DNA复制的起点和方向复制的起点和方向3 3 原核细胞的原核细胞的DNADNA复制复制4 4 真核细胞的真核细胞的DNADNA复制复制5 5 反转录作用反转录作用6 6 损伤和修复损伤和修复7 7 细菌的限制和修饰系统细菌的限制和修饰系统8 8 基因重组和克隆基因重组和克隆9 9 聚合酶链式反应技术与聚合酶链式反应技术与
6、DNADNA扩增扩增nDNADNA的每一条链都含有合成它的互补链所必需的全的每一条链都含有合成它的互补链所必需的全部遗传信息。部遗传信息。nDNADNA在复制时，两条链解开分别作为模板，在在复制时，两条链解开分别作为模板，在DNADNA聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组成新的板链互补的新链，以组成新的DNADNA分子。这样新形分子。这样新形成的两个成的两个DNADNA分子与亲代分子与亲代DNADNA分子的碱基顺序完全分子的碱基顺序完全一样。一样。1.1 DNA1.1 DNA的半保留复制的概念的半保留复制的概念由由于于子子代代
7、DNADNA分分子子中中一一条条链链来来自自亲亲代代，另另一一条条链链是是新新合合成成的的，这这种种复复制制方方 式式 称称 为为 半半 保保 留留 复复 制制(semiconservation(semiconservation replication)replication)。AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链母链DNA 复制过程中复制过程中子代子代D
8、NA 如何证明？如何证明？全保留式全保留式复制可能的几种方式复制可能的几种方式半保留式半保留式混合式混合式DNA以以半半保保留留方方式式进进行行复复制制，是是在在1958年年由由M.Meselson 和和 F.Stahl 所所完完成成的的实实验验所证明。所证明。该实验首先将大肠杆菌在含该实验首先将大肠杆菌在含15N的培养基中培养约十五代，的培养基中培养约十五代，使其使其DNA中的碱基氮均转变为中的碱基氮均转变为15N。然后将大肠杆菌移至只。然后将大肠杆菌移至只含含14N的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取DNA，作密度梯度离心，将具有不同密度
9、的，作密度梯度离心，将具有不同密度的DNA分离开。分离开。Matthew S.MeselsonFranklin William Stahl 1.2 1.2 半保留复制的实验证据半保留复制的实验证据密度梯度实验密度梯度实验实验结果支持实验结果支持半保留复制半保留复制的设想的设想按按半半保保留留复复制制方方式式，子子代代DNADNA与与亲亲代代DNADNA的的碱碱基基序序列列一一致致，即即子子代代保保留留了了亲亲代代的的全全部部遗遗传传信信息息，体体现现了了遗遗传传的的保保守守性性。DNADNA的的半半保保留留复复制制表表明明DNADNA在在代代谢谢上上的的稳稳定定性性，是是保保证证亲亲代代的的遗
10、遗传信息稳定地传递给后代必要措施。传信息稳定地传递给后代必要措施。1.3 1.3 半保留复制的意义半保留复制的意义遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。但不是绝对的。n复制起始点复制起始点：DNADNA复制要从复制要从DNADNA分子的特定部位开始，此部位称分子的特定部位开始，此部位称复制起始点。复制起始点。n复制子复制子(Replicon)(Replicon)基基因因组组能能独独立立进进行行复复制制的的单单位位称称为为复复制制子子，每每个个复复制子都含有一个复制起点。制子都含有一个复制起点。它是复制的功能单位。它是复制的功能单位。2 DNA
11、2 DNA复制的起点和方向复制的起点和方向2.1 2.1 概述概述 在复制的起始点处，在复制的起始点处，DNADNA双链部分解开为单链，双链部分解开为单链，形成叉子形状称形成叉子形状称复制叉复制叉（replication forkreplication fork）。）。2.2 DNA2.2 DNA复制的起点和方向的类型复制的起点和方向的类型1)1)两个起点，两个生长端的相向复制两个起点，两个生长端的相向复制 DNADNA每每条条链链有有1 1个个复复制制起起点点，分分别别合合成成1 1条条新新DNADNA，两两条条新新链链相相向向合合成成，每每个个生生长长点点只只有有1 1条条链链合合成成，这
12、种方式存在于线性这种方式存在于线性DNADNA病毒。病毒。2)12)1个起点，个起点，1 1个复制区的单向复制个复制区的单向复制 DNADNA两两条条链链的的复复制制起起始始点点在在同同一一位位置置，复复制制向向一一个个方方向向运运动动，两两条条DNADNA链链均均被被复复制制，这这种种方方式式偶偶见见于一些环形于一些环形DNADNA的复制。的复制。3)13)1个起点，两个复制区的双向复制个起点，两个复制区的双向复制 这种这种DNADNA复制方式最为普遍，复制起始于复制方式最为普遍，复制起始于1 1个位点，个位点，形成两个复制区向相反方向运动，在每个复制区两形成两个复制区向相反方向运动，在每个
13、复制区两条条DNADNA链均被复制。链均被复制。DNADNA复制的起点和方向示意图复制的起点和方向示意图l原核细胞原核细胞DNADNA复制只有一个复制起始区，因此它只有一复制只有一个复制起始区，因此它只有一个复制子。通常细菌、病毒和线粒体的个复制子。通常细菌、病毒和线粒体的DNADNA分子都是作分子都是作为单个复制子完成复制的。为单个复制子完成复制的。l真真核核生生物物的的染染色色体体DNADNA是是线线形形双双链链分分子子，含含有有许许多多复复制制起起点点，因因此此是是多多复复制制子子，每每个个复复制制子子约约有有100-200Kbp100-200Kbp。人体细胞平均每个染色体含有人体细胞平
14、均每个染色体含有10001000个复制子个复制子l病毒病毒DNADNA多种多样，环状或线形，双链或单链，但都是多种多样，环状或线形，双链或单链，但都是单复制子。单复制子。E.ColiE.Coli DNA DNA复制起点的复制起点的gene mappinggene mappingE.ColiE.Coli染色体染色体DNADNA复制复制:复制时有一个复制复制时有一个复制起点，双向展开，形成起点，双向展开，形成状中间物，直至两个状中间物，直至两个复制叉相遇，这种复制称复制叉相遇，这种复制称复制。复制。亲亲代代双双链链（或或单单链链）DNADNA的的一一条条链链在在DNADNA复复制制起起点点处处被被
15、切切开开，其其55端端游游离离出出来来。DNADNA聚聚合合酶酶便便可可以以将将脱脱氧氧核核糖糖核核苷苷酸酸聚聚合合在在3-OH3-OH端端。当当复复制制向向前前进进行行时时，亲亲代代DNADNA上上被被切切断断的的55端端继继续续游游离离下下来来，并并且且很很快快被被单单链链结结合合蛋蛋白白所所结结合合。因因为为55端端从从环环上上向向下下解解链链的的同同时时伴伴有有环环状状双双链链DNADNA环环绕绕其其轴轴不不断断的的旋旋转转，而而且且以以3-OH3-OH端端（+）为为引引物物的的DNADNA生生长长链链则则不不断断地地以以另另一一条条环环状状DNADNA链链（-）为为模模板板向向前前延
16、延伸伸，因因而而称称为滚环为滚环(Rolling circle)(Rolling circle)复制。复制。噬菌体噬菌体双双链链环环在在固固定定点点解解开开进进行行复复制制，但但两两条条链链的的合合成成是是高高度度不不对对称称的的，一一条条链链先先复复制制，另另一一条条链链保保持持单单链链而而被被取取代代，在在电电镜镜下下可可以以看看到到呈呈D D环环形形状状。待待一一条条链链复复制制到到一一定定程程度度，露露出出另另一一链链的的复复制制起起点点，另另一一条条链链才才开开始始复复制制。这这表表明明复复制制起起点点是是以以一一条条链链为为摸摸板板起起始始合合成成DNADNA的的一一段段序序列列；
17、两两条条链链的的起起点点并并不不总总在在同同一一点点上上，当当两两条条链链的的起起点点分分开开一一定定距距离离时时就就产生产生D D环（环（D-loopD-loop）复制。）复制。线粒体线粒体3 3 原核细胞的原核细胞的DNADNA复制复制n3.1 3.1 具备的基本条件具备的基本条件n3.2 3.2 参与参与DNADNA复制的酶及蛋白质复制的酶及蛋白质 n3.3 3.3 岡崎片段和半不连续复制岡崎片段和半不连续复制n3.4 3.4 原核生物双链原核生物双链DNADNA复制过程复制过程3.1 3.1 必须具备的基本条件必须具备的基本条件 模板：模板：解开成单链的解开成单链的DNADNA母链母链
18、 原料：原料：底物为底物为dNTPdNTP(包括包括dATPdATP、dGTPdGTP、dCTPdCTP、dTTPdTTP)聚合酶聚合酶:依赖依赖DNADNA的的DNADNA聚合酶，聚合酶，引物：一小段引物：一小段RNA,RNA,提供提供3 3-OH-OH末端使末端使dNTPdNTP可以依次可以依次聚合聚合 其他的酶和蛋白质因子其他的酶和蛋白质因子3.2.1 DNA3.2.1 DNA聚合酶聚合酶(DNA Polymerase)(DNA Polymerase)共同性质共同性质 11以脱氧核苷酸三磷酸以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)(dNTP)为前体催化合成为前体催化合成DNADNA22需要模板和引
19、物的存在需要模板和引物的存在;33不能起始合成新的不能起始合成新的DNADNA链链;44催化催化dNTPdNTP加到生长中的加到生长中的DNADNA链的链的3-OH3-OH末端末端;55催化催化DNADNA合成的方向是合成的方向是5353。3.2 3.2 参与参与DNADNA复制的酶及蛋白质复制的酶及蛋白质 DNADNA聚合酶的全称：依赖于聚合酶的全称：依赖于DNADNA的的DNADNA聚合酶聚合酶大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶nE.coli E.coli Has at Least Five DNA PolymerasesHas at Least Five DNA Polymeras
20、es分别为分别为DNADNA聚合酶聚合酶I I、IIII、IIIIII、IVIV、V V。19561956年年KornbergKornberg等在等在E.coliE.coli中发现的第一个中发现的第一个DNADNA聚合酶，聚合酶，是是DNADNA复制研究中的重要里程碑，因此于复制研究中的重要里程碑，因此于19591959年获得诺贝年获得诺贝尔化学奖。尔化学奖。a)DNA polymerase IDNA polymerase I（pol Ipol I）：）：相对分子量为相对分子量为1030010300，由一条多肽链，由一条多肽链组成，含有一个锌原子，每个大肠组成，含有一个锌原子，每个大肠杆菌细胞
21、约含有杆菌细胞约含有400400个个DNA DNA polymerase I polymerase I。功能功能n（1 1）5353聚合作用聚合作用n（2 2）3535核酸外切酶的活性核酸外切酶的活性n（3 3）5353核酸外切酶的活性核酸外切酶的活性n（4 4）焦磷酸解作用）焦磷酸解作用n（5 5）焦磷酸基交换的作用）焦磷酸基交换的作用 因此它属于一种多功能酶因此它属于一种多功能酶用胰蛋白酶或其他蛋白水解酶处理用胰蛋白酶或其他蛋白水解酶处理DNA pol IDNA pol I可可以得到两个片段以得到两个片段。大片段：具有聚合酶的活性和大片段：具有聚合酶的活性和3535核酸外切酶的活性，称核酸
22、外切酶的活性，称Klenow Klenow fragmentfragment。是实验室合成。是实验室合成DNADNA，进行分，进行分子生物学研究中常用的工具酶。子生物学研究中常用的工具酶。小片段：具小片段：具有有5353核酸外切酶核酸外切酶的活性。的活性。DNA pol IRNA引物模板链1 1）5353聚聚合作用合作用在引物在引物RNA 3-RNA 3-OHOH末端，以末端，以dNTPdNTP为底物，按模板为底物，按模板DNADNA上的指令由上的指令由DNA polDNA pol逐个逐个将核苷酸加上去，将核苷酸加上去，就是就是DNA polDNA pol的聚合作用。的聚合作用。5 5 至至
23、3 3 的聚合活性的聚合活性，催化的反应催化的反应：dTTP3(dNMP)n +dNTP (dNMP)n+1+ppi3 A T G C A A T T G C 5|5 T A C G ppi TDNA pol I DNA pol I 5533聚合作用示意聚合作用示意图3 3 模板模板链 5 5 5533 DNA pol I 不能不能“从无到有从无到有”，只能从已有的多，只能从已有的多核苷酸链的核苷酸链的3-OH端延长端延长DNA链，也就是说必须要链，也就是说必须要有有Primer,Primer必须要有一个游离的必须要有一个游离的3-OH。新链新链的延长只可沿的延长只可沿5 3 方向进行方向进行
24、。PrimerPrimer-OH-OH酶酶的的专专一一性性主主要要表表现现为为新新进进入入的的脱脱氧氧核核苷苷酸酸必必须须与与模模板板DNA配配对对时时才才有有催催化化作作用用。dNTP进进入入结结合合位位点点后后，可可能能使使酶酶的的构构象象发发生生变变化化，促促进进3-OH与与5-PO4结结合合生生成成磷磷酸酸二二酯酯键键。若若是是错错误误的的核核苷苷酸酸进进入入结结合合位位点点，则则不不能能与与模模板板配配对对，无无法法改变酶的构象而被改变酶的构象而被3-5外切酶活性位点所识别并切除之。外切酶活性位点所识别并切除之。2）35外切酶活性外切酶活性校对作用校对作用 这种酶活性的主要功能是从这
25、种酶活性的主要功能是从35方向识别和切方向识别和切除不配对的除不配对的DNA生长链末端的核苷酸。对于生长链末端的核苷酸。对于DNA复复制的忠实性极为重要，但对双链不起作用。制的忠实性极为重要，但对双链不起作用。3 3）5353外切酶活性外切酶活性切除修复作用切除修复作用 从从53方方向向水水解解DNA生生长长链链前前方方的的DNA链链，主主要要产产生生5-脱脱氧氧核核苷苷酸酸。这这种种酶酶活活性性在在DNA损损伤伤的的修修复复中中可可能能起起着着重重要要作作用用。对对冈冈崎崎片片段段5末末端端DNA引引物物的的去去除依赖此种外切酶活性。除依赖此种外切酶活性。5 A G C T T C A G
26、G A T A 3|3 T C G A A G T C C T A G C G A C 53 3 5 5 外切酶活性外切酶活性 5 5 3 3 外切酶活性外切酶活性?能切除突变的能切除突变的 DNA DNA片段片段能辨认错配的碱基对，并将其水解能辨认错配的碱基对，并将其水解核酸外切酶活性核酸外切酶活性 Pol 是由一条分子量为是由一条分子量为88Kd的多肽链组成，它的的多肽链组成，它的活性大约只有活性大约只有pol 活性的活性的5%，也要模板和带，也要模板和带3-OH 的引物，最好的模板是带短的缺口的双链的引物，最好的模板是带短的缺口的双链DNA，有有53聚合酶和聚合酶和35核酸外切酶的活性，
27、但没有核酸外切酶的活性，但没有53核酸外切酶的活性，主要用于核酸外切酶的活性，主要用于DNA的修复的修复。b)Db)DNA Polymerase IINA Polymerase II（DNA pol IIDNA pol II）：）：19701970年和年和19711971年先后分离出年先后分离出pol IIpol II和和pol pol，是由多种蛋白质组成的复合物，每个是由多种蛋白质组成的复合物，每个E.coli约含约含10分子分子DNA pol，但活性很强，为，但活性很强，为pol 的的15倍，倍，模板和模板和pol 大致相同，除聚合酶活性外，还具有大致相同，除聚合酶活性外，还具有35核酸外
28、切酶核酸外切酶的活性，但无的活性，但无53核酸外切酶的核酸外切酶的活性，活性，DNA pol 是原核细胞是原核细胞DNA复制的主要酶复制的主要酶。这。这个酶的缺陷株往往是致死的。个酶的缺陷株往往是致死的。c)DNA polymerase c)DNA polymerase (DNA pol)(DNA pol)：pol 由由十十种种亚亚基基组组成成不不对对称称异异源源二二聚聚体体结结构构，其其中中 亚亚基基具具有有53聚聚合合DNA的的酶酶活活性性，具具有有复复制制DNA的的功功能能；而而 亚亚基基具具有有35外外切切酶酶的的活活性性，与与DNA复复制制的的校正功能有关。校正功能有关。大肠杆菌三种
29、大肠杆菌三种DNADNA聚合酶的比较聚合酶的比较DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶 II IIDNA聚合酶聚合酶 III III分子量分子量103Kd103Kd88Kd88Kd792Kd792Kd不同种类亚基数目不同种类亚基数目1 1 7 7 10 10聚合速度（核苷酸聚合速度（核苷酸/S/S）16-2016-204040250-1000250-10005353聚合酶活性聚合酶活性3535外切酶活性外切酶活性5353外切酶活性外切酶活性功能功能 校正，修复，校正，修复，去除去除RNARNA引物引物修复修复复制（复制（5353聚合作用）聚合作用）19991999年发现年发现DNA polyme
30、raseIVDNA polymeraseIV和和V V，它们涉及它们涉及DNADNA的错误倾向修复的错误倾向修复n复复制制时时必必需需解解链链，如如靠靠旋旋转转，则则大大肠肠杆杆菌菌DNADNA要要达达到到每每分分钟钟60006000转转。DNADNA分分子子的的碱碱基基埋埋在在双双螺螺旋旋内内部部，只有把只有把DNADNA解成单链，它才能起模板作用。解成单链，它才能起模板作用。n复制时是用解螺旋酶和拓扑异构酶来解链的。复制时是用解螺旋酶和拓扑异构酶来解链的。3.2.2 3.2.2 解链酶解链酶(又称解螺旋酶又称解螺旋酶,helicase),helicase)利用利用 ATPATP 供能，作用
31、于氢键，供能，作用于氢键，使使DNADNA双链解开成双链解开成为两条单链。为两条单链。SSBSSBDna BDna C解链方向3.2.2 3.2.2 解链酶解链酶(又称解螺旋酶又称解螺旋酶,helicase),helicase)解链酶作用：断裂互补碱基间的氢键作用：断裂互补碱基间的氢键,使使DNADNA双链分离形成双链分离形成“复制叉复制叉”。1010 8 8 局部解链后局部解链后拓扑异构酶作用特点：拓扑异构酶作用特点：既能水解既能水解 、又能连接磷酸二酯键、又能连接磷酸二酯键解解链链过过程程中中，DNA分分子子会会过过度度拧拧紧紧、打打结结、缠缠绕绕、连连环环等等现现象象，均均需需DNA拓拓
32、扑扑异异构构酶酶，改改变变DNA分分子子构象，理顺构象，理顺DNA链，使复制能顺利进行。链，使复制能顺利进行。分类：分类：拓扑异构酶拓扑异构酶 拓扑异构酶拓扑异构酶3.2.3 3.2.3 拓扑异构酶拓扑异构酶（topoisomerase,Topo）拓扑异拓扑异构酶构酶切断切断DNA双链中双链中一股一股链，使链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，闭切口，DNA变为松弛状态变为松弛状态。反应反应不需不需ATP。拓扑异拓扑异构酶构酶切断切断DNA分子分子两股两股链，断端通过链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。切口旋转使超螺旋松弛。利用利用ATP供能，连接断端，供能
33、，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。分子进入负超螺旋状态。DNA拓扑异构酶的作用机制拓扑异构酶的作用机制 3.2.4 单链单链DNA结合蛋白结合蛋白（single strand binding protein,SSB）螺螺旋旋酶酶沿沿复复制制叉叉方方向向解解开开的的单单链链DNADNA，会会很很快快与与单单链链DNADNA结结合合蛋蛋白白结结合合，防防止止其其重重新新配配对对形形成成双双链链DNADNA或或被被核核酸酸酶酶降降解解。SSBSSB结结合合到到单单链链DNADNA上上后后，使使其其呈呈伸伸展展状状态态，没没有有弯弯曲曲和和结结节节，有有利利于于单单链链DNADNA作作为为模模板
34、板。SSBSSB可可以以重重复复使使用用，当当新新生生的的DNADNA链链合合成成到到某一位置时，该处的某一位置时，该处的SSBSSB便会脱落，并被重复利用。便会脱落，并被重复利用。连连接接DNA链链 3-OH末末端端和和相相邻邻DNA链链5-P末末端端，使使二二者者生生成成磷磷酸酸酯酯键键，从从而而把把两两段段相相邻邻的的DNA链链连连接接成成完完整的链。整的链。ATPOH POH P3.2.5 DNA连接酶连接酶(DNA ligase)功能功能DNA连接酶在复制中起最后连接酶在复制中起最后接合切口的作用接合切口的作用。在在DNA修复、重组及剪接中也起缝合切口作用。修复、重组及剪接中也起缝合
35、切口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。也是基因工程的重要工具酶之一。连连接接酶酶连连接接切切口口MgMg2+2+连接酶连接酶ATPATP或或NADNADAMP+PPiAMP+PPi或或NMN+AMPNMN+AMPATCGP PTTP PP PP PAACCTGAP PACP PP PP PP POHOHTGGATCGP PTTP PP PP PAACCTGAP PACP PP PP PTGGP P切口切口3333555555553333模板链模板链模板链模板链3.2.6 引物酶引物酶(Primase)53 5RNA引物引物55RNA引物引物3 DNA不能从无不能从无有合成，需在一小段有合成，
36、需在一小段RNA引物基引物基础上合成上合成DNA。RNA引物引物的合成的合成需引物酶，它是一种特殊的需引物酶，它是一种特殊的RNA聚合酶，聚合酶，可合成可合成6-10个碱基的个碱基的RNA引物。引物。酶或蛋白或蛋白质 主要作用主要作用 DNADNA聚合聚合酶 水解引物、填水解引物、填补空隙、修复作用空隙、修复作用DNADNA聚合聚合酶 DNA DNA复制复制 解解链酶类 解开解开DNADNA双双链单链DNADNA结合蛋白合蛋白 维持已解开持已解开单链DNADNA的的稳定定拓扑异构拓扑异构酶类 克服解克服解链时打打结及及缠绕、松、松驰或或 引引进负超螺旋超螺旋 DNADNA连接接酶 催化双催化双
37、链DNADNA中中单链切口的切口的连接接引物引物酶 合成合成RNARNA引物引物 参与参与DNADNA复制的酶及蛋白质复制的酶及蛋白质 nDNA分子的两条链是反向平行的分子的两条链是反向平行的3-5 和和5-3，但是复制的方向只能是，但是复制的方向只能是5-3不连续的不连续的滞后链的片段叫作滞后链的片段叫作冈崎片段冈崎片段（Okazaki fragmentOkazaki fragment）3.3 3.3 岡崎片段和半不连续复制岡崎片段和半不连续复制n在在DNADNA复制时，复制时，1 1条链的合成方向和复条链的合成方向和复制叉的前进方向相同，可连续复制，称制叉的前进方向相同，可连续复制，称为为
38、前导链前导链（leading strandleading strand）；而另一条链的合成方向和复制叉的前进方向而另一条链的合成方向和复制叉的前进方向正好相反，不能连续复制，只能分成几个片正好相反，不能连续复制，只能分成几个片段合成，称为段合成，称为滞后链滞后链（lagging strand)lagging strand)5 53 33 3 5 5 3 3 5 5 解链方向解链方向复制的半不连续性复制的半不连续性3 3 5 5 3 3 5 5 解链方向解链方向3 35 53 33 35 53 3 5 5 3 3 5 5 解链方向解链方向 复制方向与解链方向相反，须等待解开足够复制方向与解链方向
39、相反，须等待解开足够长度的模板链才能继续复制长度的模板链才能继续复制 ，所得到一条由不，所得到一条由不连续片段组成的子链。连续片段组成的子链。随从链随从链(lagging strand)(lagging strand)冈崎片段冈崎片段（Okazaki fragment Okazaki fragment）3 35 53 33 35 5大肠杆菌大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列复制起点成串排列的重复序列DnaADnaB(解螺旋酶解螺旋酶)SSB大肠杆菌大肠杆菌DNA复制起点在起始阶段的结构模型复制起点在起始阶段的结构模型3.4.1 3.4.1 复制的起始复制的起始3.4 3.4 原核生物双链原核生
40、物双链DNADNA复制过程复制过程nDNA复制的起始阶段，由下列两步构成：复制的起始阶段，由下列两步构成：1解旋解链，形成复制叉解旋解链，形成复制叉nDnaA蛋蛋白白辨辨认认起起始始点点，由由拓拓扑扑异异构构酶酶和和解解链链酶酶作作用用，使使DNA的的超超螺螺旋旋及及双双螺螺旋旋结结构构解解开开，碱基间氢键断裂，形成两条单链碱基间氢键断裂，形成两条单链DNA。n单单链链DNA结结合合蛋蛋白白（SSB）四四聚聚体体结结合合在在两两条条单单链链DNA上上，形形成成复复制制叉叉（replication fork）。2引发体组装和引物合成引发体组装和引物合成n在在E.coli中中，由由解解螺螺旋旋酶酶
41、(DnaB蛋蛋白白)、DnaC蛋蛋白白(协协助助DnaB)、引引物物酶酶(DnaG蛋蛋白白)和和DNA复制起始区域形成复制起始区域形成引发体引发体(primosome)；n在在引引物物酶酶的的催催化化下下，以以DNA为为模模板板，合合成成一一段段短短的的RNA片片段段，从从而而获获得得3端端自自由由羟羟基基（3-OH）。）。引发体的组装引发体的组装Dna ADna B、Dna CDNA拓扑异构酶拓扑异构酶引物酶引物酶OHSSB3 5 3 5 5 5 3 35 5dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-polDNADNA复制的延长过程复制的延长过程
42、复制起点解开后形成复制起点解开后形成2 2个复制叉，进行双向复制，前导链个复制叉，进行双向复制，前导链和滞后链的合成都需要和滞后链的合成都需要RNARNA引物，前导链先由引发酶在起点处引物，前导链先由引发酶在起点处合成一段合成一段RNARNA引物，随后引物，随后DNA pol IIIDNA pol III即在引物上加脱氧核苷即在引物上加脱氧核苷酸酸。前导链的合成。前导链的合成与复制叉的移动保持同步与复制叉的移动保持同步。a)前前导链的合成导链的合成3.4.2 DNA3.4.2 DNA的延伸的延伸 后随链的合成是分段进行的，需要不断合成冈崎片段的后随链的合成是分段进行的，需要不断合成冈崎片段的R
43、NARNA引物，然后由引物，然后由DNA pol IIIDNA pol III加入脱氧核苷酸。加入脱氧核苷酸。b)b)滞后链的合成滞后链的合成 滞后链的合成比较复杂，由于滞后链的合成比较复杂，由于DNADNA的两条互补链方向相的两条互补链方向相反，为使滞后链能与前导链被同一个反，为使滞后链能与前导链被同一个DNA pol IIIDNA pol III不对称二不对称二聚体所合成，聚体所合成，后随链必须绕成一个环状后随链必须绕成一个环状（looploop）。）。后随链后随链前导链前导链DNADNA聚合酶聚合酶催化先导链和随从链同时合成催化先导链和随从链同时合成复复制制过过程程简简图图 复制的终止复
44、制的终止n在复制过程中形成的在复制过程中形成的RNA引物，需由引物，需由RNA酶酶来水解来水解去除；去除；nRNA引物水解后遗留的缺口，由引物水解后遗留的缺口，由DNA聚合酶聚合酶（原（原核生物）或核生物）或DNA聚合酶聚合酶（真核生物）催化延长缺（真核生物）催化延长缺口处的口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。（1）去除引物，填补缺口）去除引物，填补缺口：（2）连接冈崎片段：）连接冈崎片段：n在在DNA连接酶的催化下，生成最后一个磷酸酯键，连接酶的催化下，生成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。长
45、链。5 5 5 RNA酶酶OH P5 DNA-pol dNTP5 5 PATP ADP+Pi5 5 DNA连接酶连接酶 随从链上不连续性片段的连接随从链上不连续性片段的连接n解旋解旋：由：由拓扑异构酶拓扑异构酶解除解除DNA的超螺旋结构。的超螺旋结构。n解链解链：由：由解链酶解链酶使双链使双链DNA解开再由单链结合蛋白解开再由单链结合蛋白与单链结合，防止氢键再形成。与单链结合，防止氢键再形成。n识别起点识别起点：由：由DNA指导的指导的RNA聚合酶即聚合酶即引物酶引物酶完完成。成。n生成引物生成引物：以：以DNA为模板在为模板在引物酶引物酶催化下由催化下由DNA转录成。转录成。nDNA的生成的
46、生成：在：在RNA引物引物3末端上按碱基互补原则末端上按碱基互补原则经经DNA聚合酶聚合酶III催化生成，其催化生成，其3末端与下一个末端与下一个RNA引物引物5末端相连。末端相连。3.4.4 DNA3.4.4 DNA合成步骤总结合成步骤总结n切除引物切除引物：由：由DNA聚合酶聚合酶I催化切除引物催化切除引物n补齐封口补齐封口：DNA聚合酶聚合酶I利用其利用其DNA聚合酶活性聚合酶活性按碱基互补原则沿按碱基互补原则沿5-3方向填补两个冈崎片段方向填补两个冈崎片段之间的缺口。其之间的缺口。其3末端羟基与下一个末端羟基与下一个DNA片段片段5末端相连磷酸基，在末端相连磷酸基，在DNA连结酶连结酶
47、催化下形成磷催化下形成磷酸二酯键而被连结起来，最终形成酸二酯键而被连结起来，最终形成DNA模板链模板链的完整新的互补链，此部由的完整新的互补链，此部由NAD+供能。供能。G1G2SM哺乳动物的细胞周期哺乳动物的细胞周期DNA合成合成(synthesis)期期4 4 真核细胞真核细胞DNADNA的复制的复制细胞能否分裂，取决于进入细胞能否分裂，取决于进入S期及期及M期这两个关键点。期这两个关键点。G1S及及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关。的调节，与蛋白激酶活性有关。蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。调控作用。4.1 4.1 真
48、核细胞真核细胞DNADNA多个起点复制多个起点复制4.2 真核细胞中真核细胞中DNA聚合酶的性质聚合酶的性质 定位定位细胞核细胞核 细胞核细胞核线粒体线粒体细胞核细胞核细胞核细胞核聚合作用：聚合作用：53 53 外切酶活性外切酶活性3535功能功能复制复制引发引发修复修复线粒体线粒体DNADNA合成合成核核DNADNA合成合成修复修复4.3 真核生物的复制终止真核生物的复制终止1 1，染色体，染色体DNADNA呈线状，复制在末端停止呈线状，复制在末端停止5555水解、聚合、连接水解、聚合、连接55552 2，连接不连续片段，连接不连续片段n端粒（端粒（telomere）是指是指真核生物染色体线
49、性真核生物染色体线性DNA分子末端的结构分子末端的结构部分，通常膨大成粒部分，通常膨大成粒状。状。4.4 端粒端粒以表彰他们“发现端粒和端粒酶是如何保护染色体的”。伊丽莎白伊丽莎白布莱克本布莱克本卡萝尔卡萝尔格雷德格雷德杰克杰克绍斯塔克绍斯塔克功能功能 维持染色体的稳定性维持染色体的稳定性 保证保证DNA复制的完整性复制的完整性端粒的结构特点端粒的结构特点 由末端单链由末端单链DNA序列和蛋白质构成。序列和蛋白质构成。末端末端DNA序列是多次重复的富含序列是多次重复的富含G、T碱基碱基的短的短 序列。序列。TTTTGGGGTTTTGGGGn线性线性DNA在复制完成后，其末端由于引物在复制完成后
50、，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶端粒酶（telomerase）的催化下，进行延长反应。的催化下，进行延长反应。端端粒粒酶酶是是一一种种RNA-蛋蛋白白质质复复合合体体，它它可可以以其其RNA为为模模板板，通通过过逆逆 转转 录录 过过 程程 对对 末末 端端DNA链进行延长。链进行延长。端粒酶的分子结构端粒酶的分子结构端粒酶的爬行模型（动画演示）端粒酶的爬行模型（动画演示）端粒酶的催端粒酶的催化延长作用化延长作用爬爬行行模模型型DNADNA聚合酶复制子链聚合酶复制子链进一步加工进一步加工真核和原核真核和原核DNADNA细胞复制比较细胞复制