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1、 多肽和蛋白质多肽和蛋白质 第第 一一 章章 从基因到蛋白质从基因到蛋白质 本章内容本章内容1蛋白质基础知识蛋白质基础知识2多肽的化学生物学多肽的化学生物学3蛋白质化学合成蛋白质化学合成4蛋白质修饰和蛋白质药物蛋白质修饰和蛋白质药物一、什么是蛋白质一、什么是蛋白质?蛋蛋白白质质(protein)是是由由许许多多氨氨基基酸酸(amino acids)通通过过肽肽键键(peptide bond)相相连连形形成成的的高高分子含氮化合物。分子含氮化合物。二、蛋白质的生物学重要性二、蛋白质的生物学重要性1.蛋白质是生物蛋白质是生物 体重要组成成分体重要组成成分分分布布广广：所所有有器器官官、组组织织都都
2、含含有有蛋蛋白白质质；细胞的各个部分都含有蛋白质。细胞的各个部分都含有蛋白质。含含量量高高：蛋蛋白白质质是是细细胞胞内内最最丰丰富富的的有有机机分分子子，占占人人体体干干重重的的45，某某些些组组织织含含量量更更高高，例如脾、肺及横纹肌等高达例如脾、肺及横纹肌等高达80。1 1）作为生物催化剂（酶）作为生物催化剂（酶）2 2）代谢调节作用）代谢调节作用3 3）免疫保护作用）免疫保护作用4 4）物质的转运和存储）物质的转运和存储5 5）运动与支持作用）运动与支持作用6 6）参与细胞间信息传递）参与细胞间信息传递2.蛋白质具有重要的生物学功能蛋白质具有重要的生物学功能多肽和蛋白质基础知识多肽和蛋白
3、质基础知识第第 一一 节节 组成蛋白质的元素组成蛋白质的元素主要有主要有C、H、O、N和和S。有些蛋白质含有少量有些蛋白质含有少量磷磷或金属元素或金属元素铁、铁、铜、锌、锰、钴、钼铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有，个别蛋白质还含有碘碘。蛋蛋 白白 质质 的的 分分 子子 组组 成成1 1 氨基酸氨基酸 组成蛋白质的基本单位组成蛋白质的基本单位存存在在自自然然界界中中的的氨氨基基酸酸有有300余余种种，但但组组成成人人体体蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸酸仅仅有有20种种，且且均均属属 L-氨基酸氨基酸（甘氨酸除外）。（甘氨酸除外）。L-L-氨基酸的通式氨基酸的通式R1.非极性疏水性氨基酸非极性疏
4、水性氨基酸2.极性中性氨基酸极性中性氨基酸3.酸性氨基酸酸性氨基酸4.碱性氨基酸碱性氨基酸（一）氨基酸的分类（一）氨基酸的分类*2020种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下:甘氨酸甘氨酸 glycine Gly G 5.97丙氨酸丙氨酸 alanine Ala A 6.00缬氨酸缬氨酸 valine Val V 5.96亮氨酸亮氨酸 leucine Leu L 5.98 异亮氨酸异亮氨酸 isoleucine Ile I 6.02 苯丙氨酸苯丙氨酸 phenylalanine Phe F 5.48脯氨酸脯氨酸 proline Pro P 6.301.非极
5、性疏水性氨基酸非极性疏水性氨基酸色氨酸色氨酸 tryptophan Try W 5.89丝氨酸丝氨酸 serine Ser S 5.68酪氨酸酪氨酸 tyrosine Try Y 5.66 半胱氨酸半胱氨酸 cysteine Cys C 5.07 蛋氨酸蛋氨酸 methionine Met M 5.74天冬酰胺天冬酰胺 asparagine Asn N 5.41 谷氨酰胺谷氨酰胺 glutamine Gln Q 5.65 苏氨酸苏氨酸 threonine Thr T 5.602.极性中性氨基酸极性中性氨基酸天冬氨酸天冬氨酸 aspartic acid Asp D 2.97谷氨酸谷氨酸 glut
6、amic acid Glu E 3.22赖氨酸赖氨酸 lysine Lys K 9.74精氨酸精氨酸 arginine Arg R 10.76组氨酸组氨酸 histidine His H 7.593.酸性氨基酸酸性氨基酸4.碱性氨基酸碱性氨基酸几种特殊氨基酸几种特殊氨基酸 脯氨酸脯氨酸（亚氨基酸）（亚氨基酸）半胱氨酸半胱氨酸 +胱氨酸胱氨酸二硫键二硫键-HH二硫键与蛋白质折叠二硫键与蛋白质折叠（二）氨基酸的理化性质（二）氨基酸的理化性质1.两性解离及等电点两性解离及等电点等电点等电点(isoelectric point,pI)在在某某一一pH的的溶溶液液中中，氨氨基基酸酸解解离离成成阳阳离离子
7、子和和阴阴离离子子的的趋趋势势及及程程度度相相等等，成成为为兼兼性性离离子子，呈呈电电中中性性。此此时时溶溶液液的的pH值值称为该氨基酸的称为该氨基酸的等电点等电点。pH=pI+OH-pHpI+H+OH-+H+pHpI氨基酸的兼性离子氨基酸的兼性离子 阳离子阳离子阴离子阴离子2.紫外吸收紫外吸收 色氨酸、酪氨酸的色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在最大吸收峰在 280 nm 附近。附近。大大多多数数蛋蛋白白质质含含有有这这两两种种氨氨基基酸酸残残基基，所所以以 测测 定定 蛋蛋 白白 质质 溶溶 液液280nm的的光光吸吸收收值值是是分分析析溶溶液液中中蛋蛋白白质质含含量量的的快快 速速 简简 便便
8、的的 方方 法法。1mg/ml芳香族氨基酸的紫外吸收芳香族氨基酸的紫外吸收 肽肽键键(peptide bond)是是由由一一个个氨氨基基酸酸的的-羧羧基基与与另另一一个个氨氨基基酸酸的的-氨氨基基脱脱水水缩合而形成的化学键。缩合而形成的化学键。2 2 肽肽肽肽(peptide)(peptide)+-HOH甘氨酰甘氨酸甘氨酰甘氨酸肽键*肽是由氨基酸通过肽是由氨基酸通过肽键肽键缩合而形成的化缩合而形成的化合物。合物。*两分子氨基酸缩合形成两分子氨基酸缩合形成二肽二肽，三分子氨，三分子氨基酸缩合则形成基酸缩合则形成三肽三肽*肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不
9、全，被称为全，被称为氨基酸残基氨基酸残基(residue)。*由由1515个个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成由更多的氨基酸相连形成由更多的氨基酸相连形成由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽的肽称多肽(polypeptide)。N 末端：多肽链中有末端：多肽链中有自由氨基自由氨基的一端的一端C 末端：多肽链中有末端：多肽链中有自由羧基自由羧基的一端的一端多肽链有两端多肽链有两端*多多肽肽链链(polypeptide chain)是是指指许许多多氨氨基基酸之间以肽键连接而成的一种结构。酸之间以肽键连接而成的一种结构。N末
10、端末端C末端末端牛核糖核酸酶牛核糖核酸酶豌豆豌豆 defensin 1 三维结构三维结构NC常用的蛋白质信息网站常用的蛋白质信息网站Expert Protein Analysis Systemhttp:/Protein Data Bank lhttp:/体内许多激素属寡肽或多肽体内许多激素属寡肽或多肽 神经肽神经肽(neuropeptide)（二）（二）几种生物活性肽几种生物活性肽3 蛋白质和多肽的分类蛋白质和多肽的分类 *根据蛋白质组成成分根据蛋白质组成成分根据蛋白质组成成分根据蛋白质组成成分 单纯蛋白质单纯蛋白质结合蛋白质结合蛋白质 =蛋白质部分蛋白质部分 +非蛋白质部分非蛋白质部分*根据
11、蛋白质形状根据蛋白质形状根据蛋白质形状根据蛋白质形状 纤维状蛋白质纤维状蛋白质球状蛋白质球状蛋白质 肽的分类肽的分类按来源分：按来源分：按来源分：按来源分：a.a.核糖体多肽：由核糖体多肽：由核糖体多肽：由核糖体多肽：由mRNAmRNA翻译合成，包括激素和翻译合成，包括激素和翻译合成，包括激素和翻译合成，包括激素和信号分子。信号分子。信号分子。信号分子。b.b.非核糖体多肽：非核糖体多肽酶催化合成，如非核糖体多肽：非核糖体多肽酶催化合成，如非核糖体多肽：非核糖体多肽酶催化合成，如非核糖体多肽：非核糖体多肽酶催化合成，如谷胱甘肽。谷胱甘肽。谷胱甘肽。谷胱甘肽。c.c.合成多肽合成多肽合成多肽合成
12、多肽按肽链骨架来源分按肽链骨架来源分线性肽线性肽环形肽环形肽蛋白质的分子结构包括蛋白质的分子结构包括蛋白质的分子结构包括蛋白质的分子结构包括 一级结构一级结构(primary structure)二级结构二级结构(secondary structure)三级结构三级结构(tertiary structure)四级结构四级结构(quaternary structure)高级高级结构结构4 蛋蛋 白白 质质 的的 分分 子子 结结 构构定义定义定义定义 蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。蛋白质的一级结
13、构指多肽链中氨基酸的排列顺序。3.1 3.1 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构主要的化学键主要的化学键肽键肽键肽键肽键，有些蛋白质还包括二硫键。，有些蛋白质还包括二硫键。，有些蛋白质还包括二硫键。，有些蛋白质还包括二硫键。一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。功能的基础。3.2 蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质分分分分子子子子中中中中某某某某一一一一段段段段肽肽肽肽链链链链的的的的局局局局部部部部空空空空间间间间结结结结构构构构，即即即即该该该该段段段段肽肽肽肽链链链链主主主主链链链链骨骨骨骨架架架架原原原原子子子子的的的的
14、相相相相对对对对空空空空间间间间位位位位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象 。定义定义 主要的化学键主要的化学键：氢键氢键 蛋白质二级结构的主要形式蛋白质二级结构的主要形式 -螺旋螺旋螺旋螺旋 (-helix)-helix)-折叠折叠折叠折叠 (-pleated sheet)-pleated sheet)-转角转角转角转角 (-turn)-turn)无规卷曲无规卷曲无规卷曲无规卷曲 (random coil)(random coil)（二）（二）-螺旋螺旋目目 录录（三）（三）-折叠折叠 模体模体模体
15、模体(motif)(motif)在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象。空间构象。空间构象。空间构象。钙结合蛋白中结合钙离子的模体钙结合蛋白中结合钙离子的模体 -Beta Helices 无规卷曲无规卷曲3.3 蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构疏水键、离子键、氢键和疏水键、离子
16、键、氢键和 Van der Waals力等。力等。主要的化学键主要的化学键整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置,即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。（一）（一）定义定义 肌红蛋白肌红蛋白(Mb)N 端端 C端端纤连蛋白分子的结构域纤连蛋白分子的结构域纤连蛋白分子的结构域纤连蛋白分子的结构域 （二）结构域（二）结构域大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行使
17、个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行使个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行使个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行使其功能，称为结构域其功能，称为结构域其功能，称为结构域其功能，称为结构域(domain)(domain)。亚基之间的结合力主要是亚基之间的结合力主要是疏水作用疏水作用疏水作用疏水作用，其次，其次是氢键和离子键。是氢键和离子键。3.4 3.4 蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级触部位的布
18、局和相互作用，称为蛋白质的四级触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。结构。结构。结构。有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的质的亚基亚基 (subunit)。一级一级 二级二级 三级三级 四级四级 卷曲螺旋卷曲螺旋(coiled coil)（一）一级结构是空间构象的基础（一）一级结构是空间构象的基础 3.5 蛋白质一级结构与功能的关系蛋白质一级结构与功能的关系 牛核糖核酸酶的牛核糖核酸酶的一级结构一级结构二二二二硫硫硫硫键键键键
19、天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、尿素、尿素、-巯基乙醇巯基乙醇巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性（二）一级结构与功能的关系（二）一级结构与功能的关系例：镰刀形红细胞贫血例：镰刀形红细胞贫血例：镰刀形红细胞贫血例：镰刀形红细胞贫血 毛细血管堵塞毛细血管堵塞毛细血管堵塞毛细血管堵塞 N-val his leu thr pro glu glu C(146)HbS 肽链肽链HbA 肽肽 链链N-val his leu thr pro val glu C(146)这种由蛋白质分子发生变异所
20、导致的疾病，称这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为为为为“分子病分子病分子病分子病”。（一）肌红蛋白与血红蛋白的结构（一）肌红蛋白与血红蛋白的结构 3.6 蛋白质空间结构与功能的关系蛋白质空间结构与功能的关系 Hb与与Mb一一样样能能可可逆逆地地与与O2结结合合，Hb与与O2结结合合后后称称为为氧氧合合Hb。氧氧合合Hb占占总总Hb的的百百分分数（数（称百分饱和度称百分饱和度）随）随O2浓度变化而改变。浓度变化而改变。（二）血红蛋白的构象变化与结合氧（二）血红蛋白的构象变化与结合氧 （三）蛋白质构象改变与疾病
21、（三）蛋白质构象改变与疾病 蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质构构构构象象象象疾疾疾疾病病病病：若若若若蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的折折折折叠叠叠叠发发发发生生生生错错错错误误误误，尽尽尽尽管管管管其其其其一一一一级级级级结结结结构构构构不不不不变变变变，但但但但蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的构构构构象象象象发发发发生生生生改改改改变变变变，仍仍仍仍可可可可影影影影响响响响其其其其功功功功能能能能，严严严严重重重重时时时时可可可可导导导导致疾病发生。致疾病发生。致疾病发生。致疾病发生。有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成有些蛋
22、白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。变。变。变。这类疾病包括：老年痴呆症、疯牛病等。这类疾病包括：老年痴呆症、疯牛病等。这类疾病包括：老年痴呆症、疯牛病等。这类疾病包括：老年痴呆症、疯牛病等。蛋白质构象改变导致疾病的机理：蛋白质构象改变导致疾病的机理：疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病
23、中的蛋白质构象改变疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白疯牛病是由朊病毒蛋白疯牛病是由朊病毒蛋白疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein,PrP)(prion protein,PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。引起的一组人和动物神经退行性病变。引起的一组人和动物神经退行性病变。引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的正常的正常的正常的PrPPrP富含富含富含富含-螺旋，称为螺旋，称为螺旋，称为螺旋，称为PrPPrPc c。PrPPrPc c在某种未知蛋白质的作用下可转变成全在某种未知蛋白质的作用下可转变成全在某种未知蛋白质的作用下可转变成全在某种未
24、知蛋白质的作用下可转变成全为为为为-折叠的折叠的折叠的折叠的PrPPrPscsc，从而致病。，从而致病。，从而致病。，从而致病。PrPc-螺旋螺旋PrPsc-折叠折叠正常正常疯牛病疯牛病4 蛋白质的分离和纯化蛋白质的分离和纯化（一）透析及超滤法（一）透析及超滤法*透析透析透析透析(dialysis)(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。分开的方法。分开的方法。分开的方法。*超滤法超滤法超滤法超滤法 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定应用正压或离心
25、力使蛋白质溶液透过有一定应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。的。的。的。（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀 *使使用用丙丙酮酮沉沉淀淀时时，必必须须在在04低低温温下下进进行行，丙丙酮酮用用量量一一般般10倍倍于于蛋蛋白白质质溶溶液液体体积积。蛋蛋白白质质被被丙丙酮酮沉沉淀淀后后，应应立立即即分分离离。除除了了丙丙酮酮以以外，也可用乙醇沉淀。外，也可用乙醇沉淀
26、。*盐盐析析(salt precipitation)是是将将硫硫酸酸铵铵、硫硫酸酸钠钠或或氯氯化化钠钠等等加加入入蛋蛋白白质质溶溶液液，使使蛋蛋白白质质表表面面电电荷荷被被中中和和以以及及水水化化膜膜被被破破坏坏，导导致致蛋蛋白白质质沉沉淀。淀。*免疫沉淀法：免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。离获得抗原蛋白。（三）电泳（三）电泳蛋蛋蛋蛋白白
27、白白质质质质在在在在高高高高于于于于或或或或低低低低于于于于其其其其pIpIpIpI的的的的溶溶溶溶液液液液中中中中为为为为带带带带电电电电的的的的颗颗颗颗粒粒粒粒，在在在在电电电电场场场场中中中中能能能能向向向向正正正正极极极极或或或或负负负负极极极极移移移移动动动动。这这这这种种种种通通通通过过过过蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质在在在在电电电电场场场场中中中中泳泳泳泳动动动动而而而而达达达达到到到到分分分分离离离离各各各各种种种种蛋蛋蛋蛋白白白白质的技术质的技术质的技术质的技术,称为电泳称为电泳称为电泳称为电泳(elctrophoresis)(elctrophoresis)。根根据据支支撑撑物物
28、的的不不同同，可可分分为为薄薄膜膜电电泳泳、凝凝胶电泳等。胶电泳等。几种重要的蛋白质电泳几种重要的蛋白质电泳几种重要的蛋白质电泳几种重要的蛋白质电泳*SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。分子量的测定。分子量的测定。分子量的测定。双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术 pI（四）层析（四）层析层析层析(chromatography)分离蛋白质的原理分离蛋白质的原理待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固待分
29、离蛋白质溶液（流动相）经过一个固待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的速度流经固定相而
30、达到分离蛋白质的目的速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。蛋白质分离常用的层析方法蛋白质分离常用的层析方法蛋白质分离常用的层析方法蛋白质分离常用的层析方法*离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。质不同进行分离。质不同进行分离。质不同进行分离。*凝胶过滤凝胶过滤凝胶过滤凝胶过滤(gel filtration)(gel filtration)又称分子筛层析，利又称分子筛层析，利又称分子筛层析，利又称分子筛层析，利用用用用各各各各蛋白
31、质分子大小不同分离。蛋白质分子大小不同分离。蛋白质分子大小不同分离。蛋白质分子大小不同分离。（五）超速离心（五）超速离心*超超超超速速速速离离离离心心心心法法法法(ultracentrifugation)(ultracentrifugation)既既既既可可可可以以以以用用用用来来来来分分分分离离离离纯纯纯纯化化化化蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质也也也也可可可可以以以以用用用用作作作作测测测测定定定定蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的分子量。的分子量。的分子量。的分子量。5 多肽链中氨基酸序列分析多肽链中氨基酸序列分析分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成测定多肽链的氨基末端与羧基
32、末端为何种氨基酸残基测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基把肽链水解成片段，分别进行分析把肽链水解成片段，分别进行分析测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法降解法一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。基酸顺序的结果。Edman降解降解异硫氰酸苯酯异硫氰酸苯酯 6 蛋白质空间结构测定蛋白质空间结构测定二级结构测定二级结构测定通通常常采采用用圆圆二二色色光光谱谱(circular
33、dichroism，CD)测测定定溶溶液液状状态态下下的的蛋蛋白白质质二二级级结结构构含含量量。-螺螺旋旋的的CD峰峰有有222 nm处处的的负负峰峰、208nm处处的的负负峰峰和和198 nm处处的的正正峰峰三三个个成成分分；而而-折折叠叠的的CD谱不很固定。谱不很固定。三级结构测定三级结构测定X射线衍射法射线衍射法(X-ray diffraction)核磁共振技术核磁共振技术(NMR)多肽的化学生物学多肽的化学生物学第第 二二 节节研究集中领域研究集中领域l多肽的化学生物学多肽的化学生物学l蛋白质化学合成蛋白质化学合成l蛋白质修饰和蛋白质药物蛋白质修饰和蛋白质药物2.1 多肽的化学合成多肽
34、的化学合成1.肽键形成原理和保护基肽键形成原理和保护基 原理：多肽的合成就是形成肽键的过程，即一个氨基原理：多肽的合成就是形成肽键的过程，即一个氨基原理：多肽的合成就是形成肽键的过程，即一个氨基原理：多肽的合成就是形成肽键的过程，即一个氨基 酸（酸（酸（酸（AAAAAAAA）氨基亲核进攻另一个氨基酸被活化的）氨基亲核进攻另一个氨基酸被活化的）氨基亲核进攻另一个氨基酸被活化的）氨基亲核进攻另一个氨基酸被活化的 羧基部分，形成肽键。羧基部分，形成肽键。羧基部分，形成肽键。羧基部分，形成肽键。氨基酸的活性基团必须进行保护。氨基酸的活性基团必须进行保护。肽键形成步骤肽键形成步骤1.1.制备部分保护的氨
35、基酸，形成只有单一活性位制备部分保护的氨基酸，形成只有单一活性位制备部分保护的氨基酸，形成只有单一活性位制备部分保护的氨基酸，形成只有单一活性位点的氨基酸衍生物；点的氨基酸衍生物；点的氨基酸衍生物；点的氨基酸衍生物；2.2.将氨基保护的氨基酸羧基部分活化，形成活性将氨基保护的氨基酸羧基部分活化，形成活性将氨基保护的氨基酸羧基部分活化，形成活性将氨基保护的氨基酸羧基部分活化，形成活性中间体，再与自由氨基反应形成酰胺键；中间体，再与自由氨基反应形成酰胺键；中间体，再与自由氨基反应形成酰胺键；中间体，再与自由氨基反应形成酰胺键；3.3.脱除氨基酸的保护基。脱除氨基酸的保护基。脱除氨基酸的保护基。脱除
36、氨基酸的保护基。R1PGOHOH2N选择性保护选择性保护选择性保护选择性保护R1OHONH活化活化PGR1NH OXR2OHOH2NPGNHR1OHNR2OHO选择性脱除选择性脱除选择性脱除选择性脱除PGPG保护基（保护基（Protection Groups）l l临时性保护基：在下一个肽键形成前脱除，一临时性保护基：在下一个肽键形成前脱除，一般用于氨基或羧基的暂时性的保护，脱除不影般用于氨基或羧基的暂时性的保护，脱除不影响半永久性保护基。响半永久性保护基。l l半永久性保护基：一般用于侧链的保护，在目半永久性保护基：一般用于侧链的保护，在目标序列合成后去除。标序列合成后去除。l l种类：叔丁
37、氧羰基种类：叔丁氧羰基 Boc 9-芴甲氧羰基芴甲氧羰基 Fmoc 2.化学合成多肽的发展历程化学合成多肽的发展历程l早期：液相合成早期：液相合成 1901，德国化学家，德国化学家Fischer合成了合成了Gly-Gly 20世纪中期，合成活性肽，如催产素、胰岛素。世纪中期，合成活性肽，如催产素、胰岛素。1963年，年，Merrifield提出了固相合成（提出了固相合成（SPPS），），1984年诺贝尔奖。在年诺贝尔奖。在1966年发明了第一台自动的年发明了第一台自动的固相肽合成仪。固相肽合成仪。3.液相多肽合成液相多肽合成优点：成本低，目前一些的商业肽制备中有应用。优点：成本低，目前一些的商
38、业肽制备中有应用。优点：成本低，目前一些的商业肽制备中有应用。优点：成本低，目前一些的商业肽制备中有应用。缺点：缺点：缺点：缺点：a)a)肽片段在有机溶剂中溶解度小；肽片段在有机溶剂中溶解度小；肽片段在有机溶剂中溶解度小；肽片段在有机溶剂中溶解度小；b)b)为提高产率，每步缩合过程中氨基酸片段过量，为提高产率，每步缩合过程中氨基酸片段过量，为提高产率，每步缩合过程中氨基酸片段过量，为提高产率，每步缩合过程中氨基酸片段过量，分离纯化困难。分离纯化困难。分离纯化困难。分离纯化困难。c)c)合成周期长；合成周期长；合成周期长；合成周期长；d)d)只适用小短肽合成只适用小短肽合成只适用小短肽合成只适用
39、小短肽合成。步步骤：骤：多肽的多肽的多肽的多肽的C C端氨基酸通过端氨基酸通过端氨基酸通过端氨基酸通过linkerlinker键连到树脂上；键连到树脂上；键连到树脂上；键连到树脂上；脱除氨基上的临时保护基；脱除氨基上的临时保护基；脱除氨基上的临时保护基；脱除氨基上的临时保护基；与下一个氨基酸缩合；与下一个氨基酸缩合；与下一个氨基酸缩合；与下一个氨基酸缩合；反复进行脱保护和缩合两个步骤；反复进行脱保护和缩合两个步骤；反复进行脱保护和缩合两个步骤；反复进行脱保护和缩合两个步骤；脱除半永久性保护基；脱除半永久性保护基；脱除半永久性保护基；脱除半永久性保护基；4.固相多肽合成固相多肽合成NHOROHY
40、NHOROY去保护去保护H2NORONHOR2OHYR2ONH树脂树脂树脂树脂HNYORO去保护去保护去保护去保护反复进行反复进行反复进行反复进行 固相多肽合成过程固相多肽合成过程根据保护策略不同分为根据保护策略不同分为Boc和和Fmoc方法方法Boc叔丁氧羰基叔丁氧羰基 30%-50%30%-50%三氟乙酸三氟乙酸 强酸强酸 很少应用很少应用 Fmoc9-芴甲氧羰基芴甲氧羰基 20%哌啶哌啶 弱酸弱酸 方便方便 类型类型 脱除保护基条件脱除保护基条件 裂解条件裂解条件 自动化合成自动化合成l环合方式：环合方式：主链头主链头-尾环合，侧链尾环合，侧链-侧链环合侧链环合 侧链侧链-头环合，尾头环
41、合，尾-侧链环合侧链环合 固相液相方法均可，但反应较慢。固相液相方法均可，但反应较慢。5.环肽合成环肽合成 多肽很少可被作为药物利用多肽很少可被作为药物利用多肽很少可被作为药物利用多肽很少可被作为药物利用 易水解，稳定性低，亲水性强难以跨越细胞膜易水解，稳定性低，亲水性强难以跨越细胞膜易水解，稳定性低，亲水性强难以跨越细胞膜易水解，稳定性低，亲水性强难以跨越细胞膜2.2 肽模拟物肽模拟物肽模拟物：根据与结合受体的多肽而设计，将多肽模拟物：根据与结合受体的多肽而设计，将多肽模拟物：根据与结合受体的多肽而设计，将多肽模拟物：根据与结合受体的多肽而设计，将多 肽分子的结构信息转化成非肽结构。肽分子的
42、结构信息转化成非肽结构。肽分子的结构信息转化成非肽结构。肽分子的结构信息转化成非肽结构。分类分类1.以酰胺类似物或二级结构类似物代替多肽的模拟物。以酰胺类似物或二级结构类似物代替多肽的模拟物。2.e.g.NH 用氧原子（用氧原子（O），硫原子（），硫原子（S），），取代或是对其进行烷基化修饰。取代或是对其进行烷基化修饰。3.2.功能模拟物：作用于多肽受体的非肽类小分子，是天功能模拟物：作用于多肽受体的非肽类小分子，是天然多肽的结构类似物。然多肽的结构类似物。4.3.非肽类化合物：有新型的肽母核，但包含多肽发挥作非肽类化合物：有新型的肽母核，但包含多肽发挥作用所必须的关键功能基团。用所必须的关键
43、功能基团。类肽类肽l定义：以定义：以N-取代甘氨酸为构建的单元化合物。取代甘氨酸为构建的单元化合物。优点：比肽的构象柔性高，不会被蛋白酶水优点：比肽的构象柔性高，不会被蛋白酶水解，具有更高的代谢稳定性，提高生物利用度及解，具有更高的代谢稳定性，提高生物利用度及生物活性生物活性。R3OHNOR2R1HNO肽肽类肽类肽NHONR1NR2ONR3（1 1 1 1）靶蛋白的功能位点（靶蛋白的功能位点（靶蛋白的功能位点（靶蛋白的功能位点（3-103-103-103-10个氨基酸）个氨基酸）个氨基酸）个氨基酸）结合小分子或蛋白质后发挥调节活性作用的区域。结合小分子或蛋白质后发挥调节活性作用的区域。结合小分
44、子或蛋白质后发挥调节活性作用的区域。结合小分子或蛋白质后发挥调节活性作用的区域。2.4 多肽的应用和肽类药物多肽的应用和肽类药物多肽多肽疾病诊断和治疗疾病诊断和治疗疾病诊断和治疗疾病诊断和治疗生命调节过程生命调节过程生命调节过程生命调节过程用途：用途：用途：用途：多肽可代替靶蛋白结合配体，研究功能位点的多肽可代替靶蛋白结合配体，研究功能位点的多肽可代替靶蛋白结合配体，研究功能位点的多肽可代替靶蛋白结合配体，研究功能位点的性质，发现新配体，用于结构研究和药物筛选。性质，发现新配体，用于结构研究和药物筛选。性质，发现新配体，用于结构研究和药物筛选。性质，发现新配体，用于结构研究和药物筛选。（2 2
45、）确认靶标确认靶标确认靶标确认靶标,寻找药理学作用的最佳位点寻找药理学作用的最佳位点寻找药理学作用的最佳位点寻找药理学作用的最佳位点+多肽多肽多肽多肽靶蛋白靶蛋白靶蛋白靶蛋白特异结合特异结合特异结合特异结合优点：比药物更容易在细胞内表达，可用于预测药物作优点：比药物更容易在细胞内表达，可用于预测药物作 用位点，确认靶标。用位点，确认靶标。（3）高通量筛选的替代配基）高通量筛选的替代配基 合成可与靶蛋白特定功能位点序列相同的多肽，合成可与靶蛋白特定功能位点序列相同的多肽，合成可与靶蛋白特定功能位点序列相同的多肽，合成可与靶蛋白特定功能位点序列相同的多肽，作为检测平台，然后测定小分子置换多肽配体或
46、作为检测平台，然后测定小分子置换多肽配体或作为检测平台，然后测定小分子置换多肽配体或作为检测平台，然后测定小分子置换多肽配体或阻止配体结合能力。阻止配体结合能力。阻止配体结合能力。阻止配体结合能力。药物：生物利用率药物：生物利用率药物：生物利用率药物：生物利用率低，无特异性，造成周低，无特异性，造成周低，无特异性，造成周低，无特异性，造成周身的毒副作用。身的毒副作用。身的毒副作用。身的毒副作用。VSVS 肽类药物：特异性。肽类药物：特异性。肽类药物：特异性。肽类药物：特异性。2.2 蛋白质化学合成蛋白质化学合成生物表达方法的局限：生物表达方法的局限：生物表达方法的局限：生物表达方法的局限：A.
47、只含只含只含只含2020中天然氨基酸，非天然氨基酸难以引入；中天然氨基酸，非天然氨基酸难以引入；中天然氨基酸，非天然氨基酸难以引入；中天然氨基酸，非天然氨基酸难以引入；B.翻译后修饰困难，不易精确控制；翻译后修饰困难，不易精确控制；翻译后修饰困难，不易精确控制；翻译后修饰困难，不易精确控制；C.大于大于大于大于30 30 kDakDa的蛋白质表达不容易；的蛋白质表达不容易；的蛋白质表达不容易；的蛋白质表达不容易；D.细胞中表达有毒蛋白或膜蛋白困难。细胞中表达有毒蛋白或膜蛋白困难。细胞中表达有毒蛋白或膜蛋白困难。细胞中表达有毒蛋白或膜蛋白困难。2.2.1 蛋白质的化学全合成蛋白质的化学全合成1.
48、发展历程发展历程 固相多肽合成实践中指能合成固相多肽合成实践中指能合成50-60个氨基酸个氨基酸的肽链。的肽链。连接反应连接反应Target Protein 多肽的侧链官能团需要保护。多肽的侧链官能团需要保护。局限局限 C端氨基酸在活化的过程中容易消旋，端氨基酸在活化的过程中容易消旋，最后脱保护步骤可能严重影响产率。最后脱保护步骤可能严重影响产率。2.自然化学连接自然化学连接(Native chemical ligation,NCL)化学选择性反应化学选择性反应化学选择性反应化学选择性反应-酯交换酯交换酯交换酯交换自发重排：自发重排：自发重排：自发重排：SNSN酰基转移酰基转移酰基转移酰基转移
49、 pH 6.5-8.0 pH 6.5-8.0 温度温度温度温度25-4025-40反应机理反应机理1.外加硫醇与多肽硫酯发生酯交换；外加硫醇与多肽硫酯发生酯交换；外加硫醇与多肽硫酯发生酯交换；外加硫醇与多肽硫酯发生酯交换；2.新形成的硫酯与新形成的硫酯与新形成的硫酯与新形成的硫酯与N N端端端端CysCys侧链上的巯基发生酯交侧链上的巯基发生酯交侧链上的巯基发生酯交侧链上的巯基发生酯交换，形成硫酯中间体；换，形成硫酯中间体；换，形成硫酯中间体；换，形成硫酯中间体；3.S-NS-N的酰基转移，生成以的酰基转移，生成以的酰基转移，生成以的酰基转移，生成以CysCys为连接点的多肽。为连接点的多肽。
50、为连接点的多肽。为连接点的多肽。1.N N、C C端有特定的化学结构，需要一个端有特定的化学结构，需要一个端有特定的化学结构，需要一个端有特定的化学结构，需要一个C C端为硫端为硫端为硫端为硫酯的多肽片段和一个酯的多肽片段和一个酯的多肽片段和一个酯的多肽片段和一个N N端为端为端为端为CysCys的多肽片段。的多肽片段。的多肽片段。的多肽片段。2.不需保护基；不需保护基；不需保护基；不需保护基；3.水溶液中进行；水溶液中进行；水溶液中进行；水溶液中进行；4.高效，生成天然的酰胺键。高效，生成天然的酰胺键。高效，生成天然的酰胺键。高效，生成天然的酰胺键。特特 点点多肽硫酯是制备的关键，限制是多肽