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1、第六章 有机酸发酵主要内容：味精 乳酸 核苷酸等有机酸的发酵与生产一、味精工业的发展史 1866年，德国人雷哈生利用硫酸水解小麦面筋，最先分离出谷氨酸。1908年，日本人池田菊苗和铃木合作从海带汁液中提取谷氨酸成功。1910年 日本味之素公司用水解法生产出谷氨酸。1936年，美国人从甜菜废液中提取谷氨酸。1946年，美国发明发酵法生产“-酮戊二酸，并发表了用酶法或化学法将此酮酸转换为L谷氨酸的研究报告。1957年，日本协和发酵公司开始以糖质原料，采用发酵法生产谷氨酸成功，并于1957年投入工业化生产。1959年，美国也开始采用发酵法生产味精。1962年，日本味之素公司采用以丙烯腈为原料，化学合
2、成DL谷氨酸，再经化学分割生成L谷氨酸钠，后来由于石油价格提高，加上消费者对化学合成味精不放心的心理，影响市场销售，而告全部停产。1965年，日本协和公司采用醋酸发酵生产谷氨酸1977年，用糖蜜为原料发酵法生产谷氨酸。我国1923年，上海天厨味精厂首先采用盐酸水解面筋生产味精1932年，沈阳味精厂开始用豆粕水解生产味精1958年，我国有关研究所和工厂开始研究发酵法制备谷氨酸的工艺1964年，上海天厨味精厂首先以黄色短杆菌617为生产菌株，采用发酵法生产谷氨酸中型试验获得成功，继而投入工业化生产1964年，杭州味精厂与中国科学院微生物研究所等单位协作进行北京棒杆菌As1.299发酵法生产谷谷氨酸
3、扩大试验1965年获得成功并投入工业化生产。同时，天津味精厂与天津工业微生物研究所等单位也成功采用发酵法制谷氨酸。沈阳味精厂也相继用发酵法生产味精。2009年世界味精需求量超过200万t,占全球产能的70%以上。中国已经成为世界味精的主产地，也是世界上第一大出口国，2007年出口17万t，与2009年出口量达到22万t。生产企业从2002年140多家减少到目前的50家。它们依次是：河南莲花味精集团、山东菱花集团、江苏菊花味精集团、山东三九味精集团、广州奥桑味精食品公司、沈阳红梅集团、武汉味全食品公司、杭州味精厂。味味精精：味味素素，L-L-谷谷氨氨酸酸的的单单钠钠盐盐。具具有有一分子结晶水，分
4、子量一分子结晶水，分子量187.13187.13。分子式为：分子式为：NaCNaC5 5H H8 8O O4 4N.HN.H2 2O O -氨氨基基酸酸戊戊二二酸酸一一钠钠。白白色色透透明明有有光光泽泽的的八八面面柱柱状状结结晶晶体体，易易溶溶于于水水不不溶溶于于纯纯酒酒精精等等有有机机溶溶剂剂。具具有有强强烈烈肉肉鲜鲜味味，120120以以上逐渐失去结晶水而改变化学性质上逐渐失去结晶水而改变化学性质。主要化学性质n1.与酸作用生成谷氨酸或谷氨酸盐酸盐与酸作用生成谷氨酸或谷氨酸盐酸盐n2.2.与碱作用生成谷氨酸二钠盐与碱作用生成谷氨酸二钠盐n3.3.长时间受热引起分子内失水生成焦谷长时间受热引
5、起分子内失水生成焦谷氨酸钠。氨酸钠。强力味精n定义：又名特鲜味精或新味精，它由味定义：又名特鲜味精或新味精，它由味精配以适量的精配以适量的I+GI+G混合制成混合制成n用途：调味用用途：调味用n G G具有香覃味道具有香覃味道nI I具有鲣鱼质鲜味具有鲣鱼质鲜味n一般比例：一般比例：99%99%味精：味精：I+G=98%I+G=98%：2%2%食用味精的安全性n19731973年联合国食品添加剂标准委员会规年联合国食品添加剂标准委员会规定，摄入量为定，摄入量为0 0120mg/Kg120mg/Kg体重，不适合体重，不适合未满未满1212周即周即3 3个月的婴儿个月的婴儿n19871987年年2
6、 2月，月，WHO/WTOWHO/WTO根据联合国食品添根据联合国食品添加剂标准委员会对味精毒理性试验规定加剂标准委员会对味精毒理性试验规定使用味精不做限量使用味精不做限量n中国味精大鼠长期毒性试验总结中国味精大鼠长期毒性试验总结nSummaryofLongTermToxicityExperimentonMouseforMonosodiumGlutamaten味精是以淀粉或糖质为原料通过微生物发酵法生产出来的味精是以淀粉或糖质为原料通过微生物发酵法生产出来的一种谷氨酸的钠盐一种谷氨酸的钠盐,是自然界存在的氨基酸的一种是自然界存在的氨基酸的一种.对于它对于它的安全性的安全性,在国际上在国际上,特
7、别是日本曾做过大量工作特别是日本曾做过大量工作,以翔实以翔实的、科学的数据证实了食用味精是安全的的、科学的数据证实了食用味精是安全的.联合国粮农组联合国粮农组织和世界卫生组织食品添加剂法规委员会第织和世界卫生组织食品添加剂法规委员会第1919届会议宣布届会议宣布结论结论:对味精每人每天摄入量不需作任何规定对味精每人每天摄入量不需作任何规定.时隔时隔1010多多年年,至今还有一部分消费者对味精的安全性存在疑虑至今还有一部分消费者对味精的安全性存在疑虑.中中国发酵工业协会组织味精行业国发酵工业协会组织味精行业,在中国中医研究院的大力在中国中医研究院的大力支持下支持下,对我国味精产品进行了对我国味精
8、产品进行了,通过通过试验试验,再一次证实了食用味精是安全的再一次证实了食用味精是安全的.第二节谷氨酸合成的机制n（一）合成途径n谷氨酸的生物合成途径大致是：葡萄糖经糖酵解(EMP途径)和己糖磷酸支路(HMP途径)生成丙酮酸，再氧化成乙酰辅酶A(乙酰COA)，然后进入三羧酸循环，生成酮戊二酸。-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及有NH4+存在的条件下，生成谷氨酸。当生物素缺乏时，菌种生长十分缓慢；当生物素过量时，则转为乳酸发酵。因此，一般将生物素控制在亚适量条件下，才能得到高产量的谷氨酸。三、氨基酸合成机理和菌种选育n（一）发酵机理（二）合成条件细胞内氨基酸合成特点：1、某一类氨基酸往往有一个共同的
9、前体2、氨基酸合成与EMP、TCA循环有密切关系3、一种氨基酸可能是另一种氨基酸的前体因此，要使细胞内积累大量氨基酸，必须：1、解除氨基酸代谢途径中的反馈抑制2、防止所合成的目标氨基酸降解或用于合成其它组分3、若集中氨基酸有一个共同前体，应切断其它氨基酸的合成途径4、增加细胞的通透性，使合成的氨基酸及时排出体外，降低胞内浓度。以谷氨酸合成为例：措施1：限制细胞内-酮戊二酸脱氢酶复合物的活性措施2：增加细胞通透性，使谷氨酸排出体外，解除反馈抑制 加入biotin、油酸盐、饱和脂肪酸、青霉素等菌种选育n1、选育营养缺陷型菌株选育营养缺陷型菌株n2 2、利用基因工程获得高产菌株利用基因工程获得高产菌
10、株n3 3、选育调节突变型菌株选育调节突变型菌株n谷氨酸生产菌特征谷氨酸生产菌特征谷氨酸生产菌能够在体外积累菌体最大生长需要量谷氨酸生产菌能够在体外积累菌体最大生长需要量300300多多倍的谷氨酸，研究发现：大量积累并非是当初设想的倍的谷氨酸，研究发现：大量积累并非是当初设想的由于特异代谢途径导致，而是：由于特异代谢途径导致，而是：代谢调节控制；代谢调节控制；细胞膜通透性的特异调节；细胞膜通透性的特异调节；发酵条件的适合；发酵条件的适合；高产谷氨酸菌种的生理生化特征n1.1.异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱n2.2.还原型辅酶还原型辅酶IIII进入呼吸链能力弱或缺进入呼
11、吸链能力弱或缺陷陷n3.3.酮戊二酸氧化能力缺欠或微弱酮戊二酸氧化能力缺欠或微弱n4.4.柠檬酸合成酶、乌头激酶、异柠檬酸柠檬酸合成酶、乌头激酶、异柠檬酸脱氢酶活力弱脱氢酶活力弱n5.5.谷氨酸脱氢酶活力强谷氨酸脱氢酶活力强n6.6.二氧化碳固定反应酶活力强二氧化碳固定反应酶活力强n7.7.分解利用谷氨酸的能力弱分解利用谷氨酸的能力弱n8.8.耐高糖、耐高谷氨酸耐高糖、耐高谷氨酸n9.9.谷氨酸对谷氨酸反馈控制作用丧失谷氨酸对谷氨酸反馈控制作用丧失n10.10.具有向环境泄露谷氨酸的能力具有向环境泄露谷氨酸的能力控制细胞膜透性的几种方法n(1)化学控制法:控制磷脂的合成(包括生物素缺陷型/油酸
12、缺陷型/甘油缺陷型/添加表面活性剂型);阻碍细胞壁的合成(添加青霉素)n(2)物理控制法:温度敏感型突变株生物素对谷氨酸合成途径的影响：n1.生物素对糖酵解的影响生物素对糖酵解的影响n 主要影响糖酵解的速度主要影响糖酵解的速度.在生物素在生物素充足的情况下充足的情况下,丙酮酸以后的氧化活性增丙酮酸以后的氧化活性增强强,但糖降解速度显著提高但糖降解速度显著提高,打破糖降解打破糖降解速度与丙酮酸氧化之间的平衡速度与丙酮酸氧化之间的平衡,使丙酮酸使丙酮酸趋向合成乳酸趋向合成乳酸.n 限量时糖降解速度与丙酮酸氧化速度平限量时糖降解速度与丙酮酸氧化速度平衡衡2.生物素可以使生物素可以使NAD/NADH2
13、含含量减少量减少n在生物素缺乏菌中,葡萄糖氧化能力弱,特别是醋酸琥珀酸的氧化能力显著减弱.n研究发现:生物素缺乏菌中,NAD/NADHNAD/NADH2 2含量减少到含量减少到1/2-1/41/2-1/43.生物素对乙醛酸循环的影响：异柠檬酸裂解酶生物素对乙醛酸循环的影响：异柠檬酸裂解酶的活性丧失，高效率移动的活性丧失，高效率移动n乙醛酸循环的关键酶是异柠檬酸裂解酶,该酶受葡萄糖/琥珀酸组阻遏,为醋酸诱导.控制生物素的亚适量,丙酮酸氧化能力减弱,醋酸生成速度慢;n琥珀酸氧化能力降低而积累的琥珀酸反馈抑制该酶的活性,并阻遏该酶的形成,使乙醛酸循环基本封闭.n异柠檬酸-酮戊二酸-谷氨酸方向n4.生
14、物素对氮代谢的影响生物素对氮代谢的影响n 生物素限量的情形下，几乎没有异柠檬酸生物素限量的情形下，几乎没有异柠檬酸裂解酶的活性，琥珀酸氧化能力弱，苹果酸和裂解酶的活性，琥珀酸氧化能力弱，苹果酸和草酰乙酸反应停滞，完全氧化能力降低，草酰乙酸反应停滞，完全氧化能力降低，ATPATP形成减少，蛋白质合成减少，使菌体合成谷氨形成减少，蛋白质合成减少，使菌体合成谷氨酸酸n5.5.对谷氨酸合成机制的影响对谷氨酸合成机制的影响n 影响膜的合成，排放降低了反馈抑制，确保影响膜的合成，排放降低了反馈抑制，确保谷氨酸优先合成谷氨酸优先合成谷氨酸合成控制生物素的本质n在谷氨酸的发酵中，控制生物素的本质在谷氨酸的发酵
15、中，控制生物素的本质是调节细胞膜的渗透性。是调节细胞膜的渗透性。n 生物素作为脂肪酸生物合成最初反应生物素作为脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰辅酶的关键酶乙酰辅酶A A羧化酶的辅酶，参与羧化酶的辅酶，参与脂肪酸的生物合成，进而控制磷脂的合脂肪酸的生物合成，进而控制磷脂的合成。细胞膜是由磷脂双分子层组成，生成。细胞膜是由磷脂双分子层组成，生物素的降低减少了磷脂合成，细胞变形，物素的降低减少了磷脂合成，细胞变形，有利于谷氨酸的渗出。有利于谷氨酸的渗出。发酵的控制n一、控制碳氮比是关键控制碳氮比是关键n一般发酵工业的碳氮比例为一般发酵工业的碳氮比例为100100：n谷氨酸发酵的碳氮比为谷氨酸发酵的
16、碳氮比为100100：20-3020-30n 当碳氮比低于当碳氮比低于100100：2020时，菌体大量繁时，菌体大量繁殖，少量生成谷氨酸殖，少量生成谷氨酸n当碳氮比例高于当碳氮比例高于100100：3030时，菌体大量生时，菌体大量生成谷氨酰胺成谷氨酰胺二、氧 谷氨酸产生菌是好氧菌，通风和搅拌谷氨酸产生菌是好氧菌，通风和搅拌不仅会影响菌种对氮源和碳源的利用率，不仅会影响菌种对氮源和碳源的利用率，而且会影响发酵周期和谷氨酸的合成量。而且会影响发酵周期和谷氨酸的合成量。尤其是在发酵后期，加大通气量有利于尤其是在发酵后期，加大通气量有利于谷氨酸的合成。谷氨酸的合成。三、温度n菌种生长的最适温度为菌
17、种生长的最适温度为303032 32。当菌。当菌体生长到稳定期，适当提高温度有利于体生长到稳定期，适当提高温度有利于产酸，因此，在发酵后期，可将温度提产酸，因此，在发酵后期，可将温度提高到高到343437 37 四、pH值n谷氨酸产生菌发酵的最适谷氨酸产生菌发酵的最适pHpH在在7.07.08.08.0。但在发酵过程中，随着营养物质的利用，但在发酵过程中，随着营养物质的利用，代谢产物的积累，培养液的代谢产物的积累，培养液的pHpH会不断变会不断变化。如随着氮源的利用，放出氨，化。如随着氮源的利用，放出氨，pHpH会会上升；当糖被利用生成有机酸时，上升；当糖被利用生成有机酸时，pHpH会会下降。
18、下降。五、磷酸盐n它是谷氨酸发酵过程中必需的，但浓度它是谷氨酸发酵过程中必需的，但浓度不能过高，否则会转向缬氨酸发酵不能过高，否则会转向缬氨酸发酵发酵转换n定义：当发酵条件、环境因素发生变化时，必然会影响控制代谢有关酶的合成及其活性，从而导致发酵转换方向，产生其他代谢产物几种主要的代谢转换n1 1、氧、氧n乳酸或琥珀酸乳酸或琥珀酸谷氨酸谷氨酸酮戊二酸酮戊二酸n2 2、NHNH4 4n酮戊二酸酮戊二酸谷氨酸谷氨酸谷氨酰胺谷氨酰胺n3 3、pHpH值值n谷氨酰胺、乙酰谷氨酰胺谷氨酰胺、乙酰谷氨酰胺谷氨酸谷氨酸n4 4、磷酸、磷酸n缬氨酸缬氨酸谷氨酸谷氨酸n5 5、生物素、生物素n乳酸或琥珀酸乳酸或
19、琥珀酸谷氨酸谷氨酸n还有氧化还原电位、氯化铵、醇类等含还有氧化还原电位、氯化铵、醇类等含量均可以影响代谢途径量均可以影响代谢途径谷氨酸发酵过程中形态变化n变化趋势：变化趋势：A.A.长菌型细胞长菌型细胞 ，体现为短杆或棒，体现为短杆或棒状，细胞排列单个、成对或八字形。状，细胞排列单个、成对或八字形。nB.B.转移型细胞，细胞伸长膨大，生物素缺乏，转移型细胞，细胞伸长膨大，生物素缺乏，产酸速度加快，即有长菌型也有产酸型细胞产酸速度加快，即有长菌型也有产酸型细胞nC.C.产酸型细胞，多为磷脂不足的异常状态，呈产酸型细胞，多为磷脂不足的异常状态，呈现伸长、膨大、不规则、缺乏八字型排列，类现伸长、膨大
20、、不规则、缺乏八字型排列，类似花生状似花生状发酵周期、细胞形态、生物素n以发酵周期以发酵周期30303636小时计算小时计算n发酵发酵7 71010小时，细胞长菌期，生物素丰小时，细胞长菌期，生物素丰富富n发酵发酵10102020小时，转型期，生物素开始小时，转型期，生物素开始减少到耗尽，开始产酸，完成由谷氨酸减少到耗尽，开始产酸，完成由谷氨酸非积累型向积累型转变非积累型向积累型转变n发酵发酵2020小时以后，产酸期，产酸速度加小时以后，产酸期，产酸速度加快，快，ODOD值稳定，产酸直线上升值稳定，产酸直线上升第三节味精生产的工艺流程第一部分第一部分主要工序主要工序味精生产一般可以分为制糖、发
21、酵、提味精生产一般可以分为制糖、发酵、提取、精制、包装五个工序取、精制、包装五个工序n1、由于杂菌的污染，使生物反应中的基质或产物因杂菌的消耗而损失，造成生产能力的下降；n2、由于杂菌所产生的一些代谢产物，或在染菌后改变了培养液的某些理化性质，使产物的提取和分离变得困难，造成收率降低或使产品的质量下降；n3、杂菌会大量繁殖，会改变反应介质的pH值，从而使生物反应发生异常变化；n4、杂菌可能会分解产物，从而使生产过程失败；n5、发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解，而使生产失败，等等。第二部分第二部分培养基灭菌培养基灭菌问题1、在发酵生产中，为什么要进行灭菌操作？一、灭菌的原理和方法1、为防止杂菌的
22、污染，哪些需要灭菌？消毒与灭菌在发酵工业中均有广泛应用。消毒是指用物理或化学方法杀死物料、容器、器具内外的病源微生物。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。例如，用于消牛奶、啤酒和酿酒原酒等的巴氏消毒法，是将物料加热至60维持30min，以杀死不耐高温的物料中的微生物营养细胞。灭菌是用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。消毒不一定能达到灭菌要求，而灭菌则可达到消毒的目的培养基、发酵设备、空气、菌种制作问题问题2消消毒毒与与灭灭菌菌的的区区别别衡量热灭菌指标热死时间：即在规定温度下杀死一定比例的微生物所需要的时间。致死温度：杀死微生物的极限温度。致死时间：在
23、此温度下，杀死全部微生物所需要的时间。热阻：对热的抵抗力，指微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。相对热阻：几种微生物对热的相对抵抗能力。指微生物在某一特定条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。三、微生物的热死规律和影响灭菌的因素1、微生物的死亡速率：对数残留定律微生物的死亡速率：对数残留定律微生物受热死亡的原因，主要是因高温使微生物体内的一些重要蛋白质，如酶等，发生凝固、变性，从而导致微生物无法生存而死亡。微生物受热而丧失活力，但其物理性质不变。在一定温度下，微生物的受热死亡遵照分子反应速度理论。在灭菌过程中，活菌数逐渐减少，其减少量随残留活菌数的减少
24、而递减，即微生物的死亡速率与任一瞬时残存的活菌数成正比。在发酵工业中，对培养基和发酵设备的灭菌，广泛使用湿热灭菌法湿热灭菌法。工厂里，蒸汽比较容易获得，控制操作条件方便，是一种简单而又价廉、有效的灭菌方法。用湿热灭菌的方法处理培养基，其加热受热时间与灭菌程度和营养成分的破坏都有关系。营养成分的减少将影响菌种的培养和产物的生成，所以灭菌程度和营养成分的破坏成为灭菌工作中的主要矛盾，恰当掌握加热受热时间加热受热时间是灭菌工作的关键。式中，N残存的活菌数；t灭菌时间（s）；K灭菌速度常数（s-1），也称反应速度常数或比死亡速度常数，此常数的大小与微生物的种类与加热温度有关；dN/dt活菌数瞬时变化速
25、率，即死亡速率。积分得：式中：N0开始灭菌（t=0）时原有活菌数；Nt-经时间t后残存活菌数。微生物的死亡速率与任一瞬时残存的活菌数成正比，上式是计算灭菌的基本公式，灭菌速度常数K是 判断微生物受热死亡难易程度的基本依据。各种微生物在同样的温度下K值是不同的，K值愈小，则此微 生物愈耐热在121，枯草杆菌FS5230的K为0.047s-1，梭状芽孢杆菌PA3679的K值为0.03 s-1，请问哪一种微生物更耐热从上述的微生物对数死亡规律和非对数死亡动力学模型方程式可知，如果要达到彻底灭菌，即灭菌结束时残留的活微生物数等于0，则所需的时间应为无限长，这在实际中是不可能的。灭菌1）如微生物存在芽孢
26、，其死亡速率呈现非对数死亡定律2）工程上，在进行灭菌的设计时，常认为N/N0=0.001，即在1000次灭菌中，允许有一次失败。注：注：2、灭菌的温度和时间、灭菌的温度和时间当培养基被加热灭菌时，常会出现这样的矛盾，这就是，加热时，微生物固然会被杀死，但培养基中的有用成分也会随之遭到破坏，那么有何良策可以既达到灭菌要求，同时又不破坏或尽可能少破坏培养基中的有用成分呢？实践证明，在高压加热的情况下，培养基中的氨基酸和维生素极易被破坏，如在121，仅20min，就有59%的赖氨酸和精氨酸及其他碱性氨基酸被破坏，蛋氨酸和色氨酸也有相当数量被破坏。因此，必须选择一个既能满足灭菌需要，又可使培养基的养份
27、破坏尽可能减少的灭菌工艺条件。在热灭菌过程中，同时会发生微生物死亡和培养基破坏这两种过程，且这两种过程的进行速度都随温度的升高而加速，但微生物的死亡速率随温度的升高更为显著。因此，可选择合适的灭菌温度和时间来调和二者之间的矛盾。灭菌温度灭菌时间（分）营养成分破坏量%10040099.31103667.01151550.0120427.01300.58.01450.082.01500.011.0表灭菌温度、时间与营养成分破坏量的关系（N/No=0.001）同样的灭菌效果同样的灭菌效果由此可见，若要减少营养成分的破坏，可升高温度灭菌。在灭菌时选择较高的温度、较短的时间，这样便既可达到需要的灭菌程度
28、，同时又可减少营养物质的损失。问题问题问题问题灭菌要达到杀死99.99%的细菌芽孢，有两种方法可以采用，一种是118灭菌15min，另一种是128灭菌5min。哪一种方法好，为什么？从理论研究和生产实践都可证明，在灭菌过程中，同时会发生微生物死亡和培养基破坏这两种过程，且这两种过程的进行速度都随温度的升高而加速，但微生物的死亡速率随温度的升高更为显著。因此，对于同一灭菌效果，选择较高的温度、较短的时间，这样便既可达到需要的灭菌程度，同时又可减少营养物质的损失。间歇灭菌1、间歇灭菌、间歇灭菌定义：将配制好的培养基同时放在发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行加热灭菌的过程，通常也
29、称为实罐灭菌。（常用）（常用）24016012080时间（min)050100150温度升温冷却保温2、灭菌时间的计算、灭菌时间的计算如果不计升温阶段所杀灭的菌数，把培养基中所有的菌均看作是在保温阶段（灭菌温度）被杀灭，这样可以简单地利用式，粗略地求得灭菌所需的时间发酵罐过程包括：升温、保温和冷却等三个阶段。各阶段对灭菌的贡献：20%、75%、5%右图为培养基间歇灭菌过程中的温度变化情况。例：有一发酵罐内装40m3培养基，在121温度下进行实罐灭菌。原污染程度为每1mL有2*105个耐热细菌芽孢，121时灭菌速度常数为1.8min-1。求灭菌失败机率为0.001时所需要的灭菌时间。解解：N0=
30、401062105=81012（个）Nt=0.001（个）K=1.8min-1但是实际上，培养基在加热升温时（即在升温阶段）就会有部分菌被杀灭，特别是当培养基加热到100以上，这个作用较为显著。因此，保温灭菌时间实际上比上述计算的要短。严格地讲，在降温阶段也有杀菌作用，但降温时间短，在计算时一般不考虑。在实际生产中，也可能遇到所供蒸汽不足、温度不够高的情况，这时可以适当延长灭菌时间。生产上甚至有用100蒸煮而达到彻底灭菌的实例。如要做固体曲而没有高温蒸汽时，可将原料用100蒸汽蒸30min，杀死其中的营养细胞，但孢子与细菌的芽孢没有被杀死。将蒸过的原料置于室温下过夜，未被杀死的孢子便发芽生长，
31、芽孢发育成营养细胞，再30min便可杀死。如此连续反复进行2-3次，亦可达到彻底灭菌的目的。灭菌过程中加热和保温阶段的灭菌作用是主要的，而冷却阶段的灭菌作用是次要的，一般很小，可以忽略不计。此外，还应指出的是，应当避免长时间的加热阶段，因为加热时间过长，不仅破坏营养物质，而且也有可能引起培养液中某些有害物质的生成，从而影响培养过程的顺利进行。各阶段对灭菌的贡献：20%、75%、5%3、间歇灭菌的操作、间歇灭菌的操作间歇灭歇是在所用的发酵罐或其他培养装置中进行的，它是在配制罐中配好培养基后，通过专用管道输入发酵罐等培养设备中，然后开始灭菌。在进行培养基的间歇灭菌之前，通常先将发酵罐等培养装置的分
32、空气过滤器进行灭菌，并且用空气将分过滤器吹干。开始灭菌时，应先放去夹套或蛇管中的冷水，开启排气管阀，通过空气管向发酵罐内的培养基通入蒸汽进行加热，同时，也可在夹套内通蒸汽进行间接加热。当培养基温度升到70左右时，从取样管和放料管向罐内通入蒸汽进一步加热，当温度升至120，罐压为1*105Pa（表压）时，打开接种、补料、消泡剂、酸、碱等管道阀门进行排汽，当然在保温过程中，应注意凡在培养基液面下的各种进口管道都应通入蒸汽，而在液面以上的其余各管道则应排放蒸汽，这样才能不留死角，从而保证灭菌彻底。保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀门，待罐内压力低于空气压力后，向罐内通入无菌空气，在夹套或蛇管中通冷水
33、降温，使培养基的温度降到所需的温度，进行下一步的发酵和培养。由于培养基的间歇灭菌不需要专门的灭菌设备，投资少，对设备要求简单，对蒸汽的要求也比较低，且灭菌效果可靠，因此，间歇灭菌是中小型生产工厂经常采用的一种培养基灭菌方法。发酵罐发酵罐蒸汽蒸汽蒸汽蒸汽冷却水冷却水无菌培养基无菌培养基配料罐配料罐泵泵加热塔加热塔维持罐维持罐冷却管冷却管连续灭菌1、定义定义：将配制好的培养基在向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、保温和冷却而进行灭菌。2、其它流程、其它流程连续灭菌的基本设备一般包括（1）配料预热罐，将配制好的料液预热到60-70，以避免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声；（2）
34、连消塔，连消塔的作用主要是使高温蒸汽与料液迅速接触混和，并使料液的温度很快升高到灭菌温度（126-132）；（3）维持罐，连消塔加热的时间很短，光靠这段时间的灭菌是不够的，维持罐的作用是使料液在灭菌温度下保持5-7min，以达到灭菌的目的；（4）冷却管，从维持罐出来的料液要经过冷却排管进行冷却，生产上一般采用冷水喷淋冷却，冷却到40-50后，输送到预先已经灭菌过的罐内。喷射加热连续灭菌流程薄板换热器连续灭菌流程灭菌介质原料介质蒸汽T=140 保温段真空进料35100120维持罐120蒸汽14712055出料35水2031流程中采用了蒸汽喷射器，它使培养液与高温蒸汽直接接触，从而在短时间内可将培
35、养液急速升温至预定的灭菌温度然后在该温度下维持一段时间灭菌，灭菌后的培养基通过一膨胀阀进入真空冷却器急速冷却，从图中可以看出，由于该流程中培养基受热时间短，营养物质的损失也就不很严重，同时该流程保证了培养基物料先进先出，避免了过热或灭菌不彻底等现象。流程中采用了薄板换热器作为培养液的加热和冷却器，蒸汽在薄板换热器的加热段使培养液的温度升高，经维持段保温一定时间后，培养基在薄板换热器的冷却段进行冷却，从而使培养基的预热、加热灭菌及冷却过程可在同一设备内完成。该流程的加热和冷却时间比喷射加热连续灭菌流程要长些，但由于在培养基的预热过程同时也起到了灭菌后培养基的冷却，因而节约了蒸汽和冷却水的用量。间
36、歇灭菌与连续灭菌的比较间歇灭菌或连续灭菌都有各自的优点和缺点，现比较如下：灭菌方式优点缺点连续灭菌1.灭菌温度高，可减少培养基中营养物质的损失2.操作条件恒定，灭菌质量稳定3.易于实现管道化和自控操作4.避免了反复的加热和冷却，提高了热的利用率5.发酵设备利用率高1.对设备的要求高，需另外设置加热、冷却装置2.操作较麻烦3.染菌的机会较多4.不适合于含大量固体物料的灭菌5.对蒸汽的要求高间歇灭菌1.设备要求低，不需另外设置加热、冷却装置2.操作要求低，适于手动操作3.适合于小批量生产规模4.适合于含有大量固体物质的培养基的灭菌1.培养基的营养物质损失较多，灭菌后培养基的质量下降2.需进行反复的
37、加热和冷却，能耗较高3.不适合于大规模生产过程的灭菌4.发酵罐的利用率较低加热器、维持罐（管）和冷却器以及发酵罐等都应先进灭菌由表可见，无论在理论上或者在实践上，与间歇灭菌过程相比，连续灭菌的优点十分明显。因此，连续灭菌越来越多地被用培养基的灭菌。发酵罐的灭菌技术n1、空消n2、实消n3、连消分批灭菌与连续灭菌n生产规模大时连续灭菌有优势：nUHTS方式灭菌，减少营养成分损失；n发酵罐利用率高；n蒸气负荷均匀n采用板式换热器，节约大量能量n适宜采用自动控制，劳动强度低。补料的控制n补料的原则：控制微生物的代谢，有利于发酵朝产物积累的方向进行。n补料的内容：C、N、无机盐、产诱导酶的底物第三部分
38、空气灭菌流程n空气中微生物的分布和发酵工业对空气无菌程度的要求n空气除菌的方法n介质过滤除菌的机理n介质过滤除菌的工艺一、空气中微生物的分布和发酵工业对空气无菌程度的要求（一）无菌空气的概念n发酵工业应用的“无菌空气无菌空气”是指通过除菌处理使空气中含菌量降低在一个极低的百分数，从而能控制发酵污染至极小机会。此种空气称为“无菌空气”。（二）空气中微生物的分布空气中的含菌量随环境不同而有很大差异：n一般干燥寒冷的北方空气中的含菌量较少，而潮湿温暖的南方则含菌量较多；n人口稠密的城市比人口少的农村含菌量多；n地面又比高空的空气含菌量多。n各地空气中所悬浮的微生物种类及比例各不相同，数量也随条件的变
39、化而异，一般设计时以含量为103104个m3进行计算。（三）发酵对空气无菌程度的要求发酵对空气无菌程度的要求n各种不同的发酵过程，对空气无菌程度的要求也不同。影响因素是比较复杂的，需要根据具体情况而订出具体的工艺要求。n一般按染菌机率为10-3。来计算，即1000次发酵周期所用的无菌空气只允许12次染菌。二、空气除菌的方法二、空气除菌的方法n辐射灭菌n加热灭菌n静电除菌n介质过滤（一）辐射灭菌1.原理n射线、X射线、射线、射线、紫外线、超声波等从理论上讲都能破坏蛋白质，破坏生物活性物质，从而起到杀菌作用。2.应用范围n通常用于无菌室和医院手术室。3.缺点n杀菌效率较低，杀菌时间较长。一般要结合
40、甲醛蒸汽等来保证无菌室的无菌程度。（二）加热灭菌n空气进口温度为21，出口温度为187198，压力为0.7MPa。（三）静电除菌1.原理利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘、除菌的目的。2，优点阻力小，约1.01325104Pa染菌率低，平均低于10-15除水、除油的效果好耗电少3，缺点设备庞大、一次性投资较大、捕集率尚嫌不够，需要采取其它措施。(四四)介质过滤介质过滤空气过滤器的功能：空气过滤器的功能：一个空气过滤器的功能是从气体中去除污染物（微生物）以使达到所需的气体的无菌程度过滤介质的过滤/分离效率由于直接拦截直接拦截惯性撞击惯性撞击扩散拦截扩散拦截的共同作用而增强过滤介质的类型表面过滤
41、介质:编织网粉末烧结深度过滤介质:纤维材料结构棉花活性炭或玻璃纤维有机合成纤维浇铸膜结构过滤介质的基本要求n过滤介质是是过滤除菌的关键，直接关系到介质的消耗量、过滤过程动力消耗、设备的结构、尺寸，更是关系到运转过程的稳定性。对过滤介质的总的要求是吸附性吸附性强、阻力小、空气流量大、能耐干热。强、阻力小、空气流量大、能耐干热。可将常用的过滤介质分为纤维状或颗粒状过滤介质、过滤纸、微孔过滤膜三大类。纤维状或颗粒状过滤介质n（1）棉花n棉花是常用的过滤介质，最好选用纤维细长疏松的未脱脂新鲜产纤维细长疏松的未脱脂新鲜产品品，因为脱脂棉花易吸水而使体积变小，而贮藏过久，纤维会发脆甚至断裂，增大阻力。棉花
42、的纤维直径一般为1621m，实重度1520kg/m3。使用时要分层均匀铺砌，最后要压紧，一般填充密度为130150kg/m3，填充率为8.5%10%。如果不压紧或是填装不均匀，会造成空气走短路，甚至介质翻动而丧失过滤效果。其主要缺点是阻力大，遇油水易结团，过滤效率不稳定，拆装劳动强度大，不能再生。可用蒸汽灭菌，但不宜每批发酵都进行灭菌，因为棉花层经多次蒸汽加热后易板结，增大空气阻力，降低过滤效果。n（2）活性炭n活性炭有非常大的表面积，通过表面的吸附作用而吸附微生物。常用的活性炭是小圆柱体，其大小3105mm，实重度1140kg/m3。一般填充密度50030kg/m3，故填充率为44%。要求活
43、性炭质地坚硬，不易压碎颗粒均匀。填装时要筛去粉末。活性炭常与纤维状过滤介质联合使用。三、介质过滤除菌的工艺n空气过滤除菌流程是按生产对无菌空气要求具备的参数，根据空气的性质而制订的，同时还要结合吸气环境的空气条件和所用设备的特性进行考虑。n对于一般要求的低压无菌空气，可直接采用一般鼓风机增压后进入过滤器，经一、二次过滤除菌而制得。n而一般的深层通气发酵，除要求无菌空气具有必要的无菌程度外，还要具有一定的压力，这就需要比较复杂的空气除菌流程。（一）对空气除菌流程的要求n流程的设备：n主设备：空气压缩机n附属设备：要求尽量采用新技术，提高效率，减少设备，精简设备流程，降低设备投资、运转费用和动力捎
44、耗，简便操作。n流程的制订应考虑：n地理、气候环境n设备条件（二）空气过滤除菌流程的分析n发酵厂所使用的空气除菌流程，随各地的气候条件及设备条件不同而有很大的差别。n要保持过滤器有比较高的过滤效率，应要保持过滤器有比较高的过滤效率，应维持一定的气流速度和不受油、水的干维持一定的气流速度和不受油、水的干扰。扰。气流速度可由操作来控制；要保持不受油、水干扰则要有一系列冷却、分离、加热的设备来保证空气的相对湿度在5060的条件下过滤。1.两级冷却、分离、加热的空气过滤除菌流程流程的特点是：两次冷却，两次分离，适当加热。第一级冷却到3035 第二级冷却到2025 相对湿度降低至5060%2.冷热空气直
45、接混合式空气过滤除菌流程特点：可省第二冷却分离设备和空气再加热设备，流程比较简单，冷却水用量较少，利用压缩空气的热量来提高空气温度。此流程适用于中等混合量的地区。3035相对湿度为5060%3.高效前置过滤除菌流程特点：无菌程度高4利用热空气加热冷空气的流程n它利用压缩后热空气和冷却后的冷空气进行交换，使冷空气的温度升高，降低相对湿度。此流程对热能的利用比较合理，热交换还可以兼做贮气罐，但由于气气交换的传热系数很小，加热面积要足够大才能满足要求。（三）介质过滤除菌的设备及计算（三）介质过滤除菌的设备及计算1.深层过滤效率和过滤器的计算深层过滤效率和过滤器的计算n过滤效率过滤效率：就是滤层所滤去
46、的微粒数与原来微粒数的比值，它是衡量过滤器过滤能力的指标。1.1对数穿透定律研究过滤器的过滤规律时，先排除一些复杂的因素，假定：过滤器中过滤介质每一纤维的空气流态并不因其它邻近纤维的存在而受影响；空气中的微粒与纤维表面接触后即被吸附，不再被气流带走；过滤器的过滤效率与空气中微粒的浓度无关；空气中的微粒在滤层中递减均匀，即每一纤维薄层除去同样百分率的菌体。空气通过单位滤层后，微粒浓度下降量与进入此介质的空气中的微粒浓度成正比，即：（1）深层过滤的对数穿透定律深层过滤的对数穿透定律 将（1）整理，积分（2）或（3）1.2介质层厚度的计算由（2）或（3）得（4）或（5）式中的N1可根据进口空气的菌体
47、浓度、空气流量及持续使用时间算出。如空气中的原始菌浓度为10000个m3，空气流量为200m3min，持续使用2000h，则N1为2.41011个菌，N2一般可假定为10-3个菌。于是N2N12.41014，在设计空气过滤器时，我们常把N2N11015作为设计指标。K值与纤维介质的性质、直径、填充率、气流速度以及菌体大小有关。2过滤器的结构2.1深层棉花、活深层棉花、活性炭过滤器性炭过滤器立式圆筒形，内部填充过滤介质，以达到除菌的目的。n过滤器的尺寸主要是确定过滤器的内径D和有效过滤的高度，最后定出整个过滤器的高度尺寸。过滤器的内径D可以根据空气量及流速求出：2.2滤纸过滤器3附属设备3.1粗
48、过滤器作用：是捕集较大的灰尘颗粒，防止压缩机受磨损，同时也可减轻总过滤器负荷。要求：过滤效率要高，阻力要小；否则会增加压缩空气的吸入负荷和降隐低压缩空气机的排气量。常用的粗过滤器有：布袋过滤填料过滤油浴洗涤水雾除尘作用：是消除压缩机排出空气量的脉动，维持脉动，维持稳定的空气压力，稳定的空气压力，同时也可以利用重力沉降作用分离部分油雾。贮罐的大小可按下面的经验公式计算：3.2 空气贮罐空气贮罐3.3气液分离器旋风式填料式第四部分味精厂水解设备n一、水解设备流程n味精厂水解淀粉为糖，一般采用酸水解法。n二、水解锅的构造与计算n淀粉水解的条件是PH值为1.5左右，压力为为大气压(表压)。因此，水解锅
49、必须能耐酸耐压，锅体材料为不锈钢板或内衬1.5-3毫米厚的不锈钢板的普通钢板。n水解锅的构造糖化常用的方法n酸法处理n双酶法n酸酶法或者酶酸法 第五部分第五部分 通风发酵罐通风发酵罐n通风发酵罐有鼓泡式、气升式、机械搅拌式、自吸式、喷射自吸式、溢流喷射自吸式等多种类型发酵罐。n通风发酵设备要将空气不断通入发酵液中，供微生物所需的氧，气泡越小，气泡的比表面积越大，氧的溶解速率约快，氧的利用率也越高，产品的产率也越高。n机械搅拌通风发酵罐是发酵工厂常用类型之一，它是利用机械搅拌器的作用，使空气和醪液充分混合促使氧在醪液中溶解，以保证供给微生物生长繁殖、发酵所需要的氧气。发酵罐的基本条件发酵罐的基本
50、条件n（1）发酵罐应具有适宜的径高比。罐身越高，氧的利用率较高。n（2）发酵罐能承受一定的压力。n（3）要保证发酵液必须的溶解氧。n（4）发酵罐应具有足够的冷却面积。n（5）发酵罐内应尽量减少死角，避免藏垢积污，灭菌能彻底，避免染菌。n（6）搅拌器的轴封应严密，防病量减少泄漏。发酵罐罐体的尺寸比例发酵罐罐体的尺寸比例nDi=(1/3-1/2)DHo=2DiB/D=1/8-1/12ha=0.25DS=(2-5)DiC=(0.8-1)Di1 发酵罐的结构发酵罐的结构n1、罐体、罐体n2、搅拌器和挡板、搅拌器和挡板n3、消泡器、消泡器n4、联轴器及轴承、联轴器及轴承n5、变速装置、变速装置 n6、空