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1、第六部分放射性核素在生物和医学中的应用第1页，此课件共37页哦第一节 放射自显影技术放射自显影技术是利用放射性核素衰变时发射的射线对乳胶的感光作用，在乳胶底片上现出影像，以显示标本或样品中的放射性物质的分布、定位和定量的方法。分子克隆图第2页，此课件共37页哦放射自显影技术的优缺点：1、能准确示踪定位。显示形态与功能的定位关系。2、能在整体平面上同时比较，注入体内后的标记物质在各个脏器内的分布与代谢状态，分析在各脏器中的摄取量，在不同时期的吸收、分布、转运与排泄途径等动态关系。3、是细胞内物质代谢研究的有力工具。、缺点是对某一位置上的放射性一般只能相对定量。第3页，此课件共37页哦用于放射自显
2、影的感光材料（是由卤化银和明胶所组成的乳胶）感光材料特点卤素离子与银离子按一定规律、一定距离排列，形成一立方形的晶体点阵。具有理想晶体结构的卤化银晶体对光线和核射线的作用不灵敏。采用不同配方和制作工艺，使卤化银晶体出现晶体缺陷（不是完全规则的六面体立方结晶，而呈如三角形、圆形等）。导致晶体内部的电荷不平衡。电荷不平衡之处对相反的电荷形成陷阱（亦称敏化中心）。陷阱对提高乳胶的灵敏度，起着重要的作用。主要采用的感光材料有：原子核乳胶：原子核乳胶是自显影中较理想的感光材料。它的银盐颗粒直径在0.20.5m，密度大（1013银颗粒/平方厘米），分辨率高。主要用于微观放射自显影。X光片：X光片两面都涂有
3、保护层，防止乳胶层被划伤，其乳胶银颗粒较大，平均直径为2.53m，密度较小（6109银颗粒/立方厘米）。氚片：氚片银粒的平均直径是1m，单面没有保护层，因为保护层将吸收90%以上的发射的粒子。其余性能与X光片类似。第4页，此课件共37页哦 选择乳胶一般从敏感度和分辨率两方面来考虑。质量好的乳胶，颗粒细、密度大、敏感度低，则分辨力高。反之银盐的颗粒愈大，敏感度愈大，分辨力也愈差。第5页，此课件共37页哦剂量与曝光：放射性剂量给予的大小、曝光时间的长短与放射自显影乳胶底片影像效果好坏有很大关系。在一个实验中如何选取两者的大小，人们在实际实验中有很多经验。如：分不同的时间取片等。也有人推荐下面公式：
4、设：L 为单位面积上衰变的放射性强度 为单位时间上开始曝光时的放射性强度(Ci/cm2)t为单位时间上终了曝光时的放射性强度(Ci/cm2)t 为曝光时间,T 为半衰期 则因为所以第6页，此课件共37页哦乳胶感光原理（1）（2）（3）（4）（1）核射线 与乳胶作用时，电离产生的电子；（2）电子向敏化中心移动，形成一阴电层；（3）银离子向阴电层聚集，与此同时银离子被还原成银原子；（4）银原子在敏化中心周围集中而形成潜影。这些潜影将在显影过程中起着重要地催化作用。因而也称为“显影中心”。第7页，此课件共37页哦注意：已经建立起来的潜影，在水、氧作用下会消退（这个现象的实质是溴化银晶体中所产生的极少
5、量的银原子又退变成离子返回晶格），而失去原来的催化作用。所以在“曝光”期间应注意干燥、低温和隔氧。第8页，此课件共37页哦显影、停影和定影显影和显影液（显影剂、促进剂、保护剂和抑制剂组成停影和停影液定影和定影液（定影液一般包括：定影剂、保护剂、停显剂和坚膜剂）水洗和干燥第9页，此课件共37页哦光胶片显影液配方水（50）（ml）800米图尔（g）2.2无水亚硫酸钠（g）72海得尔（g）8.8无水碳酸钠（g）48溴化钾（g）4加水至总量（ml）1000常用停影液配方是：醋酸，加水至。酸性坚膜定影液的配方溶液一海波（硫代硫酸钠）240g蒸馏水（）500ml溶液二蒸馏水（）150ml无水亚硫酸钠15g
6、醋酸（冰醋酸份，加水份）48ml钾明矾15g 加水总量至：1000ml按上面试剂的顺序分别配置溶液一、二，然后把溶液二加到溶液一中，并剧烈搅拌。第10页，此课件共37页哦自显影的阅读与相对定量（1）光密度法（根据自显影中影像的黑化程度来确定组织中放射性核素相对量的方法）同时制备一套已知放射性强度标准样品和待测样品在完全相同的情况下进行放射自显影。用光密度计测量出标准和待测样品的黑化强度，再比较定出相对含量。（）颗粒数量计算法（也称：微尺目数法）它是利用目镜微尺在显微镜视野下圈定一定范围（如50平方微米），进行射线颗粒数量计数。推算出单位面积或细胞、细胞核的相对标记强度。（）径迹数量计算法这是计
7、算由射线粒子在胶片上所形成的径迹的数量来测定组织和细胞中放射性核素相对含量的方法。计数方法与上述的颗粒计数法相同。求出单位面积内的径迹数。第11页，此课件共37页哦第二节 放射免疫测定法这是一种超微量分析技术，具有灵敏度高和特异性强的突出优点。这类方法名称繁多，常见的名称有：放射免疫测定法、免疫放射测定法、竞争性蛋白质结合测定法、放射受体测定法、放射酶测定法、体外放射分析法等。此方法的建立和发展，给医学生物学的一个重要分支内分泌学带来了革命。本方法的创始人荣获了1977年诺贝尔生理学和医学奖。第12页，此课件共37页哦基本原理利用放射性标记抗原(Ag*)、待测抗原(Ag)与特异性的抗体(Ab)
8、竞争结合。在一个放免实验里(Ag*)和(Ab)的量需保持恒定，Ag与Ag*之和大于Ab上有效结合位点数目。此时，Ag与Ag*-Ag间存在着函数关系 第13页，此课件共37页哦 抗原抗体BFB/FB/B+F 4/2=24/6=67%3/3=13/6=50%2/4=0.52/6=33%1/5=0.21/6=17%游离的Ag*结合的Ag*-Ag第14页，此课件共37页哦标准竞争抑制曲线第15页，此课件共37页哦基本步骤：放射免疫分析目的：检测待测样品中抗原（Ag）的量。如上图加样。是标准样品；管；是非特异性管；待测管可是若干个待测样品。室温放置或保温一定时间。加入二抗（管不加，室温放置或保温，使二抗
9、与抗原-抗体复合物充分结合成分子量很大的复合物；3500-5000转/分离心（T管不离心），去上清（抗原抗体的复合物沉淀，）；探测器测cpm值。利用公式计算B%：标准管0123456Ag*1ul1ul1ul1ul1ul1ul1ulAg010204080160200Ab1111111待测管1ul?血清1NSB1ul1ul04000第16页，此课件共37页哦以已知的标准抗原含量（ng/ml）为横坐标，B%为纵坐标做标准曲线。标准竞争抑制曲线待测样品的测量，先与标准样品一样，计算出B%，再在标准曲线上查出待测样品的抗原含量。第17页，此课件共37页哦对于抗原、抗体的制备，刘兢老师的免疫学课中会做介绍
10、。在这不作介绍了。第18页，此课件共37页哦第三节 放射性示踪技术示踪即为在研究对象中引入一标记物作为探针，通过观察探针的去向，了解其分布、运动及转化的情况。放射性示踪的基本依据是：（1）可测性，因为放射性核素总是自发发射各种射线。（2）放射性核素与其同种非放射性核素理化性质基本相同，一般生物体不区别对待它们。放射性示踪的特点：灵敏度高、操作简便、合乎生理条件、可解决其他方法不能解决的难题、准确定位。标记化合物来源少、技术操作要求高、轻元素的同位素效应、放射效应。第19页，此课件共37页哦例：柠檬酸HOCCOOHH2CC*OOHH2CCOOH酶2HCC*OOHHCHH2CCOOHO酮戊二酸KM
11、nO4COHH2CCOOHHCHO+C*O2琥珀酸柠檬酸脱羧机制的确定第20页，此课件共37页哦示踪实验的设计及步骤：1、根据实验目的和实验周期长短，选择合适的放射性核素及其标记化合物。(1)合适放射性核素的选择,(2)合适标记化合物的选择：2、示踪剂的用量，根据实验周期长短，示踪剂的给予方式的不同（如：喂养、静脉注射、呼吸等）,被示踪生物对示踪剂的利用率和在体内分布及排泄情况，确定。3、选择合适的辐射防护条件和废物处理方法,对于操作复杂的实验，需先做空白实验。4、根据实验的要求及示踪剂射线类型，选择合适的样品测量方法。（包括：定量测量、定位测量、定性测量5、对放射性测量结果进行数据处理，并根
12、据实验要求计算、书写出一定的数据形式。第21页，此课件共37页哦放射性核素稀释分析法（放射性核素稀释法又称为载体法或俘获技术）。此分析法的特点：可以对含有多种性质相近成分的混合物中某一化合物进行定量分析。正稀释法：分析计算混合物中某一化合物的含量（）。具体方法如下：（1）在混合物中加入一定量（）的已知放射性比活度（）的与待测化合物相同的放射性核素或标记化合物；（2）充分均匀混合；（3）分离纯化待测化合物，直至恒定比活度（）；根据放射性被加入混合物前后，虽比活度发生了变化，但放射性总强度没变，可由下列方程式成立。反稀释法：分析计算混合物中某一放射性标记化合物的含量（）。具体方法如下：（1）取一定
13、量的待测混合物进行分离纯化，直至恒定放射性比活度，探测器测得该活度为；（2）在混合物中加入大量的与待测标记化合物相同的非标记化合物，已知加入量为；（3）充分混合，并分离纯化，直至恒定放射性比活度，探测器测得该活度为；同理，有下列方程成立。第22页，此课件共37页哦放射性探针的制备双链探针的合成法:单链探针的合成法:切口平移法用随机寡核苷酸引物合成均一标记的DNA探针合成可与克隆于噬菌体或M13噬菌体载体上的序列互补的放射性标记DNA。将克隆于特定载体上的靶序列转录成放射性的RNA，在此载体上带有可被噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶识别的sp6启动子。第23页，此课件共37页哦切口平移法混合下列
14、成分:10切口平移缓冲液2.5ul；模板0.5ug；未标记的三种20nmol/L的dNTP各ul；一种dNTPul；加水至终体积为21.5ul，使混合液骤冷至。加入2.5ul胰酶(10mg/ml，用1切口平移缓冲液配制，振荡均匀。加入E.coilDNA聚合酶2.5单位16温育60min加入25ul100mmol/LEDTA终止反应。将反应混合物上柱（SephadexG50)，用缓冲液洗脱，分管收集，测cpm值，合并第一个cpm峰（探针，第二个cpm峰为dNTP。标记水平的计算：32P-dNTP利用率*DNA(dpm/g)=DNA重量第一个峰总计数(cpm)本底探测器的探测效率第一个峰总计数本底
15、(cpm)第一,第二峰总计数（cpm)100%3，OH缺口（胰DNA酶I作用）缺口向3，端移动大肠杆菌DNA聚合酶I5，-3，聚合酶活性第24页，此课件共37页哦用随机寡核苷酸引物合成均一标记的DNA探针首 先 需 要 纯 化 所 需 制 备 探 针 的 目 的DNA（200ug）并 与 过 量 的随 机 引 物（75ug）混合将混合液没入沸水中煮3min。到时取出后，迅速没入冰水中1min。取出，并移入已配置好的（如下）混合液中。（20mmol/LDTT1ul;dGTP,dCTP,dTTP的混合液，浓度各5mmol/L1ul;10RP缓冲液0.67ul;-32P-dATP（比活度3000Ci
16、/mmol）3ul;H2O 1ul)加5各单位（约1ul）的大肠杆菌聚合酶I Klenow片段，混合室温下温育至少3小时。在反应液中加入10ulA缓冲液。随机引物可由以下三种途径得到：1、用DNA酶I消化小牛胸腺DNA或鲑精DNA产生大量长为612核苷酸的单链DNA。2、直接从一些厂家购买用小牛胸腺DNA制备的随机引物。3、在自动DNA合成仪上合成，这种合成引物也可在公司买到。第25页，此课件共37页哦单链探针的制备由DNA模板体外制备单链探针有以下两种方法：（1）合成可与克隆于噬菌体或M13噬菌体载体上的靶序列互补的放射性标记DNA。（2）将克隆于特定载体上的靶序列转录成放射性的RNA，在此
17、载体上带有可被噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶识别的启动子。这两种方法都可以产生比活度极高且长度固定的探针。但第一种方法需用物理手段把新合成的放射性标记DNA与互补的未标记模板分开（例如：根据片段大小选用变性聚丙烯酰胺凝胶或碱性琼脂糖凝胶电泳、碱性柱层吸等）。而第二种方法中，DNA模板更容易用不含RNA酶的DNA酶I除去。也可以以RNA为模板制备单链探针。这时合成cDNA的引物可以用寡脱氧胸苷酸（oligo(dT)）或随机序列的寡核苷酸。cDNA探针合成的主要思路：1、选择适当的引物。2、选择适当的RNA模板。3、在有dNTP（其中一种是放射性dNTP*）存在下，利用依赖于RNA的DNA聚合酶
18、（反转录酶）催化合成cDNA*放射性探针。第26页，此课件共37页哦以寡核苷酸作为引物合成与单链RNA互补的总cDNA探针为例在1无菌的EP管中+3ul（无RNA酶）水+1ugRNA模板，混匀。70加热5分钟，并马上放在冰上骤冷。加入：胎盘RNA酶抑制物20单位；引物（2.5mg/ml）（随机序列的八核苷酸）5ul。10随机引物缓冲液 2.5ul；dGTP,dTTP,dATP各 20mmol/L的混合液1ul；120umol/L.120umol/L.dCTP-32P(比活度3000Ci/mmol)10ul；Moloney鼠白血病病毒反转录酶（200000单位/毫升）0.5ul；加水至25ul,
19、轻摇混匀。37温育1小时。加入0.5mol/L NaOH,68温育30min,水解RNA。待 溶 液 温 度 降 到 室 温 后，加 入 10ul 1mol/L Tris.Cl(PH7.4),再加入3ul 2 mol/L HCl。通过酚氯仿抽提纯化cDNA*分离cDNA*和dCTP*（可用Sephadex G50,也可用乙醇选择性沉淀）。cDNA*产率的测定：取三张Whatman圆滤纸，剪成能放进液闪瓶大小。CA、B 用5%三氯醋酸，0.5%焦磷酸钠抽洗两次，再用95%乙醇10ml抽洗，凉干。（为了除去dCTP*）。将A、B、吹干，测计数。A、空白对照（本底）B、cDNA*计数（cpm/ul）
20、C、cDNA*+dCTP*计数（cpm/ul）AA在中心滴1ul反应前溶液BB在中心滴1ul反应后溶液C在中心滴1ul反应后溶液cDNA*合成量（ug）=（B-A）/CdNTP(四种）质量(ng)第27页，此课件共37页哦电泳带电物质在电场中向其相反电极泳动的现象称为电泳。第28页，此课件共37页哦DNA的泳动率与MW的关系第29页，此课件共37页哦第30页，此课件共37页哦第31页，此课件共37页哦第32页，此课件共37页哦第33页，此课件共37页哦第34页，此课件共37页哦分子杂交分子杂交是基因工程和分子生物学的重要技术之一。是鉴别阳性重组子、筛选基因、确定的同源性、研究基因定位、组建的物
21、理图谱、研究的间隔顺序等的有效手段。在现代分子学中得到了广泛应用。而在分子杂交中,对于目的核酸进行识别的方法之一,就是利用放射性探针.第35页，此课件共37页哦Southern杂交技术主要用途：对目的检测或筛选。纯化和适当降解。琼脂糖凝胶电泳，将目的与其它分离。将转移到尼龙膜或硝酸纤维素膜上。marker样品多孔透水过滤平板滤纸膜橡胶板琼脂糖凝胶蓄水池杂交（探针制备，预杂交，杂交）膜杂交袋预杂交液或杂交液放射自显影第36页，此课件共37页哦Southern杂交技术所用试剂：20SSC：3mol/L;NaCl;0.3mol/L柠檬酸三钠（PH7.6）50Denhardt溶液：5g聚蔗糖；5g聚乙
22、烯吡咯烷酮和5gBSA（牛血清白蛋白）；加水至终体积为500ml。预杂交液：3SSC；10Denhardt溶液；0.1%SDS;10ug/ml聚腺苷(polyA)；50ug/ml 鲱鱼精DNA或小牛胸腺DNA。杂交溶液：在预杂交液中加入变性（100煮沸5分钟）DNA探针。X光片；显影、定影液。一、杂交:将已经转移上DNA或RNA的滤膜放如可封口耐热塑料袋中。以下列次序更换溶液，溶液需预热（65恒温振荡水浴保温，溶液体积按0.5ml/cm2滤膜计算）。3SSC，30分钟。3SSC，10Denhardt溶液，60分钟。预杂交液，30分钟。用1/4体积杂交液置换预杂交液，同样条件下保温24-48小时。杂交完毕，取出滤膜，依次用3SSC，0.1%SDS；1SSC，0.1%SDS；0.1%SDS，0.3SSC在65漂洗35分钟，并不断用探测器检测。放射自显影第37页，此课件共37页哦