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1、项目名称：诱导多能干细胞（iPS）的重编程机制首席科学家：王纲 中国科学院上海生命科学研究院起止年限：2009.1至2013.8依托部门：中国科学院一、研究内容基于以上的立项依据，本项目的主要研究内容将集中在以下几个方面：1 iPS细胞被重编程的分子机制从核移植（克隆动物的基础）我们得知，细胞核可以被胞质重编程。iPS的出现说明四个因子（或其他几个因子）可以重编程体细胞。目前我们不知道使重编程发生的关键分子事件是什么。我们将从表观遗传修饰的改变、microRNA的变化和基因表达谱的变化几个方面来研究iPS中重编程的分子机理。1.1 表观遗传变化基因表达活性调控的机制主要是通过染色质水平的化学修
2、饰（包括组蛋白上的修饰），形成有转录活性的常染色质和无转录活性的异染色质区域。染色质组分（组蛋白与DNA）的各种修饰在细胞内由不同的酶类催化完成。胚胎干细胞、成体细胞或已分化细胞具有各不相同的特异性的染色质修饰谱式。这些修饰谱式在体细胞去分化时发生逆转（重编）。已有实验证明MEF细胞的Oct4和Nanog基因的启动子在iPS形成过程中发生去甲基化。由于DNA甲基化引起基因转录沉默，因此去除全能性基因上的DNA甲基化是激活全能性基因的重要步骤。也是iPS诱导过程中一系列分子事件中的一大限速步骤。同时，由于在转录调控中，DNA甲基化和组蛋白的修饰属于一起发挥作用的共同体，因此，研究DNA甲基化在i
3、PS中的作用，必须要研究该过程中组蛋白修饰的变化。我们将在iPS诱导系统中，利用ChIP-on-chip芯片研究分析和发现组蛋白修饰的动态变化。在此基础上，通过有目的地改变DNA甲基化和组蛋白修饰的动态平衡，探索简化iPS诱导方法的可能策略，如不依赖反转录病毒导入外源转录因子等。阐明体细胞重编程过程中各分子事件间的相互联系,进而为iPS技术革新提供依据。1.2 microRNA的改变诱导已分化的体细胞成为多能性的干细胞(iPS)是一个复杂的过程。最近的研究发现microRNAs在维持干细胞的多能性发挥了重要的作用, 破坏microRNA会导致胚胎干细胞分化异常以及精原干细胞在体内的缺失。研究发
4、现，小鼠和人的胚胎干细胞拥有一套特异的microRNAs，它们定位在染色体上成一簇，并与Oct4,Sox2和Nanog有相互作用，提示这些microRNAs参与维持胚胎干细胞的多能性。因此我们推测microRNAs在iPS的诱导和维持中也有重要作用，是全面解析iPS诱导分子机制不可缺少的一部分.我们将进行以下的研究：1，用Lentiviral病毒载体来诱导表达Oct4，Sox2，Nanog，Lin-28，建立可重复的iPS诱导系统,分析和发现general microRNAs和胚胎干细胞特异的microRNAs被激活的时间图谱；2，然后选择在不同时间激活的胚胎干细胞特异的microRNAs与O
5、ct4，Sox2，Nanog共转染分化细胞,分析相应的microRNA是否对iPS的诱导有促进作用；3，在前述基础上，选择有明显促iPS诱导作用的microRNA，以此为探针，寻找其在调控多能性干细胞的信号传导和表现修饰的靶点以及调控机制。1.3 iPS中的信号通路iPS细胞是通过在成体细胞中转入四个因子（即转录因子）实现的。除了表观遗传学修饰改变以外，转入的转录因子必然引起相应的基因转录激活等一系列事件。因此我们将对iPS细胞在基因表达水平上进行广谱性的研究，了解体细胞重编程过程中有哪些基因表达发生显著改变；这些显著改变的基因具有怎样的时序表达规律；这些显著改变的基因之间可能形成哪些关键的调
6、控网络，它们决定着重编程的全过程以及细胞的命运。我们将1. 分析体细胞、iPS以及胚胎干细胞（ESC）的基因表达差异，确定显著性上调的和下调的基因；2. 分析体细胞在重编程过程中不同时间的基因表达变化，确定每一天显著性上调和下调的基因，从而明确基因表达在整体水平上的时序性；3. 根据以上结果分析确定的基因，分别按重编程过程中细胞改变最显著的5个方面，即细胞周期，能量代谢，染色质DNA甲基化，组蛋白修饰以及细胞黏附分子，进行聚类，获得在以上5个方面基因表达变化最为显著的亚群，根据文献中的已知基因功能信息，初步确定可能的基因表达调控网络；4. 利用定量PCR结合过表达或shRNA下调目的基因表达，
7、验证以上分析结果中的基因表达变化和调控网络模型。此外，我们将关注人类iPS细胞形成过程中，维持hESCs全能性及自更新至关重要的Activin，FGF信号通路的表达改变情况：其表达变化是否被Oct4，Nanog，Sox2和Lin28等外源基因调控；其表达改变是否对iPS细胞的形成所必需。在人类iPS细胞系形成之后，Activin，FGF信号对其正常维持及扩增是否起关键作用。研究Activin，FGF信号是否能促进人类iPS细胞的形成，并尝试在人类iPS细胞形成过程中使用Activin，FGF等生长因子替代部分的转录因子。在理解信号传导通路的同时，我们还将探索化学小分子作为诱导者的可能性。既然有
8、可能通过转入四个因子改变细胞的表型，那么这四个因子所涉及的信号通路必然有化学小分子可以激活。我们已经注意到，在人类成熟体细胞转化为iPS细胞的突破性研究中，美国研究小组所用的4个基因（Oct4, Nanog, Sox2, Lin28）中有2个与日本小组（Oct4, Sox2, c-myc, klf4）的不同。据此我们推测，成熟体细胞的重编程存在多个信号途径，这些不同信号通路间很可能会有协同作用。我们最近的研究发现，Oct4, Nanog, Sox2, Lin28, c-myc与klf4一起，能够非常显著地提高成熟体细胞向iPS细胞转化的效率，诱导效率比oct4, Sox2, Lin28和 Na
9、nog诱导高8倍（人）及10倍（小鼠），而且6个因子诱导后克隆形成的起始时间也比4个因子早2天左右。这一发现不仅证实了我们的推测，更为本项目研究iPS细胞信号转导机制研究奠定了坚实的基础。我们将从4个和6个因子诱导iPS过程中表观遗传修饰的不同变化着手，结合生物信息学分析，逐步研究和发掘iPS形成的表观遗传机制和涉及的关键细胞信号转导通路，并研究这些细胞信号转导通路的小分子抑制剂和激动剂对iPS形成的作用，最终发现提高iPS诱导效率的策略。这样的研究有望解决iPS诱导中使用大量病毒和外源基因可能带来肿瘤形成等副作用，有重要的科学技术价值和前景。2以其他类型细胞为出发点，诱导其成为多能干细胞，改
10、进以及优化iPS诱导分化为神经、心肌、血液以及肝细胞的诱导方案研究诱导体细胞成为神经、心肌、肝细胞和造血细胞等特化细胞的方案最近的iPS细胞概念的出现，说明了只要通过少数基因的操作，就可以启动本来已经处于分化状态的体细胞的重编程，使之返回到相当于ES细胞的分化程度，并使其又重新具有了ES细胞的基本生物学特性。这一进展的发生，无疑为临床上个性化干细胞治疗的研究提供了一个全新的思路。本课题将基于iPS细胞的基本原理，进行皮肤成纤维细胞向神经肝、造血和心肌等成体细胞的诱导分化，并将通过对其调控机制的研究找到可启动皮肤成纤维细胞重编程的关键因子，进而建立可以产生源于皮肤成纤维细胞的诱导型成体细胞的技术
11、体系，为各种疾病的细胞治疗准备条件。我们将建立iPS的技术平台，诱导iPS逐步向造血细胞分化，在此基础上系统筛选体细胞诱导为iPS的过程中以及iPS向血细胞分化过程中由于表观遗传学修饰而沉默或者表达激活的基因；进一步获得其中具有重要功能的基因，并在明确这些基因功能的基础上深入阐明其作用机制。与此同时，对iPS与ES细胞向血细胞的诱导分化过程中的表观遗传学调控机制进行比较分析。此课题有望获得在iPS重编程以及iPS向血细胞分化的过程中的受表观遗传学调控的重要功能基因，有助于人们探索iPS的调控机制。我们将从肝损伤小鼠模型中和已有的数据库中筛选可启动皮肤成纤维细胞的肝向编程的候选相关因子，建立皮肤
12、成纤维细胞肝向诱导体系；分析诱导型肝干细胞基本生物学特性；并研究皮肤成纤维细胞肝向转化的重编程机制。我们已经建立了人胚胎干细胞向肝脏细胞、胰腺细胞定向分化的有效体系，并建立了分化过程中不同分化阶段的报告体系。我们计划利用我们已有的胚胎干细胞定向向胰腺及肝脏细胞分化的技术平台，分选胰腺和肝脏分化不同阶段的细胞为靶细胞，比较不同分化阶段细胞的四因子重编程效率，并利用分化过程中不同分化阶段的报告体系，寻找靶细胞形成IPS细胞过程中早期的重编程分子标志，并以此为基础研究调控重编程起始的关键因子，从而进一步优化诱导iPS形成的策略。 与此相类似的，我们还将采用我们已经建立的诱导胚胎干细胞向神经和心脏分化
13、的体系，诱导iPS细胞定向分化，并且在疾病动物模型中研究源于iPS细胞的分化细胞移植到体内的功能。二、预期目标总体目标：在阐明iPS细胞重编程的分子机制上有突破性进展。阐明四个因子如何在激活全能性基因的同时抑制体细胞中的组织特异性基因表达，使体细胞重新获得干细胞的特性。找出在这一细胞被重编程（即去分化）过程中起关键作用的未知因子及其分子机理。从表观遗传学修饰、microRNA表达、广谱性基因表达和信号转导等不同层面上研究iPS细胞与ES细胞和核移植ES细胞的差别，阐明iPS细胞重编程的分子机制；在此基础上探索以化学小分子诱导iPS的可能性；以iPS 细胞为起点建立和优化诱导分化为神经、血液以及
14、肝细胞的方案并研究iPS细胞植入体内的安全性；探索以非病毒的途径和从其他细胞建立iPS的可能性；探索建立iPS细胞临床储备的可能性，全面推动iPS走向临床应用。发展壮大从事iPS研究的队伍。五年预期目标：1、为了阐明iPS细胞重编程的分子机制，我们将从表观遗传修饰、microRNA表达，由四个转录因子所引发的广谱性的基因表达水平上、以及与全能性有关的信号传导通路上，通过将 iPS和ES细胞、尤其是和核移植ES进行比较，通过利用多种细胞来产生iPS，从而了解iPS中细胞重编程进程中的重要分子事件。 2、 预期该课题结题时有多于60篇的研究论文发表在高水平的国际学术刊物上，其中影响因子大于5的20
15、-40篇，影响因子大于10的10-20篇；申请专利5-10项。3、 培养博士后10-15人，博士研究生30-50人名，培养和壮大国内干细胞及iPS的研究队伍。三、研究方案课题一 iPS重编程过程中的表观遗传学调控作用承担单位：中国科学院上海生命科学研究院课题负责人：王纲所占经费比例：42%本课题的研究内容主要为：DNA甲基化、组蛋白乙酰化等翻译后修饰、microRNAs、转录因子及mediator等辅因子、以及它们间的相互作用在iPS细胞形成中的作用及机制。目的在于回答哪些表观遗传修饰参与iPS重编程过程的调控，有多大作用，这些表观遗传修饰的特异性如何，由谁决定，从而构建调节iPS细胞形成的表
16、观遗传网络，深入阐明iPS形成的表观遗传机制，并发掘其中起关键作用的靶分子。1建立去除DNA甲基化的方法。基因组的甲基化状态在细胞增殖时是通过维持性甲基转移酶Dnmt1的作用得到保持的。如果能特异性地抑制Dnmt1的酶学功能，我们有可能使Oct4、Nanog等基因的启动子区域发生去甲基化。但已有甲基转移酶的抑制剂为核酸类似物，在引起DNA去甲基化的同时会产生基因组不稳定性及细胞凋亡等不良反应。用siRNA knockdown Dnmt1也对细胞产生类似不良影响。其中一个原因是Dnmt1甲基转移酶（1616个氨基酸）是一个多功能蛋白，蛋白本身可能对体细胞的稳定增殖是必需的。因此我们需要用特异性的
17、方法阻断Dnmt1在细胞S期DNA复制时的甲基化功能。这一目标可以通过特异性地抑制Dnmt1与PCNA和Np95的相互作用来实现。有充分证据显示，PCNA和Np95负责将Dnmt1招募到S期核内的复制位点行使其功能。也可在MEF中导入植物DNA去甲基化酶来实现内源全能性基因的去甲基化。2在已改变DNA甲基化谱式的MEF细胞中用非病毒方法导入转录因子进行iPS诱导，研究内源基因Oct4、Nanog转录激活的分子机理。我们先用直接干预DNA甲基化的方法促进体细胞内源Oct4、Nanog等全能性基因的表观遗传改变，此举旨在降低对外源转录因子的要求，从而改变重编程进程。目前一般认为外源转录因子合适的表
18、达起始、持续时间，合适的表达强度等各种因素的有效组合是体细胞重编程成功的关键，迄今使用的、通过反转录病毒介导的外源基因表达刚好能满足这一要求。我们将在诱发DNA去甲基化的体细胞中，测试不同导入方法（如利用编码转录因子的mRNA），不同转录因子的组合和不同时间点与导入剂量，观察对内源基因Oct4与Nanog激活的影响，分析启动子区域染色质重塑各分子事件（如组蛋白H3K9去甲基化，H3K4甲基化，核小体排布，转录启动复合体到位）的相互联系，同时探索诱导iPS的理想途径。3利用“晶芯 DNA甲基化芯片”。系统分析iPS的重编程过程中CpG岛甲基化状态的改变：分别制备成熟体细胞、iPS细胞与ES细胞的
19、Genomic DNA，利用Bisulfite Sodium对其进行修饰， 进一步利用“晶芯 DNA甲基化芯片”（博奥生物有限公司产品）对样本中的CpG 岛的甲基化状态进行分析。分析在将体细胞向多能干细胞分化的过程中，DNA甲基化状态的变化。并在此体系中尝试对ES细胞和iPS的DNA甲基化状态进行系统比较分析。4获得可能参与重编程过程的候选功能基因，明确候选基因的功能并探讨其作用机制。获得甲基化状态发生改变的CpG岛，进一步利用亚硫酸钠处理后的测序分析（Bisulfite Sodium Modification and Sequencing）等手段验证候选基因的启动子区域的甲基化状态，并明确其
20、下游基因的表达。并进一步分析表观遗传学（包括DNA 甲基化，组蛋白修饰）对其表达的调控机制。结合已有的研究信息，选择可能参与重编程过程的候选功能基因。检测候选基因的在iPS的重编程中所发挥的作用，并对其可能的作用机制进行探讨。5MicroRNAs在iPS的诱导和维持中的重要作用。在iPS诱导系统中,分析和发现general microRNAs和胚胎干细胞特异的microRNAs被激活的时间图谱。方法是：用少量细胞提取和合成microRNA和cDNA的方法,结合qc-PCR的方法和micro RNA chip来检测microRNA的表达。在上一步的基础上,我们选择在不同时间激活的胚胎干细胞特异的
21、microRNAs与Oct4,Sox2,Nanog共转染分化细胞,分析相应的microRNA是否对iPS的诱导有促进作用.在以上两步的基础上,我们选择有明显促iPS诱导作用的microRNA,以此为探针,寻找其在调控多能性干细胞的信号传导和表现修饰的靶点以及调控机制.6.建立四环素诱导的Oct4,Sox2,c-Myc,Klf4四因子的逆转率病毒系统。通过四环素诱导的、逆转率病毒介导四个转录因子的表达，将小鼠体细胞将其重编程为全能性干细胞，从基因表达和遗传修饰（如组蛋白乙酰化和甲基化）等方面进一步研究四个转录因子诱导的体细胞重编程的动态过程，并与体细胞核移植相比较，观察两种重编程是否存在相似性。
22、7组蛋白修饰在iPS重编程过程中的作用。利用ChIP-on-chip，研究组蛋白翻译后修饰在iPS的诱导和维持中的作用。在转录调控中，DNA甲基化总是和组蛋白的修饰连在一起，很多情况下有因果关系，并协同作用。因此，研究清楚DNA甲基化在iPS中的作用，离不开对该过程中组蛋白修饰，尤其是组蛋白乙酰化和甲基化的研究。我们将在iPS诱导系统中，利用Agilent的ChIP-on-chip芯片研究分析和发现组蛋白修饰变化的规律和时间图谱。并且在此基础上，利用Agilent的ChIP-on-chip芯片分析Oct4,Sox2,c-Myc,Klf4等因子与基因启动子结合情况，比对这些因子的结合与特定区域组
23、蛋白修饰间的关系，并利用已有文献和生物信息学方法分析，可能参与iPS的关键组蛋白修饰酶，研究这些酶在iPS中的机制。尝试寻找提高iPS效率及安全诱导的新策略。课题二 iPS重编程过程中的基因表达调控网络承担单位：中国科学院广州生物医药与健康研究院课题负责人：舒晓东所占经费比例：33%本课题的研究内容主要为：iPS细胞形成过程中基因激活和沉默的时间顺序，以及这些激活和沉默的基因组成了哪些与细胞周期，细胞能量代谢，DNA的甲基化，组蛋白的修饰（乙酰化和甲基化），以及细胞连接等有关的调控网络。目的在于回答哪些基因的激活和沉默是iPS细胞形成所必需的，也就是发现iPS形成中起关键作用的未知因子。同时，
24、希望搭建iPS形成过程中的关键基因表达调控网络。应用iPS标准诱导程序，将四个转录因子c-Myc、Klf4、Sox2和Oct4转入小鼠脑膜成纤维细胞（Meningeal fibroblast）中，使其诱导产生标准的iPS。跟踪整个诱导过程每天取样，应用基因芯片（DNA microarray）技术跟踪病毒感染后细胞每天的基因表达谱；与此同时，根据已有研究结果，只用 Klf4、Sox2和Oct4也可以形成iPS，虽然成功率较低，我们也将利用此三因子或c-Myc、Klf4和Sox2组合（缺少Oct4不能产生iPS的对照），用标准流程诱导, 跟踪整个诱导过程，应用基因芯片（DNA microarray
25、）的技术跟踪病毒感染后每天的细胞基因表达谱；对照同种小鼠的胚胎干细胞系的基因芯片结果和美、日科学家报道的基因芯片结果，重点分析iPS形成过程中全基因组的基因表达变化，分析基因表达发生变化的时间次序；在以上分析的基础上，重点分析五个关键亚类中的基因在整个过程中的基因表达变化：细胞周期；细胞能量代谢；DNA的甲基化；组蛋白的修饰（乙酰化和甲基化）；细胞连接。找出关键基因，构建可能的调控网络模型；对以上提出的调控网络模型，首先应用荧光定量PCR方法验证所找出的关键基因的在iPS的形成过程中是否真正在发生预想的变化；其次对确认有预期显著变化的基因，构建相应的shRNA或过表达载体，在iPS实验中同时感
26、染，观察对iPS形成的影响，进一步结合DNA芯片分析，确定候选基因在调控网络中的功能；根据以上结果，修正调控网络模型，完成iPS形成过程中关键调控网络的搭建。课题三：iPS在克隆及定向分化中的功能分析承担单位：中国科学院上海生命科学研究院课题负责人：冯立新所占经费比例：25% 本课题的研究内容主要为：iPS细胞分化为生殖细胞、iPS细胞分化为神经元和视网膜前体细胞（外胚层）、以及iPS细胞分化为心肌和肝细胞（中、内胚层）的研究，并与ES细胞的分化做比较同时，通过体内移植验证由iPS细胞产生的终末分化细胞的安全性和治疗功能。目的在于回答iPS细胞和ES细胞定向分化的异同，以及ES细胞定向分化研究
27、的哪些成果可以直接应用于iPS研究，不能直接应用的原因和机制是什么。1. 利用克隆技术，证明已建系的iPS细胞的全能性。主要进行以下试验：1.1 2N囊胚的注射：证明iPS细胞是否能形成三胚层细胞并能够形成配子细胞遗传给下一代。已有的报道已证明iPS能在注入2N囊胚后获得嵌合体并能通过生殖系遗传给后代，因此我们也需要通过此方法证明我们建立的iPS细胞系在体内分化成多种细胞的能力。1.2 4N囊胚的注射：进一步证明的iPS发育潜力的方法是4N囊胚注射，因为通过此方法获得的小鼠，胚外组织是来源于4N的细胞，而小鼠则完全来自iPS细胞。已有的文献中通过此方法获得了发育到中后期的iPS胚胎，但没有发育
28、到期的iPS小鼠的诞生，因此本研究拟用我所建立的不同的iPS细胞系进行4N囊胚注射，观察iPS小鼠在体内的发育情况。1.3 比较用4个转入因子及6个转入因子获得的iPS细胞系在注入2N及4N囊胚后的发育能力的不同。1.4 iPS细胞的核移植，证明iPS细胞全能性的最好方法是进行一步法核移植，本研究将用iPS的核注入到去核的小鼠卵母细胞中以观察重构胚胎在体外及体内的发育能力。1.5 培养来自老龄小鼠的体细胞，用核移植以及iPS技术来研究老龄体细胞重编程的能力，以及端粒酶活性及端粒长度的问题。iPS细胞若在人类的疾病治疗中应用，面对的一个大的群体是老龄人。因此我们将用小鼠作为模型研究老龄体细胞能否
29、通过导入转入因子的方法被逆转形成多能干细胞，以及验证这种iPS细胞的发育潜能。另外，老龄体细胞端粒的长度已大大缩短，在核移植研究中，体细胞端粒的长度是可以被逆转从而延长，但在来自老龄体细胞的iPS细胞中是否也发生了类似的现象，我们还不知道，因此我们将： 1）培养来自老龄小鼠多种组织的体细胞。2）转入多因子入体细胞中后诱导形成iPS。3）2N及4N囊胚注射以证明iPS的发育能力。4）研究培养的体细胞及获得的iPS细胞的端粒酶活性及端粒长度。同时我们正在探索建立微量CHIP方法来研究组蛋白乙酰化和甲基化对克隆胚胎重编程过程表达调控的分子机理。2. 比较体细胞克隆与iPS重编程机理2.1将继续对体细
30、胞核移植后其表观遗传修饰的重编程进行研究，通过胚胎的免疫荧光染色研究组蛋白乙酰化修饰发生的重编程现象。证明这些修饰对于重编程克隆胚胎的发育具有重要作用。同时我们正在探索建立微量CHIP方法来研究组蛋白乙酰化和甲基化对克隆胚胎重编程过程表达调控的分子机理。2.2研究比较由SCNT建立的核移植胚胎干细胞（NTES），iPS和正常胚胎干细胞是否存在差异，这对于今后能否应用于临床具有重要的参考价值。他人的DNA 芯片结果显示NTES与正常胚胎干细胞在广谱基因表达上没有差异，我们近期已对来源于不同品系小鼠NTES和正常ES其印记基因以及组蛋白修饰进行了比较研究，并且我们正在对其小RNA(microRNA
31、)进行进一步的比较，研究两者之间在转录后修饰是否相似，因为转录后修饰对于最终蛋白的表达具有重要作用，而microRNA已被证明在调控mRNA转录后的翻译上起重要作用。我们将进一步研究iPS是否与正常ES在以上方面存在相似性。3. 以胚胎干细胞再生和分化所必需的信号传导和表观遗传修饰调控网络为标志，分析和阐明在再编程过程中建立这些调控系统的时间与空间上核心机制，寻找非转基因途径诱导iPS的有效靶点。根据以上的研究结果，设计和试验非转基因途径，如如小分子化合物，诱导无致瘤性iPS，并与胚胎干细胞比较其在分化途径，效率相似性功能有效性等方面的异同，进而验证其体内的生理功能。利用制作iPS细胞的思路，
32、从成纤维细胞等成体细胞组织获得组织前体细胞/组织干细胞，以解决从胚胎干细胞向特定细胞分化效率低的瓶颈问题，缩短其到应用的路程。四、年度计划年度研究内容预期目标第一年分别进行四因子和三因子的iPS诱导，跟踪整个诱导过程每天取样，应用基因芯片（DNA microarray）技术跟踪病毒感染后细胞每天的基因表达谱。分析iPS形成过程中全基因组的基因表达变化，分析基因表达发生变化的时间次序；1、 建立2株以上小鼠iPS细胞系并予以鉴定，建立一株人的与不孕症有关的iPS细胞系，建立带有标记的iPS细胞系，建立iPS细胞诱导方案。2、 获得iPS细胞形成过程中全基因组的基因表达谱，找出表达变化有差异的基因
33、并确认其 变化的时间位点。3、 获得细胞由成纤维细胞到iPS细胞过程中其CpG岛甲基化状态，基因启动子区乙酰化和甲基化状态，microRNA的动态变化水平。第二年在第一年研究分析的基础上，重点分析三个关键亚类中的基因在整个过程中的基因表达变化：细胞周期；细胞能量代谢；DNA的甲基化；1、 诱导小鼠iPS细胞向神经，心肌和肝细胞分化，了解由iPS细胞来源的分化细胞特性，探索诱导iPS细胞向生殖细胞分化的方案。2、 确定4-6个在iPS 细胞形成中基因表达差异明显的基因并完成对其验证。3、 揭示iPS形成过程中OCT4等全能性有关的关键基因其启动子区DNA去甲基化的分子机制；发现iPS形成过程中组
34、蛋白修饰的变化及其对基因转录调控的机制。第三年在第一年研究分析的基础上，重点分析两个关键亚类中的基因在整个过程中的基因表达变化：组蛋白的修饰（乙酰化和甲基化）；细胞连接；1、建立有效的诱导iPS 细胞向心肌、神经和生殖细胞分化的方案并建立高效的分离已分化的细胞；2、揭示在iPS 细胞形成过程中表达明显有差异的基因对iPS细胞重编程的作用，明确其影响的关键信号通路；3、揭示在 iPS细胞形成过程中组蛋白修饰microRNA 和关键转录因子的作用。第四年在前三年研究分析的基础上，提出的可能调控网络模型，首先应用荧光定量PCR方法验证所找出的关键基因在iPS的形成过程中是否真正在发生预想的变化1、利
35、用已有的实验模型，将由iPS细胞分化的神经、心肌等细胞植入体内，观察植入细胞的存活及功能情况；2、进一步明确在iPS细胞重编程过程中表达差异明显的基因通过哪些信号通路起作用；3、明确DNA甲基化对iPS细胞重编程的作用，揭示microRNA 和转录因子在iPS形成中的分子机制。第五年对确认有预期显著变化的基因，构建相应的shRNA或过表达载体，在iPS实验中同时感染，观察对iPS形成的影响，进一步结合DNA芯片分析，确定候选基因在调控网络中的功能，修正调控网络模型，完成iPS形成过程中关键调控网络的搭建。1、 测试由iPS细胞分化所得的神经等细胞在疾病模型动物中的修复效果。2、 验证并明确在iPS细胞形成过程中表达差异基因的作用规律，明确其在整个基因调控网络中的作用。3、 阐明DNA去甲基化、组蛋白修饰、microRNA已经转录因子在iPS形成中所起的作用，进一步分析它们在整个基因调控网络中的作用。13