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1、抗体工程制药抗体工程制药20112011年年6 6月月第一节第一节概述概述第二节第二节单克隆抗体单克隆抗体第三节第三节基因工程抗体基因工程抗体第四节第四节噬菌体抗体工程噬菌体抗体工程第五节第五节转基因动物表达抗体转基因动物表达抗体第六节第六节抗体工程在制药功业上的应用抗体工程在制药功业上的应用第一节第一节概概述述一、抗体定义一、抗体定义抗体（抗体（antibody，Ab）：）：指能与相应抗原特指能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。异性结合的具有免疫功能的球蛋白。免疫球蛋白（免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）:具有抗具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白体活性或化学结构
2、与抗体相似的球蛋白IgAb化学结构上的概念化学结构上的概念生物学功能上的概念生物学功能上的概念二、抗体工程发展历程二、抗体工程发展历程1890年，年，Behring和北里柴三郎发现白喉抗毒素和北里柴三郎发现白喉抗毒素1937年，年，Tiselius等人用电泳法将血清蛋白分为等人用电泳法将血清蛋白分为白蛋白、甲种（白蛋白、甲种（）球蛋白、乙种（）球蛋白、乙种（）球蛋白、）球蛋白、丙种（丙种（）球蛋白，并证明抗体活性主要存在于）球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。丙种球蛋白组分。1975年，年，KhlerandMilstein等首次利用等首次利用B淋巴淋巴细胞杂交瘤技术制备出细胞杂交瘤
3、技术制备出McAb.在临床上主要用于在临床上主要用于诊断和治疗。诊断和治疗。1984年报道了人年报道了人鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体多克隆抗多克隆抗体体单克隆单克隆抗体抗体基因工程基因工程抗体抗体整体水平抗体生成技术细胞工程抗体生成技术基因工程抗体生成技术基因工程抗体生成技术多克隆抗体（抗血清）多克隆抗体（抗血清）单克隆抗体单克隆抗体嵌合抗体、改形抗体嵌合抗体、改形抗体“小型化抗体小型化抗体”（单链抗体）（单链抗体）组合抗体库技术组合抗体库技术 噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术 IgIg基因转基因小鼠基因转基因小鼠抗体真核表达技术抗体真核表达技术三、抗体分子的结构与功能三、抗体分子的结构与功能1、酶解
4、片段、酶解片段木瓜蛋白酶 (1)Fab(1)Fab段段2 2个个(2)Fc(2)Fc段段 1 1个个胃蛋白酶(1)F(ab)2段段1个个(2)Fc段段1个个 (1)Fab(1)Fab段段2 2个抗原结合片段个抗原结合片段 fragmentwithantigenbinding (2)Fc段段1个可结晶片段个可结晶片段fragmentcrystallized （1）Porter木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶(1)F(ab)2段段1个个结合颗粒性抗原出现凝集反应结合颗粒性抗原出现凝集反应(2)Fc段段1个个无生物学活性无生物学活性（2）Nisonoff胃蛋白酶胃蛋白酶（1 1）、轻链（）、轻链（light c
5、hainlight chain，L L链）链）214214个氨基酸残基，个氨基酸残基，24KD24KD。分为：分为：与与2 2个亚型。个亚型。（2 2）、重链（）、重链（heavy chainheavy chain，H H链）链）450-550450-550个氨基酸残基，个氨基酸残基，55-75KD55-75KD。分为分为5 5类，类，、链。链。IgMIgM，IgGIgG，IgAIgA，IgDIgD，IgEIgE。2、重链和轻链、重链和轻链3、可变区和恒定区、可变区和恒定区（1 1）可变区（）可变区（Variable regionVariable region，V V区）区）L L链链N N端
6、端 1/21/2处处（VLVL）110110个个aaaa;H H链链N N端端1/5-1/41/5-1/4处处（VHVH）118118个个aaaa。互补决定区互补决定区（complementaritycomplementarity-determining-determining region,CDRregion,CDR），），HVR1HVR1，HVR2HVR2，HVR3HVR3又分别称为又分别称为CDR1CDR1，CDR2CDR2，CDR3CDR3骨架区骨架区（framework region,FRframework region,FR）高变区高变区（hypervariablehypervar
7、iable region,HVR region,HVR）（2 2）恒定区（）恒定区（constant regionconstant region，C C区）区）L L链链C C端端1/21/2处，处，105105个个aaaa;H H链链C C端端3/4-4/53/4-4/5处，处，331-431331-431个个aaaa。在同一种属动物中是比较恒定的,是制备第二抗体进行标记的重要基础。4、功能区、功能区 链内二硫键折叠成球形区称为功能区链内二硫键折叠成球形区称为功能区，约由约由110110个个aaaa组成。组成。（1 1）L L链：链：2 2个，个，VLVL，CLCL各各1 1（2 2）H H
8、链：链：IgGIgG，IgAIgA，IgDIgD：4 4个（个（V V区区1 1个，个，C C区区3 3个）个）IgMIgM，IgEIgE：5 5个（个（V V区区1 1个，个，C C区区4 4个）个）（3 3）功能区的作用：）功能区的作用：（a a）VLVL和和VHVH：结合抗原决定簇（结合抗原决定簇（FVFV区）区）（b b）CLCL和和CHCH：具有同种异型的遗传标记具有同种异型的遗传标记（c c）CH2CH2：结合补体结合补体（d d）CH3CH3：结合结合FcFc受体受体单核细胞，巨噬细胞，粒细胞，单核细胞，巨噬细胞，粒细胞，B B细胞，细胞，NKNK细胞细胞C+V2Fab+FcF(
9、ab)2+FcV=FR+HVR=FR+CDRC=CL+CH1+CH2+CH3Ab=CDR1CDR2CDR3第二节第二节单克隆抗体单克隆抗体McAb是将抗体产生细胞与具有无限增殖能是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合，通过有限稀释法及克隆力的骨髓瘤细胞融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。由于这种抗体是针对一个抗原决定族的生的。由于这种抗体是针对一个抗原决定族的抗体，又是单一的抗体，又是单一的B淋巴细胞克隆产生的，故淋巴细胞克隆产生的，故称为单克隆抗体。称为单克隆抗体。一、单克隆抗体制备过程一、单克隆抗体制备
10、过程注射抗原注射抗原B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选细胞融合、筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞细胞培养细胞培养筛选，继续培养筛选，继续培养足够数量的、能产生足够数量的、能产生特定抗体的细胞群特定抗体的细胞群体外培养体外培养（注射到小鼠腹腔）（注射到小鼠腹腔）体内培养体内培养单克隆抗体单克隆抗体传统传统抗血清抗血清抗抗 原原免免 疫疫所有抗所有抗体体混合混合1 23412341 234脾脾脾脾 脏脏脏脏淋巴結淋巴結淋巴結淋巴結B B B B 細胞細胞細胞細胞多克隆抗体制备过程多克隆抗体制备过程1234mmmm12341234单单抗抗细细胞融合胞融合取出脾細胞取出脾細胞+癌細胞癌細胞各
11、抗各抗体体分分开开单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程1 1、抗原与动物免疫、抗原与动物免疫 抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原免疫动物：免疫动物：BALB/cBALB/c小鼠或小鼠或LouLou大鼠大鼠免疫方法：体内免疫和体外免疫免疫方法：体内免疫和体外免疫2 2、细胞融合与杂交瘤细胞的选择培养、细胞融合与杂交瘤细胞的选择培养 基本方法：取适量脾细胞（基本方法：取适量脾细胞（1*108）与骨髓瘤）与骨髓瘤细胞（细胞（2*1073*107）进行混合，在）进行混合，在PEG作用作用下诱导它们融合，时间控制在下诱导它们融合，时间控制在2min以内，然以内，然后用培养液将后用培
12、养液将PEG融合液缓慢稀释融合液缓慢稀释用于细胞融和的骨髓瘤细胞应具备融和率高，自用于细胞融和的骨髓瘤细胞应具备融和率高，自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定等特点。力强且长期稳定等特点。PEG的相对分子质量和浓度越大，其促融和率越的相对分子质量和浓度越大，其促融和率越高。但其黏度和对细胞的毒性也随之增大。常用浓高。但其黏度和对细胞的毒性也随之增大。常用浓度为度为40%50%，相对分子质量，相对分子质量4000为佳。相对分子为佳。相对分子质量在质量在4006000，浓度在，浓度在10%60%范围内的范围内的PEG都都能使细胞发
13、生融合。为了提高融合率，在能使细胞发生融合。为了提高融合率，在PEG溶液溶液中加入中加入DMSO，以提高细胞接触的紧密性，增加融，以提高细胞接触的紧密性，增加融合率。但必须严格限制接触时间。合率。但必须严格限制接触时间。（1 1）细胞融合液中的细胞类型：）细胞融合液中的细胞类型：4 4或或5 5种。种。（2 2）如何去除脾）如何去除脾-瘤以外的融和细胞？瘤以外的融和细胞？HAT培养基：培养基：H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤次黄嘌呤A（Aminopterin）：）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径合成主要途径T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；
14、胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成供细胞通过替代途径合成DNAHATHAT选择作用：选择作用：淋巴细胞：淋巴细胞：不能生长，不能生长，5 57 7天死亡；天死亡；DNADNA合成的合成的主要途径被主要途径被A A阻断阻断骨髓瘤细胞：骨髓瘤细胞：不能生长，不能生长，5 57 7天死亡；天死亡；HGPRTHGPRT缺缺乏，乏，DNADNA合成的替代途径受阻合成的替代途径受阻杂交瘤细胞：杂交瘤细胞：长期生长繁殖；利用淋巴细胞长期生长繁殖；利用淋巴细胞的的HGPRT，将，将H合成为嘌呤碱并最终与合成为嘌呤碱并最终与T一起一起合成合成DNA3 3、筛选阳性克隆与克隆化、筛选阳
15、性克隆与克隆化 常用的克隆化方法：有限稀释法和软琼脂法。常用的克隆化方法：有限稀释法和软琼脂法。有限稀释法：把杂交有限稀释法：把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到瘤细胞悬液稀释后，加入到9696孔板孔板，使每孔中在理论上只含有一个细胞。第一，使每孔中在理论上只含有一个细胞。第一次克隆化时也要应用次克隆化时也要应用HTHT培养液，以后的克隆化可用培养液，以后的克隆化可用不含不含HTHT的的RPMI 1640RPMI 1640培养液。培养液。软琼脂法：在培养液中加入软琼脂法：在培养液中加入0.5%0.5%的琼脂糖凝胶，的琼脂糖凝胶，细胞分裂后形成小球样团块，由于培养基是半固体细胞分裂后形成小球样团块，由
16、于培养基是半固体状态，可用吸管吸出，移入状态，可用吸管吸出，移入9696孔板培养。孔板培养。4 4、单抗检测、单抗检测RIARIA（放射免疫测定）（放射免疫测定）ELISAELISA（酶联免疫吸附试验）（酶联免疫吸附试验）FACSFACS（流式细胞仪）（流式细胞仪）IFAIFA（间接免疫荧光法）（间接免疫荧光法）配制方案：配制方案：杂交瘤细胞（杂交瘤细胞（1 15 5）x10 x106 6/ml)+/ml)+细胞冻存液细胞冻存液(30%(30%40%40%牛血清，牛血清，50%50%60%RPMI-164060%RPMI-1640培养液，培养液，10%DMSO)10%DMSO)“慢冻慢冻”：分
17、步冷冻，分步冷冻，30-7030-70液氮液氮“快融快融”：取出立即浸入取出立即浸入37374040水浴中，使其迅速融化、水浴中，使其迅速融化、复苏复苏5 5、杂交瘤细胞的冻存与复苏、杂交瘤细胞的冻存与复苏细胞冷冻的意义：细胞冷冻的意义：防止污染防止污染避免染色体丢失避免染色体丢失防止非分泌细胞的过度生长防止非分泌细胞的过度生长防止细胞密度过高而死亡防止细胞密度过高而死亡经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐代易引起染
18、色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还应尽早使用获得的抗体阳性杂渐减弱甚至消失，还应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。交瘤细胞株制备单克隆抗体。6 6、单克隆抗体的大量制备、单克隆抗体的大量制备可获得可获得10g/ml的抗体。多采用的抗体。多采用RPMI1640培养液，培养液，添加添加10%20%胎牛或小牛血清。但由于培养液中含有胎牛或小牛血清。但由于培养液中含有血清成分，总蛋白量可达血清成分，总蛋白量可达100g/ml以上，给纯化带来以上，给纯化带来困难。加入小牛血清又是发生支原体污染的原因，而困难。加入小牛血清又是发生支原体污染的原因，而且批间质量差异太大，直
19、接且批间质量差异太大，直接影响杂交瘤细胞的生长。影响杂交瘤细胞的生长。改良的方法有：无血清改良的方法有：无血清培养法、悬浮培养法、微载体培养法、悬浮培养法、微载体悬浮悬浮培养法。培养法。无血清培养法无血清培养法：利用白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、乙：利用白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛血清。此法虽可减少污染，但醇胺等混合物代替小牛血清。此法虽可减少污染，但产量不高。产量不高。悬浮培养法悬浮培养法：连续悬浮培养的细胞密度可：连续悬浮培养的细胞密度可2*107/ml,收收集的单克隆抗体可达集的单克隆抗体可达400g/ml。如在培养液中加入微。如在培养液中加入微载体，细胞密度可达载体，细
20、胞密度可达108。（1）体外培养法：）体外培养法：基本程序：接种前基本程序：接种前12周，小鼠腹腔注射周，小鼠腹腔注射0.5mlPristane（降植烷）或用液体石蜡，然后注射（降植烷）或用液体石蜡，然后注射1*106杂杂交瘤细胞，交瘤细胞，712d便有腹水生成，待生成腹水后再提便有腹水生成，待生成腹水后再提取，离心去细胞沉淀，取上清液冻存。取，离心去细胞沉淀，取上清液冻存。优点：操作简便，比较经济，所得单克隆抗体量多优点：操作简便，比较经济，所得单克隆抗体量多且效价高，还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已污且效价高，还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌的杂交瘤细胞株。染杂菌的杂交瘤细胞株
21、。缺点：小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给缺点：小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化带来难度。纯化带来难度。（2）动物体内诱生法）动物体内诱生法可获得可获得10m/ml的抗体。常用方法的抗体。常用方法。腹腔注射法腹腔注射法7 7、单克隆抗体的纯化、单克隆抗体的纯化根据根据Ig的类和亚类以及用途选择不同的纯化方法：的类和亚类以及用途选择不同的纯化方法：体外诊断试剂体外诊断试剂IgG类类-沉淀处理沉淀处理+亲和层析亲和层析IgM类类-沉淀处理沉淀处理+凝胶过滤凝胶过滤体内诊断试剂或治疗用药体内诊断试剂或治疗用药-亲和层析亲和层析+阴离子交换阴离子交换层析，注意除去毒素、病毒、核酸等微量的
22、污染物。层析，注意除去毒素、病毒、核酸等微量的污染物。盐析沉淀盐析沉淀亲和层析亲和层析离子交换层析离子交换层析 McAbMcAb的纯化的纯化 8 8、单克隆抗体的性质鉴定单克隆抗体的性质鉴定IgIg类型、亚类测定：类型、亚类测定：双扩法或双扩法或ELISAELISA法法特异性测定：特异性测定：抗原类似物的交叉反应抗原类似物的交叉反应效价测定：效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示用腹水或培养液的稀释度表示表位测定：表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的几株单抗是否为不同表位特异的,用竞用竞争抑制争抑制法，相加指数法及微机集群分析法，相加指数法及微机集群分析亲和性测定：亲和性测定：测定亲和常数测定
23、亲和常数K K杂交瘤细胞染色体：杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠秋水仙素裂解法，小鼠B B细胞染色体细胞染色体4040条，条，SP2/0SP2/0细胞细胞6868条，杂交瘤细胞一般条，杂交瘤细胞一般100100多条多条McAbMcAb靶抗原分子量：靶抗原分子量：常用常用western blotwestern blot单克隆抗体的特性单克隆抗体的特性高度特异性高度特异性高度的均一性和可重复性高度的均一性和可重复性 弱凝集反应和不呈现沉淀反应弱凝集反应和不呈现沉淀反应对环境敏感性对环境敏感性A、McAb均是鼠源性抗体，应用于人体内可产均是鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗体（生人抗鼠抗体
24、（HAMA），加速了排斥反应，在），加速了排斥反应，在人体内的半衰期只有人体内的半衰期只有56h，维持有效药物作用，维持有效药物作用靶组织时间；靶组织时间；B、完整的抗体分子的相对分子质量过大，难以、完整的抗体分子的相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。McAb在免疫导向疗法中存在的问题（障碍）：在免疫导向疗法中存在的问题（障碍）：A、降低、降低McAb的免疫源性；的免疫源性；B、降低、降低McAb的相对分子质量的相对分子质量需要解决的问题：需要解决的问题：解决问题的方法或途径解决问题的方法或途径基因工程技术基因工程技术1984年
25、报道了人年报道了人鼠嵌合抗体，之后制备鼠嵌合抗体，之后制备出了改型抗体、单链抗体、单域抗体、最小出了改型抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等多种类型，基本上消除了抗体的识别单位等多种类型，基本上消除了抗体的鼠源性（免疫源性），相对分子质量只有完鼠源性（免疫源性），相对分子质量只有完整抗体分子的整抗体分子的1/801/3。优点优点 ：在体外在体外“永久永久”地存活并传代地存活并传代用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗
26、可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗单克隆抗体的优点与局限性单克隆抗体的优点与局限性局限性局限性 ：固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围反应强度不如多克隆抗体反应强度不如多克隆抗体制备技术复杂、费时费工、价格较高制备技术复杂、费时费工、价格较高第三节第三节基因工程抗体基因工程抗体基因工程抗体基因工程抗体(Geneticengineeringantibody)指用基因工程方法，对抗体的基因进行重组、指用基因工程方法，对抗体的基因进行重组、缺失、修饰改型等，构建载体，在受体细胞中表缺失、修饰改型等，构建载体，在受体细胞中表达，获得抗体。达，
27、获得抗体。将小鼠将小鼠IgIg基因敲除，转染人基因敲除，转染人IgIg基因，在基因，在小鼠体内产生人小鼠体内产生人AbAb，再经杂交瘤技术，产生，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体大量完全人源化抗体一、人源化抗体一、人源化抗体鼠源性单克隆抗体的改造目的和原理鼠源性单克隆抗体的改造目的和原理目的：一是降低免疫源性；目的：一是降低免疫源性；二是降低相对分子量，增加组织通透性二是降低相对分子量，增加组织通透性 原理：抗体同抗原结合的功能决定于抗体分子原理：抗体同抗原结合的功能决定于抗体分子的可变区（的可变区（V V），同种性免疫源性则决定于抗体），同种性免疫源性则决定于抗体分子的稳定区（分子的稳
28、定区（C C）。在基因水平上把鼠源性单）。在基因水平上把鼠源性单克隆抗体的克隆抗体的H H和和L L链的链的V V区基因分离出来，分别与区基因分离出来，分别与人人IgIg的的H H链和链和L L链的链的C C区基因连接，即成为人区基因连接，即成为人鼠鼠嵌合抗体的嵌合抗体的H H和和L L链基因，再共转染骨髓瘤细胞，链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达出完整的嵌合抗体就能表达出完整的嵌合抗体.人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。恒定区融合而得到的抗体。方法：方法：将鼠源单抗的可变区基因克隆出来，连到包含有人将鼠源单抗的可
29、变区基因克隆出来，连到包含有人抗体恒定区基因及表达所需的其它元件抗体恒定区基因及表达所需的其它元件(如启动子、增如启动子、增强子、选择标记等强子、选择标记等)的表达载体上，在哺乳动物细胞的表达载体上，在哺乳动物细胞(如骨髓瘤细胞、如骨髓瘤细胞、CHOCHO细胞细胞)中表达。中表达。特点：特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性减少了鼠源性抗体的免疫原性 保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力（一）嵌合抗体（一）嵌合抗体 尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很多，但有时尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很多，但有时它仍可能引发较强的免疫反应。为了进一步降低抗它仍可能引发较强的免疫反应。为
30、了进一步降低抗体的鼠源成分，发展出体的鼠源成分，发展出CDRCDR移植技术。移植技术。CDRCDR移植即把鼠抗体的移植即把鼠抗体的CDRCDR序列移植到人抗体的序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称可变区内，所得到的抗体称CDRCDR移植抗体或改型抗移植抗体或改型抗体，也就是人源化抗体。体，也就是人源化抗体。（二）改型抗体（二）改型抗体 经过经过CDRCDR移植，抗移植，抗体的免疫原性极低，而体的免疫原性极低，而其抗原结合能力保持不其抗原结合能力保持不变变结合半抗原及全抗原结合半抗原及全抗原(如细胞表面受体、病毒如细胞表面受体、病毒等等)的改形抗体都已有报的改形抗体都已有报道，到现在已有数
31、百种人道，到现在已有数百种人源化抗体。（美国正式上源化抗体。（美国正式上市的市的11种治疗性单抗中多种治疗性单抗中多数是改型抗体）数是改型抗体）人源化抗体的构建可用人源化抗体的构建可用人源化抗体的构建可用人源化抗体的构建可用全合成法全合成法全合成法全合成法或或或或定点突定点突定点突定点突变法变法变法变法。全合成法全合成法全合成法全合成法是以人抗体序列为骨架，以鼠抗是以人抗体序列为骨架，以鼠抗是以人抗体序列为骨架，以鼠抗是以人抗体序列为骨架，以鼠抗体的体的体的体的CDRCDRCDRCDR置换人抗体的置换人抗体的置换人抗体的置换人抗体的CDRCDRCDRCDR，将整个可变区序列，将整个可变区序列，
32、将整个可变区序列，将整个可变区序列的两条链分解成若干片段，并使相邻的片段具的两条链分解成若干片段，并使相邻的片段具的两条链分解成若干片段，并使相邻的片段具的两条链分解成若干片段，并使相邻的片段具有彼此互补的粘性末端。合成所有有彼此互补的粘性末端。合成所有有彼此互补的粘性末端。合成所有有彼此互补的粘性末端。合成所有DNADNADNADNA片段，每片段，每片段，每片段，每组片段分别退火，然后逐组连接成完整的可变组片段分别退火，然后逐组连接成完整的可变组片段分别退火，然后逐组连接成完整的可变组片段分别退火，然后逐组连接成完整的可变区基因，插入质粒中，进一步即可用于构建和区基因，插入质粒中，进一步即可
33、用于构建和区基因，插入质粒中，进一步即可用于构建和区基因，插入质粒中，进一步即可用于构建和表达改形抗体。表达改形抗体。表达改形抗体。表达改形抗体。定点突变法定点突变法定点突变法定点突变法是将人的可变区基因克隆，根是将人的可变区基因克隆，根是将人的可变区基因克隆，根是将人的可变区基因克隆，根据鼠抗体的据鼠抗体的据鼠抗体的据鼠抗体的CDR CDR CDR CDR 序列合成几种突变引物，用定序列合成几种突变引物，用定序列合成几种突变引物，用定序列合成几种突变引物，用定点突变的方法将人的可变区基因的点突变的方法将人的可变区基因的点突变的方法将人的可变区基因的点突变的方法将人的可变区基因的CDRCDRC
34、DRCDR序列变为序列变为序列变为序列变为鼠抗体的鼠抗体的鼠抗体的鼠抗体的CDRCDRCDRCDR序列，然后表达出改型抗体。序列，然后表达出改型抗体。序列，然后表达出改型抗体。序列，然后表达出改型抗体。研究表明，在构建改形抗体时，简单地进行研究表明，在构建改形抗体时，简单地进行研究表明，在构建改形抗体时，简单地进行研究表明，在构建改形抗体时，简单地进行CDRCDRCDRCDR替换并不能保证抗体具有好的亲和力，因此替换并不能保证抗体具有好的亲和力，因此替换并不能保证抗体具有好的亲和力，因此替换并不能保证抗体具有好的亲和力，因此在构建时还必需包括在构建时还必需包括在构建时还必需包括在构建时还必需包
35、括对影响抗原结合位点的空对影响抗原结合位点的空对影响抗原结合位点的空对影响抗原结合位点的空间结构的框架序列间结构的框架序列间结构的框架序列间结构的框架序列进行操作。进行操作。进行操作。进行操作。FabFab：抗原结合片断抗原结合片断FvFv：可变区片段可变区片段ScFvScFv：单链可变区片段单链可变区片段单域抗体单域抗体最小识别单位最小识别单位 二、小分子抗体二、小分子抗体分子量较小但具有抗原结合功能的分子片段。分子量较小但具有抗原结合功能的分子片段。基基因工程小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的因工程小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的V V区片段，其相对分子质量仅为原抗体区片段，其相对分子质
36、量仅为原抗体1/801/31/801/3。FvFvScFvScFv单区单区抗体抗体最小识别单位最小识别单位FabFab 由完整的由完整的由完整的由完整的轻链和轻链和轻链和轻链和FdFdFdFd组成，大小为完整分子的组成，大小为完整分子的组成，大小为完整分子的组成，大小为完整分子的1/31/31/31/3。把把把把FabFabFabFab与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用下与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用下与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用下与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用下FabFabFabFab进入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗原的活进入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗原的活进入质周腔
37、，装配折叠后，它具有结合抗原的活进入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗原的活性。性。性。性。(1)Fab(1)Fab(1)Fab(1)Fab FvFvFvFv、ScFvScFvScFvScFv的大小约为全分子的的大小约为全分子的的大小约为全分子的的大小约为全分子的1/61/61/61/6。(2)Fv(2)Fv(2)Fv(2)Fv 或或或或 ScFvScFvScFvScFv FvScFv连接肽连接肽连接肽连接肽FvFvFvFv由由由由VHVHVHVH与与与与VLVLVLVL构成，由于其结合是非共价结合，构成，由于其结合是非共价结合，构成，由于其结合是非共价结合，构成，由于其结合是非共价结合，故故故
38、故FvFvFvFv不稳定。在不稳定。在不稳定。在不稳定。在VHVHVHVH与与与与VLVLVLVL之间加上一段连接肽，把之间加上一段连接肽，把之间加上一段连接肽，把之间加上一段连接肽，把VHVHVHVH与与与与VLVLVLVL连成一条单链，得到连成一条单链，得到连成一条单链，得到连成一条单链，得到ScFvScFvScFvScFv，即单链抗体即单链抗体即单链抗体即单链抗体。连接肽连接肽连接肽连接肽的长度在的长度在的长度在的长度在10-1510-1510-1510-15个氨基酸左右，不宜太长个氨基酸左右，不宜太长个氨基酸左右，不宜太长个氨基酸左右，不宜太长或太短，它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等
39、或太短，它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等或太短，它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等或太短，它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等特点。常用的连接肽是特点。常用的连接肽是特点。常用的连接肽是特点。常用的连接肽是(GGGGS)(GGGGS)(GGGGS)(GGGGS)3 3 3 3。单链抗体单链抗体单链抗体单链抗体的构建在已知亲本的构建在已知亲本的构建在已知亲本的构建在已知亲本DNADNADNADNA序列时可用完序列时可用完序列时可用完序列时可用完全全全全人工合成法人工合成法人工合成法人工合成法单链抗体最常用的表达体系是单链抗体最常用的表达体系是单链抗体最常用的表达体系是单链抗体最常用的表达体系是大
40、肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌 即为即为即为即为VHVHVHVH，约为完整分子的约为完整分子的约为完整分子的约为完整分子的1/121/121/121/12。它只由一个。它只由一个。它只由一个。它只由一个结构域构成，故称结构域构成，故称结构域构成，故称结构域构成，故称单域抗体。单域抗体。单域抗体。单域抗体。单域抗体尽管亲单域抗体尽管亲单域抗体尽管亲单域抗体尽管亲和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。(3)(3)单域抗体单域抗体VH 约为完整分子的约为完整分子的约为完整分子的约
41、为完整分子的1/80-1/701/80-1/701/80-1/701/80-1/70大小，一般由一大小，一般由一大小，一般由一大小，一般由一个个个个CDRCDRCDRCDR构成，它也保持着抗体的特异性。构成，它也保持着抗体的特异性。构成，它也保持着抗体的特异性。构成，它也保持着抗体的特异性。(4)(4)最小识别单位最小识别单位CDR可以用细菌发酵生产，成本低可以用细菌发酵生产，成本低;分子小，穿透力强分子小，穿透力强;不含不含Fc，没有，没有Fc带来的效应带来的效应;在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出;易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒
42、易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或酶标抗体等素或酶标抗体等。小分子抗体的优点及应用小分子抗体的优点及应用应用：应用：用于肿瘤的导向治疗用于肿瘤的导向治疗肿瘤的影像分布肿瘤的影像分布基因治疗基因治疗优点优点：三、双特异性抗体和多价抗体三、双特异性抗体和多价抗体双链抗体双链抗体 （DiabodyDiabody）一词最早由）一词最早由HollingerHollinger等于等于19931993年创造。乃是一种小分年创造。乃是一种小分子的双价双特异性抗体片段。子的双价双特异性抗体片段。双特异性抗体双特异性抗体(bispecificbispecific antibody,BSAbantibo
43、dy,BSAb)是指能同时识别是指能同时识别2 2种抗原的抗体。种抗原的抗体。1 1种为对应肿瘤相关抗原。另种为对应肿瘤相关抗原。另1 1种为对应效应成种为对应效应成分。分。即能即能结合靶肿瘤细胞结合靶肿瘤细胞又能又能结合高细胞毒性结合高细胞毒性的效应细胞的效应细胞,将效应细胞富集在肿瘤周围将效应细胞富集在肿瘤周围,而且而且可以模拟天然配体的作用可以模拟天然配体的作用,与细胞表面引发分子与细胞表面引发分子结合结合,激活效应细胞激活效应细胞,实现对肿瘤细胞的杀伤和实现对肿瘤细胞的杀伤和裂解。裂解。HollingerHollinger等巧妙地将抗原抗体的轻链可变区等巧妙地将抗原抗体的轻链可变区基因
44、基因(VLA)(VLA)与抗抗原抗体的重链可变区与抗抗原抗体的重链可变区(VHB)(VHB)通通过短肽连接子连接过短肽连接子连接;同样地同样地,将将VHAVHA与与VLBVLB连接连接,将两将两组组嵌合基因嵌合基因置于双顺反子的表达质粒中置于双顺反子的表达质粒中,构建成双构建成双链抗体的表达质粒链抗体的表达质粒,目前报道的表达质粒均为双顺目前报道的表达质粒均为双顺反子。表达后反子。表达后,VLA VHB,VLA VHB与与VHA VLBVHA VLB交叉连结交叉连结,形成形成双特异性抗体。双特异性抗体。所以双特异性抗体与既往肿瘤免疫治疗相比所以双特异性抗体与既往肿瘤免疫治疗相比,除除了能了能特
45、异性识别肿瘤细胞特异性识别肿瘤细胞外外,还能还能将循环血液中的免将循环血液中的免疫效应细胞再导向至肿瘤细胞处疫效应细胞再导向至肿瘤细胞处,从而使效应细胞的从而使效应细胞的抗肿瘤活性增强抗肿瘤活性增强,发挥免疫导向作用发挥免疫导向作用,这是肿瘤治疗这是肿瘤治疗的新突破。的新突破。分别分离纯化两种不同的分别分离纯化两种不同的McAbMcAb，使各抗体，使各抗体解离为单价抗体，再使两种不同抗原特异性的解离为单价抗体，再使两种不同抗原特异性的单价抗体通过化学试剂交联起来，然后分离出单价抗体通过化学试剂交联起来，然后分离出目的组分。此法缺点是容易导致抗体失去活性，目的组分。此法缺点是容易导致抗体失去活性
46、，产物均一性不佳。产物均一性不佳。化学交联化学交联BsAb 将两种分泌不同特异性单抗的杂交瘤细胞进将两种分泌不同特异性单抗的杂交瘤细胞进行再次融合，产生四源杂交瘤行再次融合，产生四源杂交瘤 (quadromaquadroma)。但但二次杂交瘤细胞株分泌的是两套重链，轻链的随二次杂交瘤细胞株分泌的是两套重链，轻链的随机组合物。机组合物。BsAbBsAb在其中的比例可为在其中的比例可为10%10%50%50%不等。不等。多倍杂交瘤细胞的稳定性差，多倍杂交瘤细胞的稳定性差，BsAbBsAb的产量少且活的产量少且活性低，费时费力，临床应用时存在人抗鼠抗体免性低，费时费力，临床应用时存在人抗鼠抗体免疫反
47、应疫反应 (HAMA)(HAMA)，因此不适用于临床。，因此不适用于临床。细胞工程细胞工程BsAb 多采用抗体分子片段多采用抗体分子片段,如如FabFab，FvFv或或ScFvScFv,经基因操作修饰后经基因操作修饰后,或体或体外组装为外组装为BsAbBsAb,或直接表达分泌型或直接表达分泌型的的BsAbBsAb。基因工程基因工程BsAb从广义讲应属于双功能抗体范畴。从广义讲应属于双功能抗体范畴。（1）配基）配基配基型融合蛋白，如配基型融合蛋白，如CD4-Fc.（2）配基）配基Ig型嵌合抗体，如型嵌合抗体，如IL-2-Ig（3）配基）配基FV型嵌合蛋白，如型嵌合蛋白，如CD4-FVCD3(4)
48、受体受体FV型融合蛋白型融合蛋白（5）酶）酶抗体型融合蛋白（抗体型融合蛋白（abeneyme,抗体酶）抗体酶）四、抗体融合蛋白四、抗体融合蛋白第四节第四节 噬菌体抗体工程噬菌体抗体工程 它是在它是在它是在它是在PCRPCRPCRPCR技术和技术和技术和技术和Phage DisplayPhage DisplayPhage DisplayPhage Display的基础上实的基础上实的基础上实的基础上实现的。其过程是把用现的。其过程是把用现的。其过程是把用现的。其过程是把用PCRPCRPCRPCR法得到的抗体基因插入法得到的抗体基因插入法得到的抗体基因插入法得到的抗体基因插入丝状噬菌体的丝状噬菌体
49、的丝状噬菌体的丝状噬菌体的DNADNADNADNA，与噬菌体外壳蛋白的基因相，与噬菌体外壳蛋白的基因相，与噬菌体外壳蛋白的基因相，与噬菌体外壳蛋白的基因相连，在辅助噬菌体的帮助下，噬菌粒包装成丝状连，在辅助噬菌体的帮助下，噬菌粒包装成丝状连，在辅助噬菌体的帮助下，噬菌粒包装成丝状连，在辅助噬菌体的帮助下，噬菌粒包装成丝状噬菌体，抗体分子通过与噬菌体，抗体分子通过与噬菌体，抗体分子通过与噬菌体，抗体分子通过与P P P P 或或或或PPPP相连，在噬相连，在噬相连，在噬相连，在噬菌体表面的一端或分散分布，然后可直接对噬菌菌体表面的一端或分散分布，然后可直接对噬菌菌体表面的一端或分散分布，然后可直
50、接对噬菌菌体表面的一端或分散分布，然后可直接对噬菌体表面的抗体分子进行筛选。体表面的抗体分子进行筛选。体表面的抗体分子进行筛选。体表面的抗体分子进行筛选。噬菌体抗体库技术 19901990年年Mc Mc CaffertyCafferty等成功地建立了等成功地建立了噬菌体表面展示系噬菌体表面展示系统统，通过将抗溶菌酶单链抗体基因克隆于通过将抗溶菌酶单链抗体基因克隆于fdfd噬菌体基因噬菌体基因3 3的下游，使的下游，使ScFvScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，利以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，利用亲和层析，两轮富集达用亲和层析，两轮富集达10106 6倍。该技术的成功给抗体基倍。该技术