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1、20152015版药典微生物检验变化总结版药典微生物检验变化总结 内容提要内容提要2015年版微生物学检验中的重大年版微生物学检验中的重大修订修订1、实验环境的重大修订 无菌检查环境洁净度规定 微生物限度检查环境洁净度规定 2、培养系统的重大修订 无菌检查中培养基的修订 微生物计数法中培养基的修订 控制菌检查法中培养基的修订 抑菌效力测定法中培养基的修订纯化水及注射用水检查的修订3、方法学验证方面的修订4、对一、二、三部微生物学附录的整合、修订 一、实验环境的重大修订一、实验环境的重大修订2010年版年版2015年版年版无菌检查：应在洁净度10000级背景下的局部100级单向流空气区域内或隔离
2、系统中进行。无菌检查：应在洁净度B级背景下的局部A级单向流空气区域内或隔离系统中进行。微生物限度检查：应在洁净度10000级背景下的局部100级单向流空气区域内进行。微生物限度检查：应在受控洁净环境下（不低于D级）的局部不低于B级单向流空气区域内进行。按实验性质修订微生物学检验环境洁净度按实验性质修订微生物学检验环境洁净度 二、培养系统的重大修订培养系统的重大修订 1.无菌检查法无菌检查法 变更内容 1.1无菌检查方面，使用胰酪胨大豆肉汤（胰酪胨大豆液体培养基/大豆酪蛋白肉汤培养基）取代改良马丁培养基与硫乙醇酸盐流体培养基配合进行细菌和真菌的全面微生物检测。1.2菌液制备环节，使用胰酪胨大豆肉
3、汤、胰酪胨大豆琼脂取代营养肉汤、营养琼脂进行金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和大肠埃希氏菌的菌液制备。1.3菌液制备环节，使用沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基取代改良马丁培养基、改良马丁琼脂进行白色念珠菌和黑曲霉菌液的制备，同时对沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂的配方配方进行了变更（动物组织胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物替代蛋白胨）1.4适用性试验中，胰酪胨大豆肉汤使用枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉进行灵敏度检查；硫乙醇酸盐流体培养基使用金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌、生孢梭菌、铜绿假单胞菌进行灵敏度检查。二、培养系统的重大修订培养系统的重大修订 1.无菌
4、检查法无菌检查法 1.5胰酪胨大豆肉汤支持广泛微生物的生长，包括需氧菌、兼性厌氧菌、真菌（主要是需氧菌和真菌）；改良马丁培养基主要用于培养真菌；硫乙醇酸盐流体培养基培养需氧、厌氧和微需氧微生物（是厌氧菌的首选培养基）。二、培养系统的重大修订培养系统的重大修订 2.2.非无菌产品微生物限度检查非无菌产品微生物限度检查 变更内容 2.1 供试品制备环节，除了pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液、pH6.8磷酸盐缓冲液、pH7.6磷酸盐缓冲液外，添加了pH7.2磷酸盐缓冲液和胰酪胨大豆肉汤。2.2菌液制备环节，使用胰酪胨大豆肉汤、胰酪胨大豆琼脂取代营养肉汤、营养琼脂进行金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢
5、杆菌、乙型副伤寒沙门氏菌和大肠埃希氏菌的菌液制备；使用沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基取代改良马丁培养基、改良马丁琼脂进行白色念珠菌和黑曲霉菌液的制备，同时对沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂的配方配方进行了变更（动物组织胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物替代蛋白胨）；使用梭菌增菌培养基取代硫乙醇酸盐流体培养基进行生孢梭菌菌液的制备。二、培养系统的重大修订培养系统的重大修订 2.2.非无菌产品微生物限度检查非无菌产品微生物限度检查 2.3 微生物计数环节，使用胰酪胨大豆琼脂取代营养琼脂进行需氧菌计数；增加需氧菌的MPN法计数，该方法使用胰酪胨大豆肉汤；使用沙氏葡萄糖琼脂取代玫瑰红钠琼
6、脂进行霉菌和酵母菌总数测定，同时增加玫瑰红钠琼脂、沙氏葡萄糖琼脂(含抗生素)两种选择性培养基于对因沙氏葡萄糖琼脂上生长的细菌使霉菌和酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求情况下的霉菌和酵母菌计数；取消了使用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)对酵母菌进行计数的试验环节。2.4适用性试验中，胰酪胨大豆琼脂培养基使用金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉进行适用性检查（铜绿代替大肠更有挑战性，铜绿生长时会产生类似表面活性剂的一些抑制成分）；沙氏葡萄糖琼脂培养基使用白色念珠菌和黑曲霉进行适用性检查检查。二、培养系统的重大修订培养系统的重大修订 2.2.非无菌产品微生物限度检查
7、非无菌产品微生物限度检查 2.5 TSA培养基含有动物来源和植物来源的蛋白胨，营养丰富，对某些较难生长的细菌均能生长，对酵母菌、霉菌也均能生长，而营养琼脂培养基其实就是一种无选择性的较低营养成分的固体培养基，主要用于细菌菌落计数；2.6 SDA培养基：培养真菌和酵母菌，抑制细菌生长，玫瑰红钠琼脂培养基具有抑制细菌生长，并可减缓霉菌生长过快而导致菌落蔓延生长，具有专属性。（SDA代替玫瑰因为玫瑰其实是选择性培养基，没有SDA那么有广谱性）同时：同时：2015版中使用版中使用“需氧菌需氧菌”取代了以往的取代了以往的“细菌细菌”，从而使得胰酪胨，从而使得胰酪胨大豆琼脂计数所得不仅仅代表细菌，而是还包
8、含真菌等其它在此培养大豆琼脂计数所得不仅仅代表细菌，而是还包含真菌等其它在此培养基上生长的微生物菌落。基上生长的微生物菌落。二、培养系统的重大修订培养系统的重大修订 2.2.非无菌产品微生物限度检查非无菌产品微生物限度检查 2.7 增加了耐盐革兰氏阴性菌的检验项目。2.8 简化了大肠埃希氏菌的检验流程。2.9 取消了对大肠菌群的检验。2.10 变更了沙门氏菌检验中前增菌、增菌、分离用的所有培养基类别。2.11 变更了铜绿假单胞菌检验中增菌、分离用的培养基类别，取消了绿脓菌素的直接试验。2.12 取消了金黄色葡萄球菌的选择性增菌，改为无选择性增菌，同时变更了分离培养基。2.13梭菌检验流程基本无
9、变化，仅取消了对3%过氧化氢酶试验的检验要求。2.14 白色念珠菌的检验取消了牙管试验，其余方法未变，但所用培养基配方有所调整。二、培养系统的重大修订二、培养系统的重大修订 3.纯化水和注射用水微生物限度检查纯化水和注射用水微生物限度检查 3.1 采用R2A 琼脂培养基取代营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基检测供试品中需氧菌总数。3.2 R2A 琼脂培养基适用性检查试验 照通则1105 中“计数培养基适用性检查”的胰酪大豆胨琼脂培养基的适用性检查方法进行，试验菌株为铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌。3.3 对已经处理过的水，营养琼脂培养基适合快速生长的细菌培养，可能会抑制部分生长缓慢或受损细菌，因此
10、只检出了水样细菌总数中很少的一部分,其他未检出细菌根本就不能在检测环境中生长,或者生长相对缓慢,在设定时间内不能形成可见菌落。原因：细菌存活但不能被检出；培养基的选择性；培养方法的固有缺陷；细菌的亚致死受损与再生长 二、培养系统的重大修订二、培养系统的重大修订3.纯化水和注射用水微生物限度检查纯化水和注射用水微生物限度检查3.4 R2A培养基酵母浸出粉 0.5g 提供微量元素和维生素 蛋白胨 0.5g、酪蛋白水解物 0.5g 提供氮源、碳源、维生素、氨基酸、矿物质 葡萄糖 0.5g 提供碳源 可溶性淀粉 0.5g 中和细菌代谢的有毒物质 磷酸二氢钾 0.3g pH值缓冲剂 无水硫酸镁 0.02
11、4g 提供二价阳离子和硫酸根离子 丙酮酸钠 0.3g 修复收损细菌 琼脂 15g 纯化水 1000ml 由于R2A培养基能促进受损细菌的恢复性再生长,其在20下培养7d获得的最高菌落数总是高于营养琼脂和玫瑰红钠琼脂培养基，R2A 均匀徐布法计数结果更高；细菌在R2A 培养基上的生长速度要慢,形成的菌落要小,在48h内,准确计数困难,因而需要延长培养时间,使菌落生长得足够大,但不会或少融合生长；有利于刺激受损细菌和对氯有耐药性细菌的生长。三、方法学验证方面的修订三、方法学验证方面的修订1.无菌检查无菌检查法法 方法方法学试验中菌的修订学试验中菌的修订2010版药典版药典2015版药典版药典硫乙醇
12、酸盐流体培养基-金葡、枯草、铜绿、生孢4种菌硫乙醇酸盐流体培养基-金葡、铜绿、生孢3种菌改良马丁培养基-白念、黑曲霉2种菌胰酪胨大豆肉汤培养基-枯草、白念、黑曲霉3种菌2010版药典版药典2015版药典版药典不能从外观上判断有物微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中，细菌培养2天，真菌培养3天不能从外观上判断有物微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中，培养3天薄膜过滤法中的修订薄膜过滤法中的修订三、方法学验证方面的修订三、方法学验证方面的修订2.2.非无菌产品微生物限度检查非无菌产品微生物限度检查 方法学试验中菌的修订方法学试验中菌的修订2010版药典版药典2015版药
13、典版药典细菌计数-金葡、枯草、大肠3种菌总需氧菌计数-金葡、枯草、铜绿铜绿、白念、黑曲霉5种菌酵母菌、霉菌计数-白念、黑曲霉2种菌酵母菌、霉菌计数-白念、黑曲霉2种菌在最后一次冲洗液中加入直接加入供试液中回收率：大于70%回收率：0.5-2执行微生物限度标准的修订执行微生物限度标准的修订101cfu可接受的最大限度为可接受的最大限度为20102cfu可接受的最大限度为200103cfu可接受的最大限度为2000以此类推四、对一、二、三部微生物学附录的整合、修订 1101无菌检查法 一部 B 无菌检查法 二部 H 无菌检查法 三部 A 无菌检查法 1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法 一部 C 微生物限度检查法 二部 J 微生物限度检查法 三部 G 微生物限度检查法 1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法 一部 C 微生物限度检查法 二部 J 微生物限度检查法 三部 G 微生物限度检查法 1107非无菌药品微生物限度标准 一部 C 微生物限度检查法 二部 J 微生物限度检查法 三部 G 微生物限度检查法 1121抑菌效力检查法 一部 D 抑菌剂效力检查法指导原则 二部 N 抑菌剂效力检查法指导原则 三部 A 抑菌剂(防腐剂)效力检查法指导原则 谢谢大家!