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1、第三章 高效液相色谱第1页，本讲稿共30页一、一、HPLCHPLC与与GCGC差别差别 1 1分析对象的区别分析对象的区别 GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较 低的样品；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样 品，尤其对大多数生化样品不可检测 占有机物的20%HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括 有机介质溶液），不受样品挥发性和 热稳定性的限制，对分子量大、难 气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%第2页，本讲稿共30页2 2 2 2流动相差别的区别流动相差别的区别流动相差别的区别流动相差别的区别GCGC：流动相为惰性，气体
2、组分与流动相无亲合作用：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用 力，只与固定相有相互作用。力，只与固定相有相互作用。HPLCHPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用 力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起 正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改 变流动相极性和变流动相极性和pHpH值也对分离起到调控作用，当值也对分离起到调控作用，当 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 也可以增大分离选择性。也可以增大分离
3、选择性。3 3 3 3操作条件差别操作条件差别操作条件差别操作条件差别GCGC：加温操作：加温操作HPLCHPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）第3页，本讲稿共30页1 1贮液罐（滤棒，可滤贮液罐（滤棒，可滤贮液罐（滤棒，可滤贮液罐（滤棒，可滤 去颗粒状物质）去颗粒状物质）去颗粒状物质）去颗粒状物质）2 2高压泵（输液泵）高压泵（输液泵）高压泵（输液泵）高压泵（输液泵）3 3进样装置进样装置进样装置进样装置4 4色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱分离分离分离分离5 5检测器检测器检测器检测器分析分析分析分析6 6废液出口或组分收集器废液出口或组分收集器废液出口或
4、组分收集器废液出口或组分收集器 7 7记录装置记录装置记录装置记录装置n n二、高效液相色谱仪流程图二、高效液相色谱仪流程图第4页，本讲稿共30页三、三、HPLC的特点和实际应用的特点和实际应用1 1、利用其高柱效（、利用其高柱效（n=10n=104 4片片/米），有效分离极复杂米），有效分离极复杂 体系中的痕量组分。体系中的痕量组分。正相色谱分离有机溶剂中的物质正相色谱分离有机溶剂中的物质 反相色谱分离水溶液中的物质反相色谱分离水溶液中的物质-生化物质。生化物质。2 2、用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对、用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对 色谱法分析离子型体的含量。（蛋白质、氨
5、色谱法分析离子型体的含量。（蛋白质、氨 基酸、常见阴阳离子等）基酸、常见阴阳离子等）3 3、利用多孔凝胶固定相建立空间排阻色谱法可分、利用多孔凝胶固定相建立空间排阻色谱法可分 离高分子化合物。离高分子化合物。4 4、利用手性固定相可以拆分分离具有手性的化、利用手性固定相可以拆分分离具有手性的化 合物。合物。第5页，本讲稿共30页2-2 2-2 2-2 2-2 基本理论和条件选择基本理论和条件选择基础基础理论理论理论理论n n热力学理论：塔板理论平衡理论平衡理论n n动力学理论：速率理论Vander方程一、塔板理论一、塔板理论第6页，本讲稿共30页1.1.二、速率理论（与二、速率理论（与GCGC
6、对比）对比）第7页，本讲稿共30页2 2）涡流扩散项及其影响）涡流扩散项及其影响2.2.讨论：讨论：讨论：讨论：1 1）流动相流速对）流动相流速对HPLCHPLC板高的影响（与板高的影响（与GCGC对比）对比）第8页，本讲稿共30页第9页，本讲稿共30页3 3）传质阻抗项及其影响）传质阻抗项及其影响 第10页，本讲稿共30页第11页，本讲稿共30页1 1三、三、三、三、影响分离的因素影响分离的因素影响分离的因素影响分离的因素第12页，本讲稿共30页1.固定相与装柱方法的选择：选粒径小的、分布均匀的球形固定相选粒径小的、分布均匀的球形固定相 （dp10m）首选化学键合相，匀浆法装柱2.流动相及其
7、流速的选择：选粘度小、低流速的流动相甲醇，约1ml/min 3.柱温的选择：选室温250 0C左右四、四、HPLCHPLC法中分离条件的选择法中分离条件的选择第13页，本讲稿共30页一、液固吸附色谱法（一、液固吸附色谱法（LSCLSC）(liquid-solid adsorption chromatography)二、液液分配色谱法（二、液液分配色谱法（LLCLLC）(liquid-liquid partition chromatography,chemical bonded phase chromatography chemical bonded phase chromatography三、
8、离子色谱法（三、离子色谱法（IC）（ion-exchange chromatography and ion pair chromatography)ion pair chromatography)四、空间排阻色谱法（SEC）（steric exclusion chromatography2-32-3 各类高效液相色谱法简介各类高效液相色谱法简介第14页，本讲稿共30页1 1分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异活性中心能力的差异 分离前提：K不等或k不等一、液固吸附色谱法（一、液固吸附色谱法（LSC）流动相为液体，固定相为固体吸附剂
9、流动相为液体，固定相为固体吸附剂第15页，本讲稿共30页2 2固定相：与固定相：与LCLC比，固定相粒径不同（比，固定相粒径不同（1017%17%分配色谱分配色谱 硅胶失活硅胶失活载体载体 吸附的水吸附的水固定液固定液第17页，本讲稿共30页1 1分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异2 2固定相：载体固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）固定液（物理或机械涂渍法）n n 缺点：系统内部压力大，易流失，不实用缺点：系统内部压力大，易流失，不实用 固定液固定液极性极性NLLCNLLC 固定液固定液非极性非极性RLLCRLLC3 3正相色谱正相色谱正相色谱正
10、相色谱固定液极性固定液极性固定液极性固定液极性 流动相极性流动相极性流动相极性流动相极性（NLLCNLLC）n n 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 适于分离极性组分适于分离极性组分适于分离极性组分适于分离极性组分 反相色谱反相色谱反相色谱反相色谱固定液极性固定液极性固定液极性固定液极性 固定相极性固定相极性 底剂底剂 +有机调节剂（极性调节剂）有机调节剂（极性调节剂）n n 例：水例：水 +甲醇，乙腈，甲醇，乙腈，THFTHF第20页，本讲稿共30页4 4流动相极性与流动相
11、极性与k k的关系：的关系：流动相极性流动相极性，洗脱能力，洗脱能力，k k，组分，组分t tR R 5 5出柱顺序：极性大的组分先出柱出柱顺序：极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱极性小的组分后出柱6 6适用：非极性适用：非极性 中等极性组分（中等极性组分（HPLC80%HPLC80%问题）问题）（三）正相键合相色谱（三）正相键合相色谱（三）正相键合相色谱（三）正相键合相色谱1 1分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、诱导力、或氢键作用力诱导力、或氢键作用力2 2固定相：极性大的氰基或氨基键合相固定相：极性大的氰基或氨基键合相3 3流动相：极性
12、小（同流动相：极性小（同LSCLSC）底剂底剂 +有机极性调节剂有机极性调节剂 n n 例：正己烷例：正己烷 +氯仿氯仿-甲醇，氯仿甲醇，氯仿-乙醇乙醇第21页，本讲稿共30页4 4流动相极性与流动相极性与k k的关系：的关系：流动相极性流动相极性，洗脱能力，洗脱能力，组分，组分t tR R，k k 5 5出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先 出柱极性大的组分后出柱出柱极性大的组分后出柱6 6适用：适用：n n 氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小）氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小）分离物质也相似分离物质也相似n n 氨基键合相与硅胶性质差别
13、大，碱性氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性 分析极性大物质、糖类等分析极性大物质、糖类等第22页，本讲稿共30页1 1 1 1反相离子对色谱法（反相离子对色谱法（反相离子对色谱法（反相离子对色谱法（IPCIPCIPCIPC或或或或PICPICPICPIC）反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分与其中的反离子形成中性离子对，增加与其中的反离子形成中性离子对，增加k k和和t tR R，以改善分离，以改善分离1 1）离子对试剂：烷基磺酸钠）离子对试剂：烷基磺酸钠分析碱分析碱 四丁基季胺盐四丁基季胺盐分析酸分析酸2 2）影响影响影响影响
14、k k的因素的因素的因素的因素a a与与mm的极性有关（同反相色谱）的极性有关（同反相色谱）b b与与R R的链长有关：的链长有关：R R 长，极性长，极性小，小，t tR R，k k 3 3）适用：较强的有机酸、碱）适用：较强的有机酸、碱n n三、离子色谱法（三、离子色谱法（ICICICIC）第23页，本讲稿共30页2 2 2 2反相离子抑制色谱反相离子抑制色谱反相离子抑制色谱反相离子抑制色谱在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相pHpH值，抑制值，抑制组分解离，增加其组分解离，增加其k k和和t tR R，以达到改善分离的目的，以达到改善分离的目的
15、1 1）离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质）离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质 pHpH一定的缓冲溶液一定的缓冲溶液2 2）k k的影响因素：的影响因素：与流动相极性有关，还与与流动相极性有关，还与pHpH值有关值有关n n选择流动相：应同时考虑极性及选择流动相：应同时考虑极性及pHpH值值 酸性物质酸性物质加入酸加入酸HAc tHAc tR R，k k 碱性物质碱性物质加入碱加入碱NHNH3 3HH2 2O tO tR R，k k n n调节调节pHpH范围：范围：3.08.03.08.0 pH8.0 pH8.0 破坏键合相与载体的结合破坏键合相与载体的结合 pH3.0 pH3.0 腐蚀柱子腐蚀柱子3
16、3）适用：极弱酸碱物质）适用：极弱酸碱物质 pH=37pH=37弱酸；弱酸；pH=78pH=78弱碱；两性化合物弱碱；两性化合物第24页，本讲稿共30页2 2对流动相的要求：对流动相的要求：1 1）与固定液不反应）与固定液不反应2 2）对样品有良好溶解度）对样品有良好溶解度 k=110k=110 k=25 k=25 最理想的最理想的3 3）与检测器匹配：）与检测器匹配：UVUV（常用，测定波长应大于溶剂的截止波长）（常用，测定波长应大于溶剂的截止波长）荧光，电化学荧光，电化学4 4）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈）使用前过滤、脱气使用前过滤、脱气
17、第25页，本讲稿共30页3 3洗脱方式洗脱方式 1 1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）类似类似GCGC的等温度洗脱的等温度洗脱2 2）梯度洗脱：）梯度洗脱：在一定分析周期内不断变换流动相的种类在一定分析周期内不断变换流动相的种类 和比例和比例 即不断改变其极性（两个泵）即不断改变其极性（两个泵）适于分析极性差别较大的复杂组分适于分析极性差别较大的复杂组分 类似类似GCGC的程序升温（沸程较长样品）的程序升温（沸程较长样品）第26页，本讲稿共30页第27页，本讲稿共30页2-4 2-4 高效液相色谱
18、仪高效液相色谱仪1 1泵：泵：恒压泵：流量精度不稳恒压泵：流量精度不稳 恒流泵：常用恒流泵：常用2 2进样装置进样装置 1 1）隔膜进样（高分子有机硅胶垫）隔膜进样（高分子有机硅胶垫进样室）进样室）GCGC系统压力较小，可以系统压力较小，可以 HPLCHPLC系统压力太大，必须停泵进样（早期）系统压力太大，必须停泵进样（早期）2 2）阀进样：不必停泵，六通阀）阀进样：不必停泵，六通阀第28页，本讲稿共30页液相色谱第29页，本讲稿共30页3 3色谱柱：直径色谱柱：直径46mm,46mm,柱长柱长1030cm1030cm 柱效评价：色谱系统适应性试验柱效评价：色谱系统适应性试验 R R，n n，f fs s（拖尾因子）（拖尾因子）柱再生：维护、保养、柱子的冲洗柱再生：维护、保养、柱子的冲洗4 4检测器检测器 1 1）紫外检测器：适于吸收紫外光的物质）紫外检测器：适于吸收紫外光的物质 2 2）荧光检测器：只能分析自身发光的物质）荧光检测器：只能分析自身发光的物质 灵敏度高灵敏度高 3 3）示差折光检测器：利用折光率的差别）示差折光检测器：利用折光率的差别 灵敏度低，温度要求严格灵敏度低，温度要求严格 4 4）电化学检测器）电化学检测器 5 5）化学发光）化学发光第30页，本讲稿共30页