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1、第七章 分子发光荧光、磷光 和化学发光n学习目的n通过本章学习，明确分子发光研究的对象，了解分子发光产生的机理，理解分子发光的影响因素。掌握分子发光的一些基本概论，基本仪器结构及定量分析法。本章主要内容n7.1分子荧光、磷光光谱法n7.2分子荧光、磷光和化学结构的关系n7.3影响光致发光的因素n7.4分子荧光、磷光光谱仪n7.5分子荧光、磷光光谱的应用n7.6化学发光光谱法简介7.1分子荧光、磷光光谱法n一、分子荧光、磷光光谱法概述n分子发光荧光荧光fluorescence磷光磷光phosphorescence化学发光化学发光chemiluminescence 光致发光光致发光n光致发光可表示
2、为：nM M*n化学发光可表示为：nA+B C+D*h无辐射跃迁无辐射跃迁IfIphn分子荧光光度法、磷光光度法和化学发光法主要用于定量分析，灵敏度高，线性范围宽，用于测定痕量的无机物和有机物，一般可达ngmL-1。但是，由于方法的高灵敏度，基体干扰严重。因此，发光法可作为液相色谱和毛细管电泳的检测器。n和吸收光谱相比，分子发光除了在定量分析方面应用外，还在许多领域得到应用。n总的来说，分子发光法的应用不如分子吸收光谱法，主要是能产生发光的物质较少。n二、分子荧光、磷光的产生n1.分子的单重态和三重态n根据保里原理，处于分子同一轨道的两个电子自旋方向相反，自旋量子数I分别为+1/2和-1/2，
3、其代数和S=0（总自旋量子数）。自旋多重性2S+1=1，称单重态，用S（singlet）表示。n大多数具有偶数电子的分子（氧分子例外）在室温下都处于单重基态S0，若受能量作用被激发，电子在跃迁过程中自旋方向保持不变为激发单重态。n若电子跃迁过程中自旋方向发生改变，自旋多重性2S+1=3称为激发三重态，用T（triplet）表示。三重态又称亚稳态。第一激发态用S1或T1表示，以后类推。n由洪特规则，ES1ET1n单重态分子具有抗磁性，三重态分子具有顺磁性。n2.荧光、磷光的产生n在室温下，大多数分子均处于基态的最低振动能级，当分子吸收特征辐射后可以跃迁至S1或S2中各个不同振动和转动能级产生吸收
4、，通过无辐射跃迁，它们急剧（10-15s）降落到第一激发单重态的最低振动能级后再回到基态的各个振动能级时，以光的形式驰豫，所发出的光称为荧光（寿命为10-510-8s）。S1S0属允许跃迁。因此，荧光光谱的形状和激发光的波长无关。n处于三重态分子的能量低于相应单重态分子，但通常第一激发三重态的一个振动能级几乎与第一激发单重态的最低振动能级的能量相同，因此，由第一激发单重态的最低振动能级有可能通过系间窜跃至第一激发三重态，在经过振动弛豫回到激发三重态的最低振动能级，然后以光的形式弛豫回到基态，发射磷光（寿命10-410s或更长）。T1S0属禁阻跃迁，速度慢。n激发光一旦停止，则荧光立即停止，而磷
5、光还可持续一段时间。n某些分子在跃迁至T1后，通过热激活有可能再回到S1的各个振动能级，然后再由S1的最低振动能级弛豫回基态而发射荧光，此称延迟荧光。n以上荧光、磷光产生过程可用Jablonski图来说明。7.2分子荧光、磷光和化学结构的关系n一、荧光量子产率（量子产率或荧光效率）n=发射荧光的分子数激发分子总数发射光量子数吸收光量子数kfkf+kinkf荧光发射过程的速率常数。其大小主要取决于化学结构；nki为其它有关过程的速率常数的总和。其大小主要取决于化学环境，同时与结构有关。n二、荧光、磷光与有机化合物结构的关系n1.荧光、磷光的产生是光致发光，目前，我们常用的激发光波长范围在紫外-可
6、见光区，即200800nm，且主要为紫外光。因此，产生荧光、磷光的有机化合物主要为不饱和共轭结构的分子。n例如：苯环与双键的共轭体系、酰基苯衍生物及杂环类衍生物等。n2.大多数荧光物质在激发光照射下吸收能量，首先经历*或n*产生激发态分子，经振动弛豫或其它无辐射跃迁，在发生*或*n产生荧光。n其中*产生的荧光强度大于*n（*的大）。但是在发生n*跃迁时，紧接着产生系间窜跃，最后从*的T1态弛豫回的S0态，产生更强的磷光。n三、无几化合物的荧光n除过渡元素的顺磁性原子会发生线状荧光光谱外，大多数无几盐类金属离子在溶液中不能产生荧光（无辐射跃迁）。但某些金属螯合物（配合物）却能产生很强的荧光。n产
7、生过程：配体吸收光能产生*n配体将能量转移给金属离子导致dd*或ff*，由d*d或f*f弛豫回低能级产生荧光。2,2-二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯8-羟基喹啉羟基喹啉7.3影响光致发光的因素n一、环境对光致发光的影响n1.荧光强度（IF）与溶液浓度（c）的关系n发射的荧光强度应正比于物质吸收的激发光的光强，即n IF=K(I0-I)又由比尔定律I0/I=10-bc并代入上式得：nIF=KI0(1-10-bc)n将式展开，（参见教材139页）n当bc0.05时，式展开中后面项可忽略不计，则n IF=2.303 KbcI0 当I0时n IF=Kcn由上述过程可知，在稀溶液中，IF 和c成线性关系。在较
8、高浓度下，由于分子之间相互作用增强，碰撞几率增大，导致自熄灭。又由于基态分子增多，产生自吸。结果导致IF 和c不成线性关系。n2.溶剂极性的影响n一般来说，随着溶剂介电常数的增大，物质的荧光峰的波长越长，荧光效率越大。n溶剂介电常数增加（即极性增大），*跃迁越容易，因此，激发态分子增多，红移。n另外，在含有重原子如CH3CH2I,CBr4的溶剂中，荧光强度减小，但磷光强度增强。n在溶液中测定物质荧光时，要注意溶剂中杂质的荧光以及溶剂的拉曼光谱可能干扰荧光的测定。消除方法：选用高分辨率的仪器，测定溶剂的拉曼峰，在荧光光谱中加以校正。n3.温度的影响n绝大多数荧光物质在溶液中随温度的升高，IF，I
9、P0。（为什么？）n4.pH值的影响n当荧光物质是弱酸或弱碱时，溶液的pH对荧光强度有较大影响。因为弱酸或弱碱在不同酸度中，分子和离子的电离平衡会发生改变，而荧光物质的荧光强度会因其离解状态发生改变。以苯胺为例：在pH712的溶液中会产生蓝色荧光，在pH13的溶液中都不产生荧光。pH13 无荧光 n二、分子结构的影响n分子产生荧光的条件：物质必须具有能吸收一定频率紫外光的特定结构；物质分子在吸收了一定频率的紫外光后，必须具有较高的荧光效率。n1.具有共轭双键的分子一般有较强的荧光。n2.具有刚性和共平面结构的电子共轭体系的分子，其高。酚酞荧光素n3.苯环上取代基对芳香族化合物荧光和磷光的影响n
10、苯环上取代基不同，会引起化合物最大吸收峰和荧光峰的改变及其强度的变化。n一般来说，给电子取代基如-OH、-NH2常使荧光增强；吸电子取代基如-COOH、C=O减弱甚至破坏荧光。n对于F、Cl、Br、I各一取代的苯，它们的荧光强度随卤原子序数增加而下降，而磷光强度却相反。IF10750上述现象称重原子效应：在重原子中，能级之间上述现象称重原子效应：在重原子中，能级之间的交叉现象比较严重，容易发生自旋轨道的相互的交叉现象比较严重，容易发生自旋轨道的相互作用，增加由单重态转化为三重态的速度，即使作用，增加由单重态转化为三重态的速度，即使系间窜跃速率增加。因此，荧光强度下降，而磷系间窜跃速率增加。因此
11、，荧光强度下降，而磷光强度增加。光强度增加。n三、荧光的熄灭n引起物质荧光强度下降的现象称为荧光的熄灭。能引起荧光强度降低的物质称为熄灭剂。因此，荧光的熄灭主要有以下几个方面：n1.碰撞熄灭n2.能量转移n3.氧的熄灭n4.自熄灭和自吸收7.4分子荧光、磷光光谱仪n分子荧光、磷光光谱仪又称光度计，主要组成为：n光源、单色器（滤光片或光栅）、液槽、检测器、信号处理与显示系统。n一、荧光光度计光源光源第一第一单色器单色器试样池试样池第二第二单色器单色器检测器检测器放大放大显示系统显示系统第一单色器又叫激发单色器第一单色器又叫激发单色器第二单色器又叫发射单色器第二单色器又叫发射单色器n二、激发光谱和
12、荧光光谱(发射光谱)的获得n1.激发光谱的获得n任何荧光物质都具有两个特征光谱，即激发光谱和荧光光谱。n固定第二单色器的波长范围，让激发光源经第一单色器进行分光（波长扫描），测定在不同激发光波长下物质的荧光强度，记录IFex的变化，即可获得物质的激发光谱。n2.荧光光谱的获得n固定激发光的波长和强度，而让物质发出的荧光通过第二单色器测定不同波长的荧光强度，以荧光的波长（em）为横坐标，荧光强度（IF）为纵坐标，即可获得物质的荧光光谱。n例如蒽和硫酸喹啉的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱硫酸喹啉的激发光谱和荧光光谱硫酸喹啉的激发光谱和荧光光谱n三、磷光光度计n要求：
13、磷光分析一般都在低温下测定，以减少猝灭效应；激发光源必须按时开关，以在无荧光的情况下测定磷光强度。n因此，在上述荧光计的基础上，增加两个斩波器，即在第一单色器的后面以及在第二单色器的前面各增加一个斩波器，并用同步电机带动。工作时两个斩波器可调节为同相或异相运转。n当两个斩波器同相运转时，检测到的是IF+IP。n当两个斩波器异相运转时，检测到的仅仅是IP。n四、激发光谱、荧光光谱和磷光光谱最大峰所对应波长之间的关系n一般来说：exFP7.5分子荧光、磷光光谱的应用n一、定性分析n任何荧光物质都具有两个特征光谱，即激发光谱和荧光光谱。据此，可进行定性分析。n二、定量分析n1.定量分析的依据：IF=
14、Kc（稀溶液中）n2.定量测定的物质类型n试样本身发光；n试样本身不发光，但能与一个荧光或磷光的试剂反应生成发光物质；n试样本身既不发光，又不能转化为发光物质，但能与一个发光物质反应生成一不发光的产物。n3.定量分析方法：标准曲线法和标准加入法n4.定量分析过程n打开仪器，预热，对荧光光度计进行初始化；n配制标准溶液和待测样品；n选择测量参数，依次在不同激发波长下扫描，记录发射强度与激发波长的关系得激发光谱，由激发光谱确定最大激发波长ex；n在ex下，测定某一标准溶液的发射强度随荧光波长的变化，得荧光光谱，并确定最大荧光波长em。n在ex和em下测定系列标准溶液的荧光强度IF，作IF-c图得标
15、准曲线。然后在相同的条件下测定未知样品的IF，由标准曲线上可得待测样品的含量。n例如：尿液中维生素B2的测定n维生素B2（核黄素）在430440nm的蓝光照射下会发出绿色荧光，em=535nm。它在pH67的溶液中荧光强度最大，而在pH11的溶液中荧光消失。核黄素核黄素黄光素黄光素7.6化学发光法简介n一、概述n化学发光是由化学反应过程中生成的激发态物质所产生的光辐射。n化学发光的仪器简单，不需要光源和单色器，没有散射光及杂散光等引起的背景干扰。因此，化学发光法灵敏度极高，线性范围宽，分析速度快等优点。n不足的是：可供发光用的试剂目前还不多，发光机理有待进一步研究。n二、化学发光的基本原理n1
16、.化学发光的基本过程nA+BC+D*D*D+hn2.化学发光效率ClnCl=rf 发射光子数发射光子数参加反应的分子数参加反应的分子数n其中r生成激发态产物分子的化学效率.f 激发态分子的发光效率.n3.化学发光强度与待测物质浓度的关系n发光强度（ICl）是以单位时间内发射的光子数来表示。它等于单位时间内起了反应的被测定反应物A浓度的变化（以微分表示）与化学发光效率的乘积，即n ICl(t)=Cl dcAdtn一般情况下，在光化学反应中，被分析物的浓度与发光试剂相比，要小得多。因此发光试剂的浓度在反应过程中可认为是一常数，所以发光反应可视为一级反应。n根据式，发光强度随时间的变化如图：n在适当的条件下，发光强度的峰值与待测物质的浓度成正比，可用于定量分析。n也可以根据曲线包括的面积来进行定量分析，即Sc。n三、化学发光的类型n1.气相化学发光n2.液相化学发光n四、化学发光的仪器n1.分立式测定仪n2.流动注射式测定仪