DNA的生物合成复制.ppt

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1、第第 十十二二 章章DNA的生物合成的生物合成(复制复制)DNA Biosynthesis，Replication中 心 法 则蛋白质RNADNADNADNAclick复制传代基 因 表 达H.Teminn本章主要内容：本章主要内容：复制的基本规律复制的基本规律 DNA复制的酶学和拓扑学变化复制的酶学和拓扑学变化 复制的过程复制的过程 逆转录和其他复制方式逆转录和其他复制方式 DNA损伤（突变）与修复损伤（突变）与修复复制复制(replication)是指遗传物质的传代，以母链是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链为模板合成子链DNA的过程。的过程。亲代亲代DNA复制复制子代子代DNA

2、分子基础：碱基配对规律和分子基础：碱基配对规律和DNA双螺旋结构双螺旋结构化学本质：酶促的生物细胞内化学本质：酶促的生物细胞内单核苷酸聚合单核苷酸聚合复制的保证：各种酶和蛋白质复制的保证：各种酶和蛋白质因子的参与因子的参与复制复制(replication)是指遗传物质的传代，以是指遗传物质的传代，以母链母链DNA为模板合成子链为模板合成子链DNA的过程。的过程。复制复制亲代亲代DNA子代子代DNA复制的基本规律复制的基本规律Basic Rules of DNA Replication 第一节第一节半保留复制半保留复制semi-conservative replication半不连续复制半不连续

3、复制semi-discontinuous replication复制方向为双向复制方向为双向bidirectional replication高保真性复制高保真性复制high fidelity复制的特点复制的特点 一、半保留复制的实验依据和意义一、半保留复制的实验依据和意义 DNA生生物物合合成成时时，母母链链DNA解解开开为为两两股股单单链链，各各自自作作为为模模板板(template)按按碱碱基基配配对对规律，合成与模板互补的子链。规律，合成与模板互补的子链。子子代代细细胞胞的的DNA，一一股股单单链链从从亲亲代代完完整整地地接接受受过过来来，另另一一股股单单链链则则完完全全从从新新合合成

4、成。两两个个子子细细胞胞的的DNA都都和和亲亲代代DNA碱碱基基序序列列一一致。这种复制方式称为致。这种复制方式称为半保留复制半保留复制。(一）一）半保留复制的概念半保留复制的概念（二）（二）半保留复制的理论设想半保留复制的理论设想TGGTACTGCCACTGGACCATGACGGTGACCTGGTACTGCCACTGGACCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCTGGTACTGACCATGACACCATGACTGGTACTGTGGTACTGCCACTGGACCATGACGGTGACC+母链母链DNA 复制过程中形成复制过程中形成的复制叉的复制叉子代子代DNA （三）（三）子链继

5、承母链遗传信息的子链继承母链遗传信息的几种可能方式几种可能方式全全保保留留 半半保保留留 混混合合式式 亲代亲代DNA子代子代DNA（四）半保留复制的证明（四）半保留复制的证明实验实验细菌可以利用细菌可以利用NH4Cl作氮源合成作氮源合成DNA轻链14N-DNA重链15N-DNA轻、重链DNA混合半保留复制第一代DNA半保留复制第二代DNA半保留复制第三代DNA细菌在含细菌在含NH4Cl 的普通培养液的普通培养液中培养后提取中培养后提取DNA把细菌放在含把细菌放在含15NH4Cl 的培养液中培养的培养液中培养若干代后提取含若干代后提取含15N的的“重重”DNA把含把含15N-DNA的细菌放回含

6、的细菌放回含NH4Cl 的普通的普通培养液中培养培养液中培养20分钟后提取子一代分钟后提取子一代DNA把含把含15N-DNA的细菌在含的细菌在含NH4Cl 的普通培的普通培养液中培养养液中培养40分钟后提取子二代分钟后提取子二代DNA将轻链将轻链DNA和重链和重链DNA混合混合把含把含15N-DNA的细菌在含的细菌在含NH4Cl 的普通培的普通培养液中培养养液中培养60分钟后提取子三代分钟后提取子三代DNA普通培养液培普通培养液培养细菌的轻链养细菌的轻链DNA在密度梯在密度梯度离心时区带度离心时区带在离心管上方在离心管上方子二代子二代DNA密度梯密度梯度离心分析时有介度离心分析时有介于重带与轻

7、带之间于重带与轻带之间的中间带轻带两种的中间带轻带两种将轻链和重链将轻链和重链DNA混合后密混合后密度梯度离心时度梯度离心时在离心管中有在离心管中有与轻、重链对与轻、重链对应的两条区带应的两条区带子三代子三代DNA密度梯度离心分析时仍有中密度梯度离心分析时仍有中间带和轻带两种，间带和轻带两种，以后各代以后各代DNA分子密度梯度离心结果相分子密度梯度离心结果相同，但轻带变浓而中间带逐渐被稀释。同，但轻带变浓而中间带逐渐被稀释。含含15NH4Cl培培养液培养的重养液培养的重链链DNA在密在密度梯度离心时度梯度离心时区带在离心管区带在离心管下方下方子一代子一代DNA密度梯密度梯度离心分析时致密度离心

8、分析时致密带介于重带与轻带带介于重带与轻带之间，没有单独的之间，没有单独的重带和轻带重带和轻带实验结果说明实验结果说明子一代子一代DNA双链中双链中一股是一股是15N单链，从亲代接受和保留下来的；单链，从亲代接受和保留下来的；另一股是另一股是14N单链，完全是新合成的。单链，完全是新合成的。Messelson和和Stahl的实验支持半保留复制。的实验支持半保留复制。半保留复制的意义半保留复制的意义按半保留复制方式，子代按半保留复制方式，子代DNA与亲代与亲代DNA的的碱碱基序列一致基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的息，体现了遗传的保守性保守性

9、。遗传的保守性是物种稳定性的分子基础，但遗传的保守性是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的不是绝对的。在强调遗传恒定性的同时不能忽视其在强调遗传恒定性的同时不能忽视其变异性变异性。二、双向复制二、双向复制原核生物原核生物DNA 复制时，复制时，DNA从从起起始点始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为方向相反的复制叉，称为双向复制双向复制。复制中的放射自显影图像复制中的放射自显影图像（眼睛状图形）（眼睛状图形）（大肠杆菌（大肠杆菌DNADNA经放射性标记后电镜下观察结果）经放射性标记后电镜下观察结果）terA环状双链环状双链DNA及复制起

10、始点（及复制起始点（origin）B复制中的两个复制叉复制中的两个复制叉（replication fork）C复制接近终止点复制接近终止点(termination,ter)复制叉复制叉指的是指的是DNA双链分成两双链分成两股各自作为模板，子链沿模板延长形股各自作为模板，子链沿模板延长形成的成的Y字形结构字形结构复制叉复制叉指的是指的是DNA双链分成两双链分成两股各自作为模板，子链沿模板延长形股各自作为模板，子链沿模板延长形成的成的Y字形结构字形结构E.coliorigin真核生物真核生物u真核生物真核生物有多个染色体均需要复制，每个染有多个染色体均需要复制，每个染色体有多个起始点，是多复制子的

11、复制。色体有多个起始点，是多复制子的复制。u习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复复制子制子(replicon)。u复制子是独立完成复制的功能单位。复制子是独立完成复制的功能单位。u高等生物有数以万计的复制子，长度差异很大。高等生物有数以万计的复制子，长度差异很大。原核生物是单复制子复制，称为复制体（原核生物是单复制子复制，称为复制体（replisome）。）。双向复制双向复制复制起点复制起点真核生物的多复制子复制真核生物的多复制子复制53oriorioriori5355335533复制子复制子已完成复制的复制子已完成复制的复制子DNA母链，母链，o

12、ri为复制点为复制点复制子的大小和起始的先后不同复制子的大小和起始的先后不同复制子长度为相邻起点间距离复制子长度为相邻起点间距离其中一个复制子已经完成复制其中一个复制子已经完成复制复复制制进进程程三、复制的半不连续性5 3 解链方向解链方向35领头链领头链(leading strand)随从链随从链(lagging strand)3 5 3355领头链连续复制，领头链连续复制，随从链不连续复制，随从链不连续复制，这就是复制的半不连续性这就是复制的半不连续性DNA的两股单链走向相反，一股为的两股单链走向相反，一股为5至至3，另，另一股（互补链）为一股（互补链）为3至至5。复制叉上两股母链。复制叉

13、上两股母链也是走向相反。也是走向相反。子链沿母链模板复制，只能从子链沿母链模板复制，只能从5向向3延伸。延伸。同一个复制叉上只能有一个解链方向。同一个复制叉上只能有一个解链方向。顺着解链方向生成的子链，复制是连续顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为进行的，这股链称为领头链领头链。另一股链因为复制的方向与解链方向相另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为不连续复制的链称为随从链随从链。冈崎片段冈崎片段复制中的不连续片段称为复制中的不连续片段称为岡崎片段岡崎片段(okazaki fragment)。第二

14、节第二节DNA复制的酶学复制的酶学The Enzymology of DNA Replication参与参与DNA复制的物质复制的物质DNA复复制系统制系统底物底物dNTP聚合酶聚合酶DNA-pol模板模板解成单链单链解成单链单链的的DNA母链母链引物引物与模板互补的与模板互补的RNA片段片段其它酶其它酶和蛋白质因子和蛋白质因子底物底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶聚合酶(polymerase):依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶简写简写 为为 DNA-pol模板模板(template):解开成单链的解开成单链的DNA母链母链引物引物(primer):提

15、供提供3-OH末端末端使使dNTP可以依可以依次聚合次聚合解螺旋酶解螺旋酶引物酶引物酶单链单链DNA结合蛋白结合蛋白DNA连接酶等连接酶等一、复制的化学反应一、复制的化学反应单链延长的方向单链延长的方向 单链延长的方向单链延长的方向(dNMP)n+dNTP (dNMP)n+1+PPi 新链生成需新链生成需引物引物；新链的延长只可沿新链的延长只可沿5 3 方向进行方向进行。脱氧核糖核苷酸之脱氧核糖核苷酸之间生成间生成 3，5磷磷酸二酯键而逐一聚酸二酯键而逐一聚合合二、二、DNA聚合酶聚合酶u全称：全称：依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶(DNA-dependent DNA polymerase

16、)u简称：简称：DNA-polu活性（作用）有两方面：活性（作用）有两方面：u53 的的聚合聚合活性，活性，延延53 方向方向延长脱氧核苷酸延长脱氧核苷酸链。链。u核酸核酸外切外切酶活性（两种情况）酶活性（两种情况）u3 5 外切酶活性，外切酶活性，能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水解。u5 3 外切酶活性，外切酶活性，能切除突变的能切除突变的 DNA片段。片段。核酸外切酶活性核酸外切酶活性3 5 外切酶外切酶活性活性能辨认错配的碱基对，能辨认错配的碱基对，并将其水解。并将其水解。5 3 外外切酶活性能切除切酶活性能切除突变的突变的 DNA片段。片段。（一）原核生物的

17、（一）原核生物的DNA聚合酶聚合酶DNA-pol DNA-pol DNA-pol 三种酶共同点三种酶共同点：都具有都具有 5 3 聚合酶活性聚合酶活性3 5 外切酶活性外切酶活性功能功能：对复制中的错误进行校读，对复制对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。和修复中出现的空隙进行填补。DNA-pol （109kD）323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是实验室合成

18、片段是实验室合成DNA，进行，进行分子生物学研究中常用的工具酶。分子生物学研究中常用的工具酶。DNA-pol（120kD）DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。基因发生突变，细菌依然能存活。它参与它参与DNA损伤的损伤的应急状态应急状态修复。修复。功能功能是原核生物复制延长中是原核生物复制延长中真正真正起催化作用的酶。起催化作用的酶。DNA-pol (250kD)（二）真核生物的（二）真核生物的DNA聚合酶聚合酶真核生物真核生物DNA-PolDNA-Pol DNA-Pol DNA-Pol DNA-Pol DNA-Pol 分子量分子量（kD）53聚合活性聚合活性35外切活性外切活性功

19、能功能16.54014.012.525.5中中起始引发起始引发引物酶活性引物酶活性-+？高高高高高高+-低低保真度的保真度的复制复制线粒体线粒体DNA的的复制复制延长子链的延长子链的主要酶主要酶解螺旋酶活性解螺旋酶活性填补引物空隙填补引物空隙切除修复切除修复重组重组三、复制保真性的酶学依据三、复制保真性的酶学依据复制按照碱基配对规律进行，使遗传信息能准确传代。复制按照碱基配对规律进行，使遗传信息能准确传代。l（二）复制的保真性（二）复制的保真性lDNA聚合酶对模板的依赖性是子链与母聚合酶对模板的依赖性是子链与母链准确配对、是遗传信息得以延续和传代链准确配对、是遗传信息得以延续和传代的保证。碱基

20、配对的关键是氢键的形成。的保证。碱基配对的关键是氢键的形成。l（三）聚合酶对碱基的选择（三）聚合酶对碱基的选择l原核生物原核生物DNA聚合酶聚合酶IIIl对核苷酸的参入有选择功能。对核苷酸的参入有选择功能。l复制保真性的酶学机制：复制保真性的酶学机制：l（一）（一）DNA-pol有两种活性有两种活性l聚合酶活性聚合酶活性l核酸外切酶活性和即时校读核酸外切酶活性和即时校读（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。其聚合活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，：碱基配对正确，DNA-p

21、ol不表现活性。不表现活性。（二）复制的保真性和碱基选择 DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型反式构型。“错错配配”实实验验证证明明DDDPDDDP对对碱碱基基有有选选择择功功能能。在在DNA-DNA-polpol中中由由亚亚基基承承担担。如如模模板板上上的的嘧嘧啶啶碱碱基基只只能能同同反反式式结结构构的的嘌嘌呤呤碱碱基基才才能能形

22、形成成氢氢键键，恰恰好好亚亚基基对对反反式式嘌嘌呤呤碱碱基基的的亲亲和和力力高高，故故能能从从dNTPdNTP中中选选出出模模板板嘧嘧啶啶所所需需的的嘌嘌呤呤核核苷苷酸酸。这这就就体体现现了了DDDPDDDP对对碱碱基基的的识识别别和选配作用。和选配作用。由由此此不不难难想想到到，选选配配在在前前，聚聚合合在在后后，即即氢氢键键（次次级级键键）生生成成在在前前，磷磷酸酸二二酯酯键键（主主键键）的的生生成成再再后，具有先后顺序性。后，具有先后顺序性。即即质量（即信息）保真在前，产品形成在后。质量（即信息）保真在前，产品形成在后。2.聚合酶聚合酶在复制延长时在复制延长时对碱基的选择功能对碱基的选择

23、功能1.遵守遵守严格的严格的碱基配对规律碱基配对规律3.复制出错时复制出错时DNA-pol的的及时校读功能及时校读功能DNA复制的复制的保真性保真性至少要依赖至少要依赖三种机制三种机制 四、复制中的分子解链及四、复制中的分子解链及DNA 分子分子拓扑学变化拓扑学变化DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。解成单链，它才能起模板作用。因此提出双螺旋模型的因此提出双螺旋模型的Watson-CrickWatson-Crick指出指出DNADNA复制复制最难、最复杂的是解开双螺旋最难、最复杂的是解开双螺旋解螺旋酶解螺旋酶(helicase

24、)利用利用ATP供能，作用于供能，作用于氢键氢键，使，使DNA双链解开成为双链解开成为两条单链两条单链,作用前它需要作用前它需要DnaADnaA蛋白帮助辨认起始点蛋白帮助辨认起始点（E.coliE.coli的起始点称的起始点称originC,oriCoriginC,oriC,由由245 245 bpbp组成，其中富组成，其中富含含A-TA-T处为解链酶的作用点），还需要处为解链酶的作用点），还需要DnaCDnaC蛋白带到蛋白带到起始点。起始点。引物酶引物酶(primase)复制起始时催化生成复制起始时催化生成RNA引物的酶引物的酶单链单链DNA结合蛋白结合蛋白(SSB)在复制中维持模板处于单链

25、状态并保护单链的完整在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整 （一）解螺旋酶、引物酶和单链（一）解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白结合蛋白（二）（二）DNA拓扑异构酶拓扑异构酶(DNA topoisomerase)拓扑异构酶作用特点拓扑异构酶作用特点既能水解既能水解 、又能连接磷酸二酯键、又能连接磷酸二酯键拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶原核原核真核真核转轴酶转轴酶解缠酶解缠酶切口切口-封闭酶封闭酶松弛酶松弛酶蛋白蛋白旋转酶旋转酶又分为又分为几种亚型几种亚型最近发现最近发现曾用名曾用名1111个个螺旋螺旋 9 9个螺旋个螺旋被压缩被压缩 超

26、螺旋局部解开后超螺旋局部解开后DNA复制过程中正超螺旋的形成复制过程中正超螺旋的形成 2 2复制过程中正超螺旋的形成复制过程中正超螺旋的形成 超螺旋解开前超螺旋解开前29拓扑异构酶拓扑异构酶切断切断DNA双链中双链中一股一股链，使链，使DNA解解链旋转不致打结；适当时候封闭切链旋转不致打结；适当时候封闭切口，口，DNA变为松弛状态变为松弛状态。反应反应不需不需ATP。拓扑异构酶拓扑异构酶切断切断DNA分子分子两股两股链，断端通过链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。切口旋转使超螺旋松弛。利用利用ATP供能，连接断端，供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。分子进入负超螺旋状态。拓扑异构酶的作用

27、拓扑异构酶的作用 五、五、DNA连接酶连接酶DNA连接酶在复制中起连接酶在复制中起最后接合缺口最后接合缺口的作用。的作用。在在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。也是基因工程的重要工具酶之一。功能功能特点特点：只能连接双链中只能连接双链中一条单链的断口一条单链的断口；要求断口宽度只差一个要求断口宽度只差一个33，5-5-磷酸二酯键；磷酸二酯键；催化反应需耗能量催化反应需耗能量.三种酶催化生成磷酸二酯键的比较三种酶催化生成磷酸二酯键的比较生物界两大家族生物界两大家族原原 核核 生生 物物真真 核核 生生 物物原核生物原核生物

28、原核细胞不存在核膜包围的细胞核原核细胞不存在核膜包围的细胞核原核细胞的原核细胞的DNA通常为环状通常为环状几类常见的原核生物几类常见的原核生物真核生物真核生物真核细胞有核膜包围的细胞核真核细胞有核膜包围的细胞核细胞核细胞核真核细胞的真核细胞的DNA通常为线状通常为线状几类常见的真核生物几类常见的真核生物植物植物动物动物真菌真菌人物人物返回返回第三节第三节DNA生物合成过程The Process of DNA Replication（一）复制的起始（一）复制的起始需要解决两个问题：需要解决两个问题：1.DNA解开成单链，形成复制叉，提供模板。解开成单链，形成复制叉，提供模板。2.形成引发体并合成

29、引物，提供形成引发体并合成引物，提供3-OH末端。末端。一、原核生物的一、原核生物的DNA生物合成生物合成 目目 录录复制的起始复制的起始需要解决三个问题：需要解决三个问题：2.DNA解开成单链，提供模板。解开成单链，提供模板。3.合成引物，提供合成引物，提供3-OH末端。末端。1 1、起始点的识别起始点的识别E.coli复制起始点复制起始点 oriCGATTNTTTATTTGATCTNTTNTATTGATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 1

30、74 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245串联重复序列串联重复序列识别区识别区 反向重复序列反向重复序列富含富含ATAT区区1.DNA解链解链5 3 5 3 解链过程解链过程DnaA、B、C三种蛋白参与DnaB解螺旋酶解螺旋酶DnaCDnaA蛋白蛋白四个相同亚基组成四个相同亚基组成3 5 5 3 DnaB解螺旋酶解螺旋酶DnaC2.引发体和引物引发体和引物 Dna ASSB含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为复制起始区域的复合结构称为引发体引发体。DnaG引物酶引物酶DNA拓扑拓扑异

31、构酶异构酶3 5 5 3 DnaB解螺旋酶解螺旋酶DnaCSSBDnaG引物酶引物酶DNA拓扑拓扑异构酶异构酶合成引物合成引物 引物的合成引物的合成3 5 5 3 DnaB解螺旋酶解螺旋酶DnaCSSBDNA拓扑拓扑异构酶异构酶合成引物合成引物 DnaG引物酶引物酶解链方向解链方向引物是由引物酶催化合成的短链引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。分子。参与复制起始的各种蛋白质 名名 称称 功功 能能 DnaADnaA蛋白蛋白 识别起始点识别起始点 解螺旋酶（解螺旋酶（DnaBDnaB/rep/rep蛋白）蛋白）解开解开DNADNA双链双链引物酶引物酶(DnaGDnaG蛋白蛋白)催化引物催化引

32、物RNARNA生成生成 SSBSSB 稳定和保护解开的单链稳定和保护解开的单链 拓扑异构酶拓扑异构酶 改变改变DNADNA的拓扑状态的拓扑状态 OriC(245bpOriC(245bp的的DNADNA组分组分)E.coliE.coli的复制起点的复制起点（二）复制的延长（二）复制的延长复制的延长指在复制的延长指在DNA-pol催化下，催化下，dNTP以以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。DnaGSSB SSB SSBDNA-Pol 前导链前导链后随链后随链-冈崎片断冈崎片断5 3

33、3 5 3 5 5 3 DnaB解螺旋酶解螺旋酶5 3 5 3 随从链随从链领头链领头链3 3 5 5 3 5 复制的过程复制的过程-OH-OHADP+PiADP+PiATPATPDnaB.CDnaB.CDnaGDnaG形成引发体形成引发体形成引发体形成引发体55335533解解解解螺旋酶螺旋酶螺旋酶螺旋酶拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶单链单链单链单链DNADNA结合蛋白结合蛋白结合蛋白结合蛋白DNA-PolDNA-PolDNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶原核生物基因是环状原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制，双向复制的复制片段在复制的终止点片段在复制的终止点(ter)处汇合。

34、处汇合。（三）复制的终止（三）复制的终止冈崎片断的连接冈崎片断的连接5 5 DNA Pol-RNA酶水解水解RNA引物留下空隙引物留下空隙填补引物水解后留下的空隙，保留缺口填补引物水解后留下的空隙，保留缺口DNA连接酶连接酶DNA连接酶连接酶ATP ADP+Pi5 5 DNA连接酶连接酶5 5 P形成磷酸二酯键连接片段之间缺口形成磷酸二酯键连接片段之间缺口二、真核生物的二、真核生物的DNA生物合成生物合成细胞周期（细胞周期（Cell cycle）指细胞分裂的时相变化。指细胞分裂的时相变化。典型的细胞周期分为典型的细胞周期分为4期：期：G1期（期（DNA合成前期）合成前期）S期（细胞分裂的合成期

35、），合成期（细胞分裂的合成期），合成DNAG2期（期（G2期主要合成一些与有丝分裂中新细胞形成期主要合成一些与有丝分裂中新细胞形成所必需的物质）所必需的物质）M期（细胞染色体形成并发生细胞分裂，新细胞在此期（细胞染色体形成并发生细胞分裂，新细胞在此期形成）期形成）体内活细胞周期长短相差悬殊，关键在体内活细胞周期长短相差悬殊，关键在G1进入进入S期。营养良好的培养细胞周期约期。营养良好的培养细胞周期约24小时。小时。真核生物真核生物DNA复制特点复制特点不同染色体各自进行复制每个染色体有上千个复制子，复制起点多复制有时序性复制子以分组方式激活而不是同步启动转录活性高的DNA在S期早期就开始复制卫

36、星DNA（高度重复序列）、中心体（连接染色体双倍体的部位）、端粒（线性染色体两端）在S期最后复制复制起始点比大肠杆菌起始点OriC短复制起始需要DNA-Pol（引物酶）、（解螺旋酶）、拓扑酶、复制因子（replication factor,RF）、增殖细胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen,PCNA）参与。（一）真核生物复制的起始（一）真核生物复制的起始复制起始也是打开复制叉形成引发体并合成RNA引物，但详细机制不清楚。细胞能否分裂，决定于进入细胞能否分裂，决定于进入S期及期及M期这两期这两个关键点。个关键点。G1S及及G2M的调节，与蛋白的调节，与蛋

37、白激酶活性有关。激酶活性有关。蛋蛋白白激激酶酶通通过过磷磷酸酸化化激激活活或或抑抑制制各各种种复复制制因因子而实施调控作用。子而实施调控作用。相关的蛋白激酶相关的蛋白激酶具有四级结构的蛋白质，有两类亚基：具有四级结构的蛋白质，有两类亚基：调节亚基调节亚基细胞周期蛋白（细胞周期蛋白（cyclin）催化亚基催化亚基细胞周期蛋白依赖激酶（细胞周期蛋白依赖激酶（cyclin dependent kinase，CDK）二者都有多种，而且可以交叉配伍，实现对二者都有多种，而且可以交叉配伍，实现对DNA复制的多复制的多样化和精确的调节。样化和精确的调节。哺乳类动物细胞内还发现天然抑制哺乳类动物细胞内还发现天

38、然抑制CDK的蛋白：的蛋白：锚蛋白（锚蛋白（ankynin）抑制抑制CDK4P21蛋白蛋白抑制多种抑制多种CDK，还抑制，还抑制PCNA，还参加，还参加P53介导的细胞凋亡级联反应。介导的细胞凋亡级联反应。P21 和锚蛋白被称为和锚蛋白被称为细胞检查点蛋白细胞检查点蛋白。3领头链领头链随从链随从链引物引物核小体核小体（二）真核生物复制的延长（二）真核生物复制的延长当随从链延长了一个或多个核小体的长度后要重新合成引物当随从链延长了一个或多个核小体的长度后要重新合成引物亲代亲代DNA真核生物真核生物DNA复制与核小体组装同步进行，复制复制与核小体组装同步进行，复制完成后随即组装成染色体并从完成后随

39、即组装成染色体并从G2过渡到过渡到M期。期。染色体染色体DNA呈线状，复制在末端停止。呈线状，复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接都可复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接都可以在线性以在线性DNA内部完成。内部完成。染色体两端染色体两端DNA子链上最后复制的子链上最后复制的RNA引物，去引物，去除后留下空隙。剩下的除后留下空隙。剩下的DNA单链要填补成双链，单链要填补成双链，否则会被核内的否则会被核内的DNase水解变短。水解变短。（三）真核生物复制的终止（三）真核生物复制的终止线性线性DNA复制的末端复制的末端复制完成后子链末端留下空隙，母链成单链端粒端粒(telomer

40、e)指真核生物染色体线性指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。分子末端的结构。形态学上染色体形态学上染色体DNA末端膨大成粒状。末端膨大成粒状。结构特点结构特点由末端单链由末端单链DNA序列和蛋白质构成。序列和蛋白质构成。末端末端DNA序列是多次重复的富含序列是多次重复的富含G、C碱基的短碱基的短 序列。仓鼠和人类端粒序列。仓鼠和人类端粒DNA末端都有（末端都有（TnGn）x重复序列。重复序列。功能功能维持染色体的稳定性维持染色体的稳定性 维持维持DNA复制的完整性复制的完整性端粒酶端粒酶(telomerase)组成组成端粒酶端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)

41、端粒酶协同蛋白端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1,hTP1)端粒酶逆转录酶端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTRT)功能功能提供提供RNA模板、催化逆转录模板、催化逆转录端粒酶通过爬行模型的机制维持染色体的完整。端粒酶通过爬行模型的机制维持染色体的完整。端粒酶的端粒酶的RNA端粒端粒DNA末端末端1 1、端粒酶靠、端粒酶靠hTRhTR（AnCnAnCn）x x与母链与母链DNADNA端粒结合端粒结合内在模板RNA2 2、以端粒酶、以端粒酶RNARNA为模版，逆转录，延长为模版，

42、逆转录，延长DNADNA母链母链3 3、端粒酶移位、空出、端粒酶移位、空出RNARNA模板，再次延长母链，同时模板，再次延长母链，同时DNADNA母链反摺利于下游复制延伸。母链反摺利于下游复制延伸。端粒酶的端粒酶的RNA4 4、延伸足够长度后端粒酶脱离母链，代之以、延伸足够长度后端粒酶脱离母链，代之以DNA-Pol DNA-Pol。此时。此时母链母链3 3-OH-OH反折，同时作为引物和模板，完成末端双链复制。反折，同时作为引物和模板，完成末端双链复制。端粒酶的端粒酶的RNADNA-Pol端粒酶的催端粒酶的催化延长作用化延长作用爬爬行行模模型型目目 录录第四节第四节逆转录和其他复制方式逆转录和

43、其他复制方式Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways双链双链DNA是大多数生物的遗传物质。是大多数生物的遗传物质。某些病毒的遗传物质是某些病毒的遗传物质是RNA。少数低等生物如少数低等生物如M13噬菌体的感染型只含有单链噬菌体的感染型只含有单链DNA。染色体外染色体外DNA（原核生物的质粒、真核生物的线粒体）（原核生物的质粒、真核生物的线粒体）都采用特殊的方式复制。都采用特殊的方式复制。逆转录或反转录逆转录或反转录(reverse transcription)逆转录酶逆转录酶(reverse transcriptase)全称：依赖

44、全称：依赖RNA的的DNA聚合酶。聚合酶。逆转录逆转录酶酶一、逆转录病毒和逆转录酶一、逆转录病毒和逆转录酶 信息流动方向信息流动方向美国生物家巴尔的摩 逆转录酶又称逆转录酶又称RNA指导的指导的DNA聚合酶。是以聚合酶。是以RNA为模板为模板合成合成DNA的酶。的酶。1970年美国科学家特明和巴尔的摩分别于年美国科学家特明和巴尔的摩分别于动物致癌动物致癌RNA病毒中发现，他们并因此获得病毒中发现，他们并因此获得1975年度诺贝年度诺贝尔生理学或医学奖。尔生理学或医学奖。逆转录酶作用特点逆转录酶作用特点逆转录酶具有三种酶活性：逆转录酶具有三种酶活性：以以RNA作模板的作模板的dNTP 聚合活性聚

45、合活性以以RNA作模板合成作模板合成DNA单链，形成单链，形成RNA-DNA杂化分子杂化分子RNase活性活性水解杂化分子中的水解杂化分子中的RNA单链，生成单链，生成DNA单链模板单链模板（此作用可以由被感染细胞内（此作用可以由被感染细胞内RNase代替）代替）以以DNA为模板的的为模板的的dNTP聚合活性聚合活性DNA作模板合成作模板合成DNA单链，形成双链单链，形成双链DNA分子分子酶作用需要酶作用需要Zn2+作为辅助因子作为辅助因子合成反应也按照合成反应也按照53延长的规律延长的规律逆转录酶的存在：逆转录酶的存在：致癌致癌RNA病毒、蛙卵、白细胞、滋养层细胞。病毒、蛙卵、白细胞、滋养层

46、细胞。逆转录逆转录酶的作用酶的作用逆转录酶逆转录酶逆转录酶（逆转录酶（RNase H）逆转录酶逆转录酶逆转录病毒在细胞内的逆转录现象逆转录病毒在细胞内的逆转录现象dNTP PPidNTP PPiHH2 2O NMPO NMPdNTP dNTP PPiPPitRNAtRNA引物引物引物引物RNARNA单链单链单链单链模板模板模板模板RNA-DNARNA-DNA杂化双链杂化双链杂化双链杂化双链DNADNA单链单链单链单链DNADNA双链双链双链双链前病毒前病毒前病毒前病毒与宿主基因组与宿主基因组与宿主基因组与宿主基因组DNADNA整合整合整合整合分子生物学研究可应用逆分子生物学研究可应用逆转录酶，

47、作为获取基因工程目转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法的基因的重要方法之一，此法称为称为cDNA法。法。以以mRNA为模板，经逆转为模板，经逆转录合成的与录合成的与mRNA碱基序列互碱基序列互补的补的DNA链。链。试管内合成试管内合成cDNAcDNA complementary DNA 逆转录酶逆转录酶SISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解逆转录逆转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)，是聚合酶链式反，是聚合酶链式反应应(PCR)的一种广泛应用的一种广泛应用的变形。在的变形。在RT-PCR中，中，一条一条RNA链被逆转录成链

48、被逆转录成为互补为互补DNA，再以此为，再以此为模板通过模板通过PCR进行进行DNA扩增。扩增。鸡尾酒疗法：纽约艾伦鸡尾酒疗法：纽约艾伦-戴蒙德艾滋病研究中心主持艾滋戴蒙德艾滋病研究中心主持艾滋病研究工作的何大一发明了治疗艾滋病的著名的病研究工作的何大一发明了治疗艾滋病的著名的“鸡尾酒鸡尾酒疗法疗法”，该疗法把蛋白酶抑制剂与多种抗病毒的药物混合，该疗法把蛋白酶抑制剂与多种抗病毒的药物混合使用，使艾滋病得到有效的控制。使用，使艾滋病得到有效的控制。二、逆转录研究的意义二、逆转录研究的意义 逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。的重大发现。逆转

49、录现象说明：至少在某些生物，逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样同样兼有遗传信息传代与表达功能。兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意世纪初已注意到的病毒致癌理论。到的病毒致癌理论。二、逆转录研究的意义二、逆转录研究的意义逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。中的重大发现。逆转录现象说明：逆转录现象说明：至少在某些生物，至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代同样兼有遗传信息传代与表达功能。与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注世纪初已注

50、意到的病毒致癌理论。意到的病毒致癌理论。三、滚环复制和三、滚环复制和D环复制环复制 滚环复制滚环复制(rolling circle replication)是某些低等生物的复制形式，是某些低等生物的复制形式，如如 X174和和M13噬菌体等。不噬菌体等。不需要引物。需要引物。D环复制环复制(D-loop replication)是线粒体是线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。的复制形式。复制时需要合成引物。复制时需要合成引物。第五节第五节DNA损伤（突变）与修复损伤（突变）与修复DNA Damage(Mutation)and Repair遗传物质的结构改变而