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1、Western Blot 相关技术相关技术操作与原理操作与原理是什么？是什么？能做什么？能做什么？为什么？为什么？怎么做？怎么做？怎么办？怎么办？印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNADNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Easte
2、rn印迹法。埃德温迈勒萨瑟恩（Edwin Mellor Southern）是什么？是什么？DNA重组技术siRNA的转染技术表观遗传学（甲基化，miRNA）凡是涉及蛋白水平检测的研究，均可运用到凡是涉及蛋白水平检测的研究，均可运用到western blotwestern blot技术技术能做什么？能做什么？6.最后加上相应的底物溶液，当二抗上的酶催化底物产生化学发光时,用X光片曝光，洗片后就会产生可见的区带，指示目的蛋白质的位置和强弱。3.通过电泳将蛋白样品分开。5.印迹首先用封闭液（如5的脱脂奶粉）处理以封闭固相载体上剩余的疏水结合位点，而后用目的蛋白的抗血清（一抗）孵育，印迹中只有目的蛋白
3、质与一抗特异性结合。洗去游离的一抗后，用再与酶标记的二抗孵育4.将电泳分离的蛋白从凝胶转移至一种固相支持体.转移后的硝酸纤维素膜就称为一个印迹（blot），用于对蛋白质的进一步检测。1.提取细胞或组织蛋白，测定总蛋白浓度2.测定总蛋白浓度，并处理样品技术路线技术路线n细胞总蛋白的提取n总蛋白定量n十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）n转膜n固相免疫检测为什么？为什么？怎么做？怎么做？细胞总蛋白的提取n提取细胞蛋白多是利用将细胞裂解、破碎、使蛋白质释放的原理。提取蛋白质的方法很多，鉴于后续实验对蛋白性质的要求不同，因此很难找到一种万能的裂解方法。n 不论采用那种方法，都应遵循以下原
4、则：1尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失。2细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶抑制剂可以减少蛋白的降解，蛋白酶抑制剂的种类很多，要根据具体情况具体选择。本实验中选用PMSF(苯甲基磺酰氟)作为蛋白酶抑制剂。3样品裂解液应该新鲜制备，并且分装冻存于-80。切勿反复冻融已制备好的样品。BRIPA buffer：Tris-HCl 50 mM,pH 7.4 NP-40 1%去氧胆酸钠 0.25%NaCl 150 mM EDTA 1 mM 目的：要获得高丰度、高品质的蛋白质，以满足后续实验的需求目的：要获得高丰度、高品质的蛋白质，以满足后续实验的需求A细胞总蛋白裂解缓冲
5、液(100 ml)：1 PBS 80ml Tritonx-100 1ml 去氧胆酸钠 0.5g SDS 0.1g 补1PBS缓冲液至100ml.注意事项注意事项1.注意个人防护。PMSF严重损害呼吸道黏膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进有致命危险。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，立即用大量水冲洗。2.所用离心机需提前预冷。3.为防止蛋白降解，所有操作应在冰上完成。4.吸取蛋白上清液时，注意不要把沉淀吸上来。蛋白定量n Western Blot作为一项半定量实验技术，电泳前，必须尽量使各组 之间总蛋白量基本一致;n 蛋白质总量不足可能妨碍对目的蛋白的鉴定;蛋白质含量太高则会使带形扭曲,甚至会影响此电泳方法
6、的分辨力基于以上两方面原因，在进行蛋白电泳之前，先要对提取的总蛋白进行含量测定基于以上两方面原因，在进行蛋白电泳之前，先要对提取的总蛋白进行含量测定n目前常用的有五种经典的方法，即定氮法、双缩脲法（Biuret法）、Folin酚试剂法（Lowry法）、紫外吸收法以及考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏1020倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可
7、能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。n在选择方法时应考虑：实验对测定所要求的灵敏度和精确度；蛋白质的性质；溶液中存在的干扰物质；测定所要花费的时间。本实验中用的Bradford法基于以下原理：考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比 n此法的不足之处：由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白
8、质测定时有较大的偏差。n Bradford法由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用：1.灵敏度高：可精确定量 11000 g/ml 的蛋白样品。2.测定快速、简便：只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。1 小时内吸光度变化不超过10%。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。3.干扰物质少：如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。注意事项 1制作的BSA标准曲线如不规律，应重新再做。2如果待测样品浓
9、度高（如组织提取物），可用生理盐水稀释1020倍后再测定；如样品浓度低，可适当减少稀释倍数。使测得的OD值落在标准曲线范围之内。SDS-PAGE电泳nSDS 是一种离子性的表面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链。n当 SDS 与蛋白质混合时，它会以其碳链与蛋白质的疏水性氨基酸结合将蛋白质包起来,而以磺酸根离子外露与水分子作用。大多数蛋白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4(以重量为单位),而蛋白质结合固定比例的SDS 后，由于 SDS 带强负电荷，使蛋白质原先所带电荷显得微不足道,且每单位重量的蛋白质所带电荷一致，所以不同蛋白质的迁移率大小就主要由蛋白分子大小这一主要因素
10、决定。SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度 聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围 丙烯酰胺浓度(%)线性分离范围KDa 15 10-43 12 12-60 10 20-80 7.5 36-94 5.0 57-212注意事项1.丙烯酰胺和双丙烯酰胺在聚合前具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤，其作用具有累积性，故称量或配胶时应戴手套及口罩 2.过硫酸铵会缓慢分解，应隔周新鲜配制 3.溶液中一旦加入TEMED，应立即混匀并快速灌注入玻璃夹槽中 4.为保持电泳的平衡，在无样品孔中也应加入适量的4蛋白质电泳上样缓冲液 5.正确连接电泳连线（负极在上，正极在下）以保证蛋白由上向下
11、方向电泳 6.电泳尽量在4冰箱中进行转膜n凝胶电泳结束后，将凝胶上分离的蛋白条带通过转移电泳方式转印至固相支持物上，常用的固相支持物有NC（硝酸纤维素）膜、尼龙膜及PVDF（聚偏氟乙烯）膜。n选择膜的主要根据有：1.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量）2.膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）3.不影响后续的显色检测（也就是适合用于所选显色方法，信噪比好）4.如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜-滤纸滤纸凝胶凝胶膜膜滤纸滤纸+注意事项1.转膜液最好现配现用2.检查样品凝胶是否与转移槽的“-”侧保持一致，以确保样品蛋白由凝
12、胶转移至膜上。3.NC膜应小心操作，防止破裂固相免疫检测n转移结束后，借助抗原抗体反应，利用ECL（增强化学发光）发光或DAB（3,3二氨基联苯胺）显色技术检测目的蛋白。n ECL试剂采用氧化还原反应的原理：利用二抗上标记 的辣根过氧化物酶(HRP)，使底物发生氧化还原反应，从而产生化学。nDAB显色原理：DAB在HRP作用下形成红褐色不溶产物，从而指示目的蛋白位置及强弱。nECL发光相对于DAB显色而言，具有发光持久，灵敏度高(一般可达到pg级以上)等优点，且DAB具有致癌性。n应用化学发光，膜可以再生检测其他蛋白。注意事项1.处理膜的过程中，切勿使膜干掉（否则导致背景增高）2.选择合适的一
13、抗及二抗浓度（浓度高不一定效果好，过高会导致背景变黑）3.选择合适的封闭液（如果膜需要再生，最好选用脱脂奶粉，而非BSA）4.应考虑试剂的发光强度及其衰灭时间，来选择合适的曝光时间结果分析结果分析一、膜上没有信号答：原因有很多：1 细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；2 细胞中的蛋白质被降解掉了，必需加入PMSF或其他蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶活性，并且提取过程冰上操作；3 转膜过程出现失误；4 抗体或酶失活，选择在有效期内的试剂；5 抗体不能识别目的蛋白，多看看说明，看该抗体是否适用于western。怎么办？怎么办？二、目的带很弱答：1 标本中靶蛋白含量低，可以加大样品的上样量。2 转膜不充分
14、，可以通过提高转膜电流或延长转膜时间来解决。3 抗体效价低，可以减少抗体的稀释倍数，增加抗体浓度。三、胶片背景很脏，有什么解决方法？答：1 膜没有均匀浸湿，PVDF膜转膜前应该用100%甲醇将膜完全浸湿10秒，快速激活；2 膜或者缓冲液污染，拿取膜与吸水纸时要戴手套，及时更换新鲜转膜缓冲液；3 封闭不充分，延长封闭时间；4抗体与封闭剂出现交叉反应，检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应，如果有，考虑更换封闭液；5抗体浓度过高，增加抗体稀释倍数四、条带中出现单个或多个白点？答：膜和胶块存在气泡，转膜时赶尽膜和胶块之间的气泡五、制备的凝胶不平？答：胶板洗刷干净，加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分
15、胶块聚合不均匀，温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀，室温较高时，操作应迅速。六、用于westernwestern的抗体和用于ELISA的抗体有什么不同的要求？答：一般来说用于western的抗体识别的是氨基酸序列特异性；而用于ELISA的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。七、检测到的抗原分子量是资料上的两倍，是怎么回事？答：抗原形成了二聚体。增多-巯基乙醇的量，煮沸变性时间延长，可以打开二聚体。八、做westernwestern必须要内参吗？答：内参起着校正总蛋白上样量的重要作用，只有在内参条带基本均匀一致的情况下，目的蛋白条
16、带出现的差异才有意义,表明的确是实验设计的干预因素造成目的蛋白量的变化，而不是加样误差造成目的条带含量的变化.所以内参是必须做的。MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY,May 2005,p.35633574MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY,May 2005,p.35633574 内参即是内部参照，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，一般要选择一个在处理因素作用的条件下蛋白含量不会发生改变的蛋白作内参。内参名称分子量大小适用范围Tubulin55kD胞浆和全细胞VCDA1/Porin31kD线粒体COXIV16kD线粒体Lamin B166kD细胞核TBP38kD细胞核八、非特异条带多答：1 抗体特异性不够，考虑使用单抗，保证抗体的特异性；2 蛋白降解，应尽量使用新鲜制备的样品，提取后一定要分装，避免反复冻融。九、曝光后出现反像答：HRP含量过高导致，建议降低二抗的使用浓度十、如何检测大分子量蛋白？答：在转膜液中添加0.1%-0.2%的SDS，同时增加转膜电压，在4 条件下进行转膜。