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1、荧光分光光度计的原理及应用荧光分光光度计的原理及应用2023/1/14第1页，共15页，编辑于2022年，星期二一、分子荧光的产生一、分子荧光的产生1.1.电子激发态的多重度电子激发态的多重度单重激发态单重激发态S：电子自旋方向和处于基态轨道的电子配对。：电子自旋方向和处于基态轨道的电子配对。第一节第一节 荧光分光光度法原理荧光分光光度法原理三重激发态三重激发态T：电子自：电子自旋方向和处于基态轨道旋方向和处于基态轨道的电子平行。的电子平行。2023/1/14第2页，共15页，编辑于2022年，星期二2.2.分子能级与跃迁分子能级与跃迁基基态态(S0)激激发发态态(S1、S2激激发发态态振振动
2、动能能级级)：吸吸收收特特定定频频率率的辐射。的辐射。激激发发态态基基态态：多多种种途途径径和和方方式式(见见能能级级图图)；速速度度最最快、激发态寿命最短的途径占优势；快、激发态寿命最短的途径占优势；磷光内转移外转移系间跨越延迟荧光传递途径传递途径辐射跃迁荧光振动弛预无辐射跃迁2023/1/14第3页，共15页，编辑于2022年，星期二S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换振动弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外转换l l 2T2内转换振动弛豫2023/1/14第4页，共15页，编辑于2022年，星期二二、激发光谱与荧光光谱二、激发光谱与荧光光谱1.1.
3、荧光的激发光谱曲线荧光的激发光谱曲线 固固定定测测量量波波长长(选选最最大大发发射射波波长长),),化化合合物物发发射射的的荧荧光光(磷磷光光)强强度度与与激激发发光光波波长长的的关关系系曲曲线线 （图图中中曲曲线线I）。激激发发光光谱谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；2023/1/14第5页，共15页，编辑于2022年，星期二2.2.荧光光谱荧光光谱 固定激发光波长固定激发光波长,化化合物发射的荧光强度与发合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线射光波长关系曲线(图中图中曲线曲线II)。问题：荧光问题：荧光(磷光磷光)的激的激
4、发光波长如何选择？发光波长如何选择？Stokes位移：激发光谱与位移：激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光发射光谱的波长比激发光谱的长。谱的长。2023/1/14第6页，共15页，编辑于2022年，星期二三、荧光强度和溶液浓度的关系三、荧光强度和溶液浓度的关系1 1 定量依据定量依据 荧光强度荧光强度 If正比于吸收的光量正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率和荧光量子效率 ：If=Ia 由朗由朗-比耳定律：比耳定律：Ia=I0(1-10-l c)If=I0(1-10-l c)=I0(1-e-2.3 l c)浓度很低时，将括号项近似处理后：浓度很低时，将
5、括号项近似处理后：If=2.3 I0 l c =Kc （浓浓度度高高时时如如何何？）？）2023/1/14第7页，共15页，编辑于2022年，星期二标准曲线法定量：标准曲线法定量：配配制制一一系系列列标标准准浓浓度度试试样样测测定定荧荧光光强强度度，绘绘制制标标准准曲曲线线，再再在在相相同同条条件件下下测测量量未未知知试试样样的的荧荧光光强强度度，在在标标准准曲曲线上求出浓度；线上求出浓度；比较法定量：比较法定量：在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较。在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较。2 2 定量方法定量方法三、荧光强度和溶液浓度的关系三、荧光强度和溶液浓度的关系2023/
6、1/14第8页，共15页，编辑于2022年，星期二四、荧光、磷光分析方法的特点四、荧光、磷光分析方法的特点（1 1）灵敏度高）灵敏度高 比紫外比紫外-可见分光光度法高可见分光光度法高2 24 4个数量级；为什么？个数量级；为什么？分分光光光光度度法法所所检检测测的的是是两两个个较较大大的的信信号号的的微微小小差差别别，荧光光度法检测的是很小背景值上的荧光强度。荧光光度法检测的是很小背景值上的荧光强度。（2 2）选择性强）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；（3 3）试样量少）试样量少（4 4）可提供比较多的物理参数）可提供比较多的物
7、理参数 缺点：应用范围小。缺点：应用范围小。2023/1/14第9页，共15页，编辑于2022年，星期二第二节第二节 荧光分光光度计的组成荧光分光光度计的组成 测测量量荧荧光光的的仪仪器器主主要要由由四四个个部部分分组组成成：激激发发光光源源、样样品品池池、双双单色器系统、检测器。单色器系统、检测器。特殊点：有两个单色器，光源与检测器成直角。特殊点：有两个单色器，光源与检测器成直角。基本流程如图：基本流程如图：单单色色器器：选选择择激激发发光光波波长长的的第第一一单单色色器器和和选选择择发发射射光光(测测量量)波长的第二单色器；波长的第二单色器；光光源源：氙氙灯灯?和和高高压压汞汞灯灯，染染料
8、激光器料激光器检测器检测器：光电倍增管。：光电倍增管。2023/1/14第10页，共15页，编辑于2022年，星期二仪仪器器光光路路图图问问题：题：参参考考光光电电管管作作用用？2023/1/14第11页，共15页，编辑于2022年，星期二第三节第三节 荧光分析法的应用荧光分析法的应用(1)(1)无机化合物的分析无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约与有机试剂配合物后测量；可测量约6060多种元素。多种元素。铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定(2)(2)生物与有机化合物的分析生物与有机化合物的分析 见表见表 2023/1/14第12页，共15页，编辑于2022年，星期二2023/1/14第13页，共15页，编辑于2022年，星期二2023/1/14第14页，共15页，编辑于2022年，星期二作业作业P14 32023/1/14第15页，共15页，编辑于2022年，星期二