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1、 酶动力学分析 酶促反应动力学酶促反应动力学n学习目的：学习目的：n1 1、了解酶促反应特点及与一般化学反应的区别。、了解酶促反应特点及与一般化学反应的区别。n2 2、掌握、掌握0 0、1 1级和米氏酶促反应动力学及应用原理；级和米氏酶促反应动力学及应用原理；n3 3、了解存在抑制时的酶促反应动力学特征；、了解存在抑制时的酶促反应动力学特征；n4 4、具备固定化酶反应中的过程分析能力和、具备固定化酶反应中的过程分析能力和内外不同内外不同阶段阶段的固定化酶动力学的应用能力；的固定化酶动力学的应用能力；n5 5、熟悉酶的失活动力学与反应过程中酶失活动力学、熟悉酶的失活动力学与反应过程中酶失活动力学
2、行为。行为。酶促反应动力学酶促反应动力学n第一节第一节 均相酶促反应动力学均相酶促反应动力学n第二节第二节 固定化酶促反应动力学固定化酶促反应动力学n第三节第三节 酶的失活动力学酶的失活动力学酶促反应酶促反应（Enzymatic reaction）：研究酶促反应研究酶促反应研究生物反应的基础研究生物反应的基础酶促反应动力学酶促反应动力学酶催化反应机制酶催化反应机制对酶促反应速率的规律对酶促反应速率的规律进行定性或定量的描述进行定性或定量的描述建立反应动力学方程建立反应动力学方程确定适宜的操作条件确定适宜的操作条件酶促反应特征酶促反应特征n优点：优点：n反应在常温、常压、反应在常温、常压、中性中
3、性pHpH范围进行，范围进行，节能且效率高。节能且效率高。n反应专一性强，副产反应专一性强，副产物生成少；物生成少；n反应体系简单，反应反应体系简单，反应最适条件易于控制。最适条件易于控制。n不足：不足：n反应仅限少数步骤，反应仅限少数步骤，经济性差；经济性差；n反应周期较长；反应周期较长；第一节第一节 均相酶促反应动力学均相酶促反应动力学n一、酶促反应动力学基础一、酶促反应动力学基础n二、单底物酶促反应动力学二、单底物酶促反应动力学 1 1、米氏方程、米氏方程 2 2、操作参数对酶促反应的影响、操作参数对酶促反应的影响 3 3、抑制剂对酶促反应速率的影响、抑制剂对酶促反应速率的影响n三、多底
4、物酶促反应动力学三、多底物酶促反应动力学 n均相酶催化反应均相酶催化反应:指酶与反应物系指酶与反应物系同处液相同处液相的酶催化的酶催化反应反应.因此因此不存在不存在相间的相间的物质传递物质传递.n均相酶催化反应动力学所描述的反应均相酶催化反应动力学所描述的反应速率与反应物系的基本关系速率与反应物系的基本关系,反映了该反映了该反应过程的反应过程的本征动力学本征动力学关系关系,而且酶与而且酶与反应物的反应是反应物的反应是分子水平分子水平上的反应上的反应.一、酶促反应动力学基础一、酶促反应动力学基础影响酶促反应的因素：影响酶促反应的因素：浓度浓度：酶浓度酶浓度底物浓度底物浓度外部因素（环境因素）：外
5、部因素（环境因素）：溶液的介电常数溶液的介电常数与离子强度与离子强度压力压力温度温度pH值值内部因素（结构因素）：内部因素（结构因素）：底物浓度及效应物底物浓度及效应物酶结构酶结构产物浓度产物浓度n零级反应零级反应 酶促反应速率与底物浓度无关。酶促反应速率与底物浓度无关。式中：式中：S底物浓度；底物浓度；rmax最大反应速率。最大反应速率。（3-1）n一级反应一级反应酶促反应速率与底物浓度的一次方成正比。酶促反应速率与底物浓度的一次方成正比。酶催化酶催化AB的反应的反应式中：式中：一级反应速率常数；一级反应速率常数；底物底物A的初始浓度；的初始浓度；bt时产物时产物B的浓度。的浓度。（3-2）
6、n二级反应二级反应 酶催化酶催化A+BC的反应的反应式中：式中：二级反应速率常数；二级反应速率常数；底物底物A和底物和底物B的初始浓度；的初始浓度；ct时产物时产物C的浓度。的浓度。积分上式，得：积分上式，得：（3-3）（3-4）n连锁反应连锁反应 酶催化酶催化A B C的反应的反应式中：式中：A，B，C的浓度；的浓度；各步反应的速率常数；各步反应的速率常数；（3-5）（3-6）（3-7）n如果如果A的初始浓度为的初始浓度为a0，B和和C的初始浓度为的初始浓度为0，并且并且a+b+c=a0，则可求得：，则可求得：（3-8）（3-9）（3-10）二、单底物酶促反应动力学二、单底物酶促反应动力学n
7、单底物酶促反应指一种反应物（底物）参单底物酶促反应指一种反应物（底物）参与的不可逆反应。如：水解酶、异构酶和与的不可逆反应。如：水解酶、异构酶和多数裂解酶催化的反应。多数裂解酶催化的反应。n1、米氏方程、米氏方程n Henri中间复合物学说中间复合物学说n Michaelis-Menten方程方程n Briggs-Haldane方程方程n动力学特征（米氏方程的讨论）动力学特征（米氏方程的讨论）n动力学参数的求取动力学参数的求取 Henri Henri中间复合物学说：中间复合物学说：n式中：式中：nefree游离酶；游离酶；nCS底物浓度；底物浓度；nCES 酶酶-底物复合物浓度；底物复合物浓度
8、；nCP产物浓度；产物浓度；nK+1酶与底物形成复合物的反应速度常数；酶与底物形成复合物的反应速度常数；nK-1复合物解离为酶和底物的反应速度常数；复合物解离为酶和底物的反应速度常数；nK+2ES复合物分解生成产物的反应速度常数。复合物分解生成产物的反应速度常数。n反应速率：反应速率：单位时间、单位反应体系中某一组单位时间、单位反应体系中某一组分的变化量来表示。对均相酶催化反应，单位分的变化量来表示。对均相酶催化反应，单位反应体系常用单位体积表示。反应速率为：反应体系常用单位体积表示。反应速率为：式中：rs 底物S的消耗速率，mol/(L.s);rP产物P的生成速率，mol/(L.s);V反应
9、体系的体积，L；CS底物S的物质的量，mol；CP产物P的物质的量，mol；t时间，s；n根据根据质量作用定律质量作用定律，P的生成速率可表示为：的生成速率可表示为：(3-11)式中：式中：CES 中间复合物中间复合物ES的浓度，它为的浓度，它为一难测定的未知量，因而不能用它来一难测定的未知量，因而不能用它来表示最终的速率方程。表示最终的速率方程。对上述反应机理，推导动力学方对上述反应机理，推导动力学方程时的三点假设：程时的三点假设：n（1）在反应过程中，酶的浓度保持恒定，即：）在反应过程中，酶的浓度保持恒定，即：CE0=CE+CES。n（2）与底物浓度）与底物浓度CS相比，酶的浓度是很小的，
10、相比，酶的浓度是很小的，因而可以忽略由于生成中间复合物因而可以忽略由于生成中间复合物ES而消耗而消耗的底物。的底物。n（3）产物的浓度是很低的，因而产物的抑制）产物的浓度是很低的，因而产物的抑制作用可以忽略，也不必考虑作用可以忽略，也不必考虑P+EES这个逆这个逆反应的存在。反应的存在。n据此假设所确定的方程仅适用于反应初始状态。据此假设所确定的方程仅适用于反应初始状态。Michaelis-MentenMichaelis-Menten方程方程推导过程：推导过程：n“快速平衡学说快速平衡学说”（rapid equilirium）:假设：酶与底物反应生成复合物假设：酶与底物反应生成复合物,和复合物
11、又解和复合物又解离成酶和底物的反应之间快速建立平衡离成酶和底物的反应之间快速建立平衡,而复而复合物解离成产物和酶合物解离成产物和酶,即即ESE+PESE+P是整个反应的是整个反应的限速步骤，即由酶和底物反应生成中间复合物限速步骤，即由酶和底物反应生成中间复合物的可逆反应在初速度测定时间内已经达到平衡。的可逆反应在初速度测定时间内已经达到平衡。n根据上述假设和式（根据上述假设和式（3-11），有），有:和和或表示为：或表示为：式中：式中：CE游离酶的浓度，游离酶的浓度，mol/L；CS底物的浓度，底物的浓度，mol/L;KS解离常数，解离常数，mol/L;n反应体系中酶的总浓度反应体系中酶的总浓
12、度CE0为：为：所以：所以：即：即：(3-12)式中：式中：r P,max产物的最大生成速率，产物的最大生成速率，mol/(L.s);CE0酶的总浓度，亦为酶的初始浓度，酶的总浓度，亦为酶的初始浓度，mol/L;n式（式（3-12）即米氏方程，式中的两个动）即米氏方程，式中的两个动力学参数是力学参数是KS和和rP,max。其中：。其中：KS表示了酶与底物相互作用的特性。表示了酶与底物相互作用的特性。KS的单位和的单位和CS的单位相同，的单位相同，当当rP=1/2 rP,max 时，存在时，存在KS=CS关系。关系。rP,max=k+2CE0。表示当全部酶都呈复合物状态时的反应速率。表示当全部酶
13、都呈复合物状态时的反应速率。k+2又叫酶的转换数。表示单位时间内一个酶分子所能催化底物又叫酶的转换数。表示单位时间内一个酶分子所能催化底物发生反应的分子数，因次，它表示酶催化反应能力的大小，不发生反应的分子数，因次，它表示酶催化反应能力的大小，不同的酶反应其值不同。同的酶反应其值不同。rP,max正比于酶的初始浓度正比于酶的初始浓度CE0。实际应用中将。实际应用中将k+2和和CE0合并应合并应用为一个参数。用为一个参数。Briggs-Haldane Briggs-Haldane方程方程n19251925年，年，BriggsBriggs和和HaldaneHaldane对米氏方程的推导作了一对米氏
14、方程的推导作了一项很重要的修正。他们认为，当项很重要的修正。他们认为，当k k+2+2k k-1-1时米氏假设时米氏假设中的快速平衡（中的快速平衡（ripid equilibriumripid equilibrium）不一定能够成立，）不一定能够成立，所以，不能用上述所以，不能用上述“平衡学说平衡学说”推导。即当从中间推导。即当从中间复合物生成产物的速率与其分解成酶和底物的速率复合物生成产物的速率与其分解成酶和底物的速率相差不大时，米氏方程的平衡假设不适用。他们提相差不大时，米氏方程的平衡假设不适用。他们提出了出了“拟稳态拟稳态”假设，认为由于反应体系中底物浓假设，认为由于反应体系中底物浓度要
15、比酶的浓度高的多，中间复合物分解时所产生度要比酶的浓度高的多，中间复合物分解时所产生的酶又立即与底物相结合，从而使反应体系中复合的酶又立即与底物相结合，从而使反应体系中复合物浓度维持不变，即中间复合物的浓度不随时间而物浓度维持不变，即中间复合物的浓度不随时间而变化。变化。n根据反应机理和上述假设，有下述方程式：根据反应机理和上述假设，有下述方程式：又因为有：又因为有：所以：所以：n式中：式中：Km米氏常数，米氏常数，mol/L;nKm与与Ks的关系为：的关系为：(3-13)(3-14)当当k+2k-1时，时，Km=Ks，即生成产物的速率大，即生成产物的速率大大慢于酶底物复合物解离的速率。大慢于
16、酶底物复合物解离的速率。Km值的大小与酶、反应物系的特性以及反应条值的大小与酶、反应物系的特性以及反应条件有关。件有关。某些酶促反应的某些酶促反应的Km值：值：P30表表3-1M-M方程与方程与B-H方程比较见下表方程比较见下表n在在M-M方程和方程和B-H方程的推导中都假设方程的推导中都假设CE0CS0，因，因而而CES值也很小。如果酶的浓度很高，值也很小。如果酶的浓度很高，CES值在反应值在反应过程中有可能是很高的。若仍然采用上述方程会带来过程中有可能是很高的。若仍然采用上述方程会带来较大误差。此时物料平衡和速率方程可表示为：较大误差。此时物料平衡和速率方程可表示为：动力学特征（米氏方程的
17、讨论）动力学特征（米氏方程的讨论）n根据米氏方程，根据米氏方程，酶反应的速度酶反应的速度与底物浓度的与底物浓度的关系为一双曲关系为一双曲线，线，P30P30图图3-13-1。该曲线表示了该曲线表示了三个不同动力三个不同动力学特点的区域。学特点的区域。n当当CSKm，即底物浓度比，即底物浓度比Km值小很多时，该值小很多时，该曲线近似为一直线。表示反应速率与底物浓度曲线近似为一直线。表示反应速率与底物浓度近似成正比关系，此时酶催化反应成为一级反近似成正比关系，此时酶催化反应成为一级反应速率方程。应速率方程。当当Km值很大时，大部分酶为游离态的酶，而值很大时，大部分酶为游离态的酶，而CES的量很少。
18、要想提高反应速率，只有通过提高的量很少。要想提高反应速率，只有通过提高CS值，值，进而提高进而提高CES，才能使反应速率加快。因而此时反，才能使反应速率加快。因而此时反应速率主要取决于底物浓度的变化。应速率主要取决于底物浓度的变化。将上式进行重排，积分，可以推出将上式进行重排，积分，可以推出(3-15)式中：式中：CS0底物的初始浓度，底物的初始浓度，mol/L;这个原理在酶法分析中被应用。利用这个原理在酶法分析中被应用。利用酶测定底物时，可使用足够量的酶以酶测定底物时，可使用足够量的酶以便在较短时间内，使反应达到完全。便在较短时间内，使反应达到完全。这样测定形成的产物总量就与待测物这样测定形
19、成的产物总量就与待测物的量相等或相关。的量相等或相关。n当当CSKm时，该曲线近似为一水平线，表示时，该曲线近似为一水平线，表示当底物浓度继续增加时，反应速率变化不大。当底物浓度继续增加时，反应速率变化不大。此时酶反应可视为此时酶反应可视为零级反应零级反应，反应速率将不随，反应速率将不随底物浓度的变化而变化。这是因为当底物浓度的变化而变化。这是因为当Km值很小值很小时，绝大多数酶呈复合物状态，反应体系内游时，绝大多数酶呈复合物状态，反应体系内游离的酶很少，因而即使提高底物的浓度，也不离的酶很少，因而即使提高底物的浓度，也不能提高其反应速率。能提高其反应速率。(3-16)即：即：或：或：n当当C
20、S与与Km的数量关系处于上述两者之间的范的数量关系处于上述两者之间的范围时，即符合米氏方程所表示的关系式。在围时，即符合米氏方程所表示的关系式。在t=0时，时，CS=CS0，对（，对（2-13）式积分得到：）式积分得到：或：或：式中：式中：，XS为底物转化率。为底物转化率。Levenspiel提出亦可用幂函数形式表示米氏方程，为：提出亦可用幂函数形式表示米氏方程，为：n总结：总结：nM-M方程平衡假设：方程平衡假设：B-H方程拟稳态假设：方程拟稳态假设：动力学参数的求取动力学参数的求取n将米氏方程线性化，用作图法求取动力将米氏方程线性化，用作图法求取动力学参数学参数rmax（或（或k+2）和）
21、和Km值。值。nA、Lineweaker-Burk法（法（L-B法）法）nB、Hanes-Woolf法（法（H-W法）法）nC、Eadie-Hofstee法（法（E-H法）法）nD、积分法、积分法A A、Lineweaker-BurkLineweaker-Burk法（法（L-BL-B法）法）n将米氏方程取倒数，得到：将米氏方程取倒数，得到：以以1/rs对对1/CS作图得一直线，斜率为作图得一直线，斜率为Km/rmax，直线与纵轴交于直线与纵轴交于1/rmax，与横轴交于，与横轴交于-1/Km。此。此法称双倒数图解法。见图法称双倒数图解法。见图2-2（a）。）。B B、Hanes-WoolfHa
22、nes-Woolf法（法（H-WH-W法）法）n上式两边均乘以上式两边均乘以CS，得到：，得到：以以CS/rS对对CS作图，得一直线，斜率为作图，得一直线，斜率为1/rmax，直线，直线与纵轴交点为与纵轴交点为Km/rmax，与横轴交点为，与横轴交点为-Km。见图见图2-2（b）。）。C C、Eadie-HofsteeEadie-Hofstee法（法（E-HE-H法）法）n将米氏方程重排为：将米氏方程重排为：以以rS对对rS/CS作图，得一直线，斜率为作图，得一直线，斜率为-Km，与纵轴交点为与纵轴交点为rmax，与横轴交点为，与横轴交点为rmax/Km。见图见图2-2（c）D、积分法、积分法
23、n将动力学实验中测得的时间与浓度数据直接代入将动力学实验中测得的时间与浓度数据直接代入米氏方程的积分形式，经整理得到：米氏方程的积分形式，经整理得到：与与对应作图，得到图对应作图，得到图2-2（d）应用直线作图法求取动力学参数：应用直线作图法求取动力学参数：n练习：练习：nP31P31例例3-33-3葡萄糖在葡萄糖异构酶存在时葡萄糖在葡萄糖异构酶存在时转化为果糖的反应是可逆反应，在平衡转化为果糖的反应是可逆反应，在平衡状态下，底物和产物都有相当的量，必状态下，底物和产物都有相当的量，必须考虑逆反应。须考虑逆反应。n请参见解题和生物反应器工程请参见解题和生物反应器工程P11P11，三、可逆反应，
24、双底物反应和辅因子活三、可逆反应，双底物反应和辅因子活化动力学。化动力学。2、操作参数对酶促反应的影响、操作参数对酶促反应的影响n在诸多影响酶催化活性的因素中，比较重在诸多影响酶催化活性的因素中，比较重要的有要的有pH值、温度、流体力、化学试剂和值、温度、流体力、化学试剂和辐射（声、光等）。其中最常遇到，影响辐射（声、光等）。其中最常遇到，影响最大的是最大的是pH值和温度的作用。值和温度的作用。npH值的影响值的影响n温度的影响温度的影响pH值的影响值的影响 构成酶蛋白的氨基酸含构成酶蛋白的氨基酸含有碱性、中性和酸性基团。有碱性、中性和酸性基团。在一定的在一定的pHpH值下，酶具有值下，酶具有
25、带正电荷基团也带有负电荷带正电荷基团也带有负电荷基团，而这些基团常是构成基团，而这些基团常是构成活性点的部分。一种酶往往活性点的部分。一种酶往往只是在一种特定的电荷状态只是在一种特定的电荷状态下才具有催化活性。随着下才具有催化活性。随着pHpH值的变化，具有这种特值的变化，具有这种特定电荷状态的酶只占有总酶定电荷状态的酶只占有总酶的或多或少的一部分，酶的的或多或少的一部分，酶的相对活力有一个最大值，即相对活力有一个最大值，即相对活力相对活力-pH-pH曲线常呈钟罩曲线常呈钟罩形，见图。形，见图。n根据以上分析，根据以上分析，Michaelis对对pH值与酶活力的关值与酶活力的关系提出系提出三状
26、态模型三状态模型的假设，基本点如下：的假设，基本点如下：n1、假定酶分子有两个可解离的基团，随着、假定酶分子有两个可解离的基团，随着pH值值的变化，分别呈现出的变化，分别呈现出EH2、EH-及及E2-三种状态，即：三种状态，即：EH2 EH-E2-n酸性条件下，酶呈酸性条件下，酶呈EH2状态；当状态；当pH增加，酶以增加，酶以EH-状状态存在；当态存在；当pH继续增加，酶以继续增加，酶以E2-状态存在。状态存在。n2、上述三种解离状态中，只有、上述三种解离状态中，只有EH-型具有催化活性。型具有催化活性。n3、底物、底物S的解离状态不变。的解离状态不变。n4、速率控制步骤为由、速率控制步骤为由
27、EHS-生成产物生成产物P的速率。的速率。n反应机理式可表示为：反应机理式可表示为：根据酶催化反应动力学的一般原理，可有下述的基本关系式：根据酶催化反应动力学的一般原理，可有下述的基本关系式：(3-29)(3-30)(3-31)n若定义：若定义：n经整理可得到下式：经整理可得到下式：n式中：式中：Ka、Ka,、Kb、Kb,电离平衡常数，氢离子浓度。电离平衡常数，氢离子浓度。n CH+氢离子浓度。氢离子浓度。(3-3235)(3-36)n由上式可以看由上式可以看出，出，f f1 1和和f f2 2均与均与pHpH值有关。值有关。P21P21图图2-32-3表示表示了了pHpH值的变化值的变化对反
28、应速率相对反应速率相对值的影响。对值的影响。从该图可以看从该图可以看出，对酶催化出，对酶催化反应适宜的反应适宜的pHpH值约处于值约处于6 69 9之间。之间。图图3-3温度的影响温度的影响n温度对酶催化反应的影响是，在较低的温度范温度对酶催化反应的影响是，在较低的温度范围内，反应速率随着温度的升高而加快，超过围内，反应速率随着温度的升高而加快，超过某一温度，即酶被加热到生理允许温度以上，某一温度，即酶被加热到生理允许温度以上，酶的反应速率反而随着温度的上升而下降。这酶的反应速率反而随着温度的上升而下降。这是因为温度升高，虽然可加速酶的催化反应速是因为温度升高，虽然可加速酶的催化反应速率，同时
29、也加快了酶的失活速率。率，同时也加快了酶的失活速率。n在适宜的温度内，酶催化反应速率常数中的在适宜的温度内，酶催化反应速率常数中的k+2与温度的关系符合与温度的关系符合Arrhenius方程。方程。n即：即：n式中：式中：nA指前因子；指前因子；nEa反应活化能；反应活化能；nR气体常数；气体常数；T绝对温度；绝对温度；(3-37)如果以如果以lgklgk+2+2对对1/T1/T对对应作图，可得一直应作图，可得一直线，由该直线的斜线，由该直线的斜率可求得活化能率可求得活化能EaEa值，该直线是以肌值，该直线是以肌球蛋白酶催化的球蛋白酶催化的ATPATP水解反应的数据做水解反应的数据做出的。出的
30、。图图2-4n酶反应的酶反应的EaEa值，通常是正值，如能服从值，通常是正值，如能服从式（式（3-373-37），当温度升高时，反应速率），当温度升高时，反应速率应会不断地增大，但实际上并非如此，应会不断地增大，但实际上并非如此，该式只局限于比较狭小的较低温度范围该式只局限于比较狭小的较低温度范围内才成立。在较高的温度范围内，酶因内才成立。在较高的温度范围内，酶因热失活，具有活性的酶量减少，因而使热失活，具有活性的酶量减少，因而使反应速率下降。因此出现一最佳的温度反应速率下降。因此出现一最佳的温度范围。范围。P35P35图图3-43-4中曲线中曲线a a表示的是过氧化表示的是过氧化氢酶催化氢酶
31、催化H H2 2OO2 2分解时反应速率与温度的分解时反应速率与温度的关系，该反应的反应速率也就是氧的产关系，该反应的反应速率也就是氧的产生速率。生速率。3 3、抑制剂对酶促反应速率的影响、抑制剂对酶促反应速率的影响n酶反应速率降低的原因：酶反应速率降低的原因：n失活失活指物理或化学因素部分或全部破坏了指物理或化学因素部分或全部破坏了酶的三维结构，引起酶的变性，导致酶部分或酶的三维结构，引起酶的变性，导致酶部分或全部丧失活性。全部丧失活性。n抑制抑制指在酶不变性条件下，由于活性中心指在酶不变性条件下，由于活性中心化学性质的改变而引起的酶活性的降低或丧失。化学性质的改变而引起的酶活性的降低或丧失
32、。n抑制剂抑制剂导致抑制作用产生的物质称为酶抑导致抑制作用产生的物质称为酶抑制剂。制剂。抑制作用：抑制作用：可逆抑制：可逆抑制：不可逆抑制：不可逆抑制：竞争性抑制竞争性抑制非竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制反竞争性抑制混合型抑制混合型抑制竞争性抑制动力学竞争性抑制动力学n若在反应体系中存在有与若在反应体系中存在有与底物底物结构相类似的物质，结构相类似的物质，该物质也该物质也能在酶的活性部位能在酶的活性部位 上结合，从上结合，从而阻碍了酶与底物的结合，使而阻碍了酶与底物的结合，使酶催化底物的反应速率下降。酶催化底物的反应速率下降。这种抑制称为这种抑制称为竞争性抑制竞争性抑制。该。该物质称为物质
33、称为竞争性抑制剂竞争性抑制剂。n主要特点：主要特点：n抑制剂与底物竞争酶的活性抑制剂与底物竞争酶的活性部位，当抑制剂与酶的活性部位，当抑制剂与酶的活性部位结合后，底物不能再与部位结合后，底物不能再与酶结合，反之亦然。酶结合，反之亦然。ESIn如：n竞争性抑制的机理为：竞争性抑制的机理为：n式中：I-抑制剂n EI-非活性复合物丙二酸丙二酸n反应中底物的反应速率方程为反应中底物的反应速率方程为n根据稳态假设，可列出下述方程：根据稳态假设，可列出下述方程：n式中：式中：CI-抑制剂浓度抑制剂浓度n CEI-非活性复合物浓度非活性复合物浓度n前面公式经整理可得下式前面公式经整理可得下式：式中：式中：
34、rSI有抑制时的反应速率，有抑制时的反应速率，mol/(L.s);KmI 有竞争性抑制时的米氏常数，有竞争性抑制时的米氏常数，mol/(L.s);KI抑制剂的解离常数，抑制剂的解离常数，mol/L;竞争性抑制动力学的主要特点是米氏常数值的改变。竞争性抑制动力学的主要特点是米氏常数值的改变。当当CI增加或增加或KI减小，都将使减小，都将使KmI值增大，使酶与底物值增大，使酶与底物的结合能力下降，活性复合物减少，因而使底物反应的结合能力下降，活性复合物减少，因而使底物反应速率下降。速率下降。（2-竟抑制）竟抑制）无抑制与竞争性抑制的反应速率无抑制与竞争性抑制的反应速率与底物浓度的关系曲线图：与底物
35、浓度的关系曲线图：n对（对（2-竟抑制）式取倒数，得到：竟抑制）式取倒数，得到：或：或：以以1/rSI对对1/CS作图，可得到一直线，该直线的斜率作图，可得到一直线，该直线的斜率为为KmI/rmax，与纵轴交点为，与纵轴交点为1/rmax，与横轴交点为，与横轴交点为-1/KmI。又：。又：以以KmI对对CI作图，并根据此图求出作图，并根据此图求出Km和和KI值。值。竞争性抑制动力学参数求取图竞争性抑制动力学参数求取图：n抑制剂的解离常数抑制剂的解离常数KI可表示为可表示为：n由此可看出，由此可看出，K KI I愈小，表明抑制剂与酶的结合愈小，表明抑制剂与酶的结合力愈强，对酶的催化反应能力的抑制
36、作用就越力愈强，对酶的催化反应能力的抑制作用就越强。强。n当酶的活性部位与一个抑制剂分子相结合时，当酶的活性部位与一个抑制剂分子相结合时，K KmImI与与C CI I的关系为一直线可称为的关系为一直线可称为线性线性竞争抑制；竞争抑制；如果酶的活性部位与两个以上的抑制剂分子相如果酶的活性部位与两个以上的抑制剂分子相结合，则结合，则K KmImI与与C CI I的关系为一的关系为一抛物线抛物线，可称为抛，可称为抛物线型的竞争抑制。物线型的竞争抑制。非竞争性抑制动力学非竞争性抑制动力学n非竞争性抑制：抑制剂与酶分子的结合点不在酶催非竞争性抑制：抑制剂与酶分子的结合点不在酶催化反应的活性部位，底物与
37、酶的结合并不影响抑制化反应的活性部位，底物与酶的结合并不影响抑制剂与酶的结合，而抑制剂与酶的结合却阻止底物与剂与酶的结合，而抑制剂与酶的结合却阻止底物与酶的结合，这种现象称为非竞争性抑制。酶的结合，这种现象称为非竞争性抑制。ESISIEn在非竞争性抑制中抑制剂即可与游离的酶相结合，在非竞争性抑制中抑制剂即可与游离的酶相结合，也可与复合物也可与复合物ESES相结合，生成了底物相结合，生成了底物-酶酶-抑制剂抑制剂的复合物的复合物SEISEI。绝大多数的情况是复合物。绝大多数的情况是复合物SEISEI为为一无催化活性的端点复合物，不能分解为产物，一无催化活性的端点复合物，不能分解为产物，即使增大底
38、物的浓度也不能解除抑制剂的影响。即使增大底物的浓度也不能解除抑制剂的影响。还有一种是三元复合物还有一种是三元复合物SEISEI也能分解为产产物，也能分解为产产物，但对酶的催化反应速率仍然产生了抑制作用。机但对酶的催化反应速率仍然产生了抑制作用。机理式表示如下：理式表示如下：n从机理可知存在关系：从机理可知存在关系：式中：式中：CESI底物底物-酶酶-抑制剂三元复合物浓度。抑制剂三元复合物浓度。(2-非竟抑制非竟抑制)式中：式中：rR,max存在非竞争性抑制时的最大反应速率。存在非竞争性抑制时的最大反应速率。n对于非竞争性对于非竞争性抑制，由于抑抑制，由于抑制剂的作用使制剂的作用使最大反应速率最
39、大反应速率降低了降低了 倍，倍，并且并且C CI I增加、增加、K KI I减少都使其减少都使其抑制程度增加。抑制程度增加。此时此时r rSI SI对对C CS S的的关系如图关系如图2-62-6所示。所示。n根据根据L-B作图法，式作图法，式(2-非竟抑制非竟抑制)可整理为：可整理为：n或或n以以 与与 作图，可得如图作图，可得如图所示的直线关系。并求出所示的直线关系。并求出Km和和r I,max值。值。n又根据又根据n通过实验测得不同通过实验测得不同CI下的下的rI，max值，进而决定值，进而决定KI值。值。n如果三元复合物如果三元复合物SEI也能分解为产物，则在机理式中增也能分解为产物，
40、则在机理式中增加了一步加了一步 ，同样可整理成形式上与，同样可整理成形式上与(2-非竟抑制非竟抑制)类似的速率方程式，所不同的仅是类似的速率方程式，所不同的仅是rI,max所所包含的参数上。包含的参数上。n如何判断复合物如何判断复合物SEI是否分解为产物，可通过改变抑制是否分解为产物，可通过改变抑制剂用量，并测定底物的反应速率来判断。剂用量，并测定底物的反应速率来判断。n非竞争性抑制与竞争性抑制的主要非竞争性抑制与竞争性抑制的主要不同点不同点是：是：n对竞争性抑制，随着底物浓度的增大，抑制剂的影对竞争性抑制，随着底物浓度的增大，抑制剂的影响可减弱；响可减弱；n而非竞争性抑制，即使增大底物浓度也
41、不能减弱抑而非竞争性抑制，即使增大底物浓度也不能减弱抑制剂的影响。制剂的影响。n由此可见，竞争性抑制作用是可逆的，非竞争由此可见，竞争性抑制作用是可逆的，非竞争性抑制作用是不可逆的。性抑制作用是不可逆的。根据实验数据判别竞争性抑制根据实验数据判别竞争性抑制和非竞争性抑制和非竞争性抑制反竞争性抑制动力学反竞争性抑制动力学n反竞争性抑制的特点是抑制剂不能直接与游离酶相反竞争性抑制的特点是抑制剂不能直接与游离酶相结合，而只能与复合物结合，而只能与复合物ES相结合生成相结合生成SEI复合物。复合物。根据拟稳态假设和物料平衡，经整理后可得到其根据拟稳态假设和物料平衡，经整理后可得到其速率方程为速率方程为
42、或或（3-反竟抑制）反竟抑制）n根据上述各定义式，可以推出：根据上述各定义式，可以推出：n以以rSI对对CS作图，得到下图所示曲线。作图，得到下图所示曲线。n根据根据L-B作图法，式（作图法，式（3-反竟抑制）可改写为反竟抑制）可改写为n 以以1/rSI对对1/CS作图。利用该图求作图。利用该图求取动力学参数。取动力学参数。线性混合型抑制动力学线性混合型抑制动力学n线性混合型的最简单机制可用下式表示：线性混合型的最简单机制可用下式表示：在上述机理中，在上述机理中，从左式来看，它基本上与非从左式来看，它基本上与非竞争性抑制的模型相同，所竞争性抑制的模型相同，所不同的是，当不同的是，当EI与与S相
43、结相结合成合成SEI时，由于抑制剂时，由于抑制剂的存在影响了的存在影响了EI与与S的结的结合，因而其解离常数由合，因而其解离常数由Ks变变为为Ks，同样，同样ES与与I结合时，结合时，其解离常数由其解离常数由KI变为变为KI。n根据上述机理式，可推出其速率方程为：根据上述机理式，可推出其速率方程为：n对此种抑制，对此种抑制，(4-线混竟抑制线混竟抑制)式中式中:Ks和和KI的修正系数，当的修正系数，当 =1，KI=KI时，上述抑制实为非竞争性抑制。时，上述抑制实为非竞争性抑制。n前面已经讨论了竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争前面已经讨论了竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制及混合型抑制的动力
44、学方程，虽然各具特点，性抑制及混合型抑制的动力学方程，虽然各具特点，但可用一普遍化的公式来表示。但可用一普遍化的公式来表示。普遍化的机制可表示为右图。普遍化的机制可表示为右图。若无若无EIS存在，则为竞争性存在，则为竞争性抑制；若抑制；若E和和EI与与S有同等有同等的结合力，且的结合力，且EIS无反应活无反应活性，则为非竞争性抑制；若无性，则为非竞争性抑制；若无EI存在，且存在，且EIS无反应活无反应活性，则为反竞争性抑制性，则为反竞争性抑制。n普遍化的公式可表示为普遍化的公式可表示为：式中式中 KIS、KSI-分别为分别为EI与与S和和ES与与I相结合形成相结合形成SEI 的解离常数。的解离
45、常数。当当KIS=KSI时，为非竞争性抑制；当时，为非竞争性抑制；当KSI时为竞争性抑时为竞争性抑制，当制，当KIS时为反竞争性抑制，当时为反竞争性抑制，当KISKSI且均为常数值且均为常数值时，称为混合抑制。时，称为混合抑制。n下表列出了某些酶抑制剂的解离常数。下表列出了某些酶抑制剂的解离常数。某些酶抑制剂的解离常数值某些酶抑制剂的解离常数值酶酶底物底物抑制剂抑制剂解离常数解离常数mmol/L醇脱氢酶醇脱氢酶-淀粉酶淀粉酶天冬氨酸酶天冬氨酸酶富马酸酶富马酸酶葡糖异构酶葡糖异构酶乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶乙醇乙醇淀粉淀粉L-天冬氨酸天冬氨酸富马酸盐富马酸盐D-葡萄糖葡萄糖乳酸盐乳酸盐乙醛乙醛环已淀粉
46、环已淀粉羟胺羟胺丙二酸盐丙二酸盐木糖醇木糖醇丙酮酸盐丙酮酸盐0.670.230.040.04.50.18n底物抑制（底物抑制（substrate inhibition）实际上有些酶的催化反应，由于底物浓度实际上有些酶的催化反应，由于底物浓度过高，其反应速率反而会下降，此种效应过高，其反应速率反而会下降，此种效应称为底物的抑制作用。称为底物的抑制作用。底物的抑制动力学底物的抑制动力学n有些酶催化反应，在底物浓度增加时，有些酶催化反应，在底物浓度增加时，反应速率反而会下降，这种由底物浓度反应速率反而会下降，这种由底物浓度增大而引起反应速率下降的作用称为底增大而引起反应速率下降的作用称为底物抑制作用
47、。此时的反应机理式为：物抑制作用。此时的反应机理式为：式中式中 SES-不具有催化反应活性，不能分解为产物不具有催化反应活性，不能分解为产物的三元复合物。的三元复合物。n应用稳态处理，可得到底物抑制的酶催化反应动力学应用稳态处理，可得到底物抑制的酶催化反应动力学方程为：方程为：(3-40)或或式中式中 rSS-底物抑制的反应速率，底物抑制的反应速率，mol/(Ls)；KSI-底物抑制的解离常数，底物抑制的解离常数，mol/L；(3-39)n底物抑制作用是在高底物浓度下，随着底物抑制作用是在高底物浓度下，随着底物浓度的增加，反应速率经过一个最底物浓度的增加，反应速率经过一个最大值，当底物浓度大值
48、，当底物浓度CS大于大于Csmax时，底物时，底物浓度的增加反而引起反应速率的减小。浓度的增加反而引起反应速率的减小。这种动力学行为对生化反应器的性能有这种动力学行为对生化反应器的性能有重要意义。重要意义。n底物抑制下的底物浓度和反应速率的定底物抑制下的底物浓度和反应速率的定量关系类似米氏方程的推导方法得出。量关系类似米氏方程的推导方法得出。在最简单的情况下，酶在最简单的情况下，酶-底物中间物底物中间物ES能够与第二个底物分子能够与第二个底物分子S结合生成第二个结合生成第二个中间物中间物SES，且它不能进一步反应。，且它不能进一步反应。n当底物抑制时，当底物抑制时，rSS与与CS的关系表示在图
49、的关系表示在图2-10（戚）中（戚）中。根据图根据图2-10，速率曲线有一最，速率曲线有一最大值，即大值，即rS,max为最大底物消耗为最大底物消耗速率。相对应的底物浓度值速率。相对应的底物浓度值CS,OPT可通过下式求出：可通过下式求出：式中式中 CS,OPT-为最佳底物浓为最佳底物浓度度产物的抑制动力学产物的抑制动力学n产物抑制系指当产物与酶形成复合物产物抑制系指当产物与酶形成复合物EP后，就停止继续进后，就停止继续进行反应的情况，特别是当产物浓度较高时有可能出现这种抑行反应的情况，特别是当产物浓度较高时有可能出现这种抑制。其反应机理如下：制。其反应机理如下：所生成所生成EP为无活性的端点
50、复合物。为无活性的端点复合物。n应用稳态法推导得出如下反应速率方程式应用稳态法推导得出如下反应速率方程式：(3-45)n式中式中 称为产物抑制解离常数称为产物抑制解离常数。与无抑制相比较，最大反应速率与无抑制相比较，最大反应速率rmax值不变，米氏常值不变，米氏常数增大了数增大了 倍，同竞争抑制一样，使反应速率下降倍，同竞争抑制一样，使反应速率下降。各种抑制的比较各种抑制的比较n这里重要对竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制等三这里重要对竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制等三种有代表性的抑制动力学特点进行比较。种有代表性的抑制动力学特点进行比较。P37表表3-2列出了上列出了上述三种抑制