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1、 第二章 荧光光谱与磷光光谱 分子发光包括荧光、磷光、化学发光、生物发光和散射光谱等。1 教学要求n n掌握分子荧光、磷光的产生机理；掌握激发光谱掌握分子荧光、磷光的产生机理；掌握激发光谱和发射光谱特征。和发射光谱特征。n n掌握荧光与分子结构的关系以及溶液的荧光（磷掌握荧光与分子结构的关系以及溶液的荧光（磷光）强度的影响因素。光）强度的影响因素。n n了解荧光（磷光）分析法的特点及定量测定方法。了解荧光（磷光）分析法的特点及定量测定方法。n n了解磷光分析法的类型。了解磷光分析法的类型。n n了解荧光、磷光分析仪器的结构。了解荧光、磷光分析仪器的结构。简介2一、基本原理一、基本原理（一）荧光
2、和磷光的产生（一）荧光和磷光的产生（一）荧光和磷光的产生（一）荧光和磷光的产生1.1 1.1 电子由基态跃迁激发态电子由基态跃迁激发态S 2Ssi+13一、基本原理一、基本原理（一）荧光和磷光的产生（一）荧光和磷光的产生（一）荧光和磷光的产生（一）荧光和磷光的产生1.1 1.1 电子由基态跃迁激发态电子由基态跃迁激发态处于分子基态单重态中的电子对，其自旋方向相反，当其中处于分子基态单重态中的电子对，其自旋方向相反，当其中一个电子被激发时，通常跃迁至第一激发态单重态轨道上，一个电子被激发时，通常跃迁至第一激发态单重态轨道上，也可能跃迁至能级更高的单重态上。这种跃迁是符合光谱选也可能跃迁至能级更高
3、的单重态上。这种跃迁是符合光谱选律的，如果跃迁至第一激发三重态轨道上，则属于禁阻跃迁。律的，如果跃迁至第一激发三重态轨道上，则属于禁阻跃迁。单重态与三重态的区别在于电子自旋方向不同，激发三重态单重态与三重态的区别在于电子自旋方向不同，激发三重态具有较低能级。具有较低能级。4一、基本原理一、基本原理单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为1010-8-8s s，而三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为而三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为1010-4-4 1 1s s以上以上（通常用（通常用（通常用（通常用S S和和和和T T分别表示
4、单重态和三重态）。分别表示单重态和三重态）。分别表示单重态和三重态）。分别表示单重态和三重态）。5一、基本原理一、基本原理1.2 1.2 激发态分子退激激发态分子退激 辐射跃迁方式辐射跃迁方式辐射跃迁方式辐射跃迁方式 无辐射跃迁方式无辐射跃迁方式无辐射跃迁方式无辐射跃迁方式辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发射辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发射无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛豫（豫（豫（豫（VRV
5、R）、）、）、）、内部转移（内部转移（内部转移（内部转移（IRIR）、）、）、）、系间窜跃（系间窜跃（系间窜跃（系间窜跃（IXIX）及外部转移及外部转移及外部转移及外部转移（ECEC）等等等等各种跃迁方式发生的可能性及程度，与各种跃迁方式发生的可能性及程度，与荧光物质本身的结构荧光物质本身的结构荧光物质本身的结构荧光物质本身的结构及及激发时的物理和化学环境等因素激发时的物理和化学环境等因素激发时的物理和化学环境等因素激发时的物理和化学环境等因素有关。有关。6一、基本原理一、基本原理下面结合荧光和磷光的产生过程，进一步说明各种能量传递方式在其中所起的作用。设处于基态单重态中的电子吸收波长为1和2
6、的辐射光之后，分别激发至第二单重态S2及第一单重态S1。7一、基本原理一、基本原理振动弛豫振动弛豫振动弛豫振动弛豫 指指 在同一电子能级在同一电子能级在同一电子能级在同一电子能级中，中，电子由高振动能级转至低振动能级，电子由高振动能级转至低振动能级，而将多余的能量以热的形式发出而将多余的能量以热的形式发出。发生振动弛豫的时间为。发生振动弛豫的时间为1010-12-12s s数量级。数量级。8 振动振动振动振动弛弛豫豫豫豫S0S2S1T1吸光1吸光2振振动弛豫在同一电子能级中，电子由高振动能级转至低振动能级，而将多余的能量以热热 的形式发出。9一、基本原理一、基本原理内转移内转移内转移内转移当当
7、两个电子能级两个电子能级两个电子能级两个电子能级非常靠近以非常靠近以至其振动能级有至其振动能级有重叠重叠重叠重叠时，常时，常发生电子由高能级以发生电子由高能级以无辐射无辐射无辐射无辐射跃迁方式跃迁方式跃迁方式跃迁方式转移至低能级。右转移至低能级。右图中指出，处于高激发单重图中指出，处于高激发单重态的电子，通过内转移及振态的电子，通过内转移及振动弛豫，均回到第一激发单动弛豫，均回到第一激发单重态的最低振动能级。重态的最低振动能级。S0S2S1T1吸光1吸光2内转移内转移10一、基本原理一、基本原理荧光发射荧光发射荧光发射荧光发射处于第一激发单重态中的电子处于第一激发单重态中的电子跃回至基态各振动
8、能级时，将跃回至基态各振动能级时，将得到最大波长为得到最大波长为3 3的荧光。的荧光。注注注注意：意：意：意：基态中也有振动驰豫跃迁基态中也有振动驰豫跃迁基态中也有振动驰豫跃迁基态中也有振动驰豫跃迁。很明显，很明显，3 3的波长较激发波长的波长较激发波长1 1或或2 2都长，而且不论电子开都长，而且不论电子开始被激发至什么高能级，最终始被激发至什么高能级，最终将只发射出波长将只发射出波长3 3的荧光。荧的荧光。荧光的产生在光的产生在1010-7-7-10-10-9-9s s内完成。内完成。S0S2S1T1吸光1吸光2荧光3荧光11一、基本原理一、基本原理系间窜跃系间窜跃系间窜跃系间窜跃不同多重
9、态间不同多重态间不同多重态间不同多重态间的的无辐射跃迁无辐射跃迁无辐射跃迁无辐射跃迁，例如例如S S1 1T T1 1就是一种系间窜跃。就是一种系间窜跃。通常，发生系间窜跃时，通常，发生系间窜跃时，电子电子电子电子由由由由S S1 1的较低振动能级转移至的较低振动能级转移至的较低振动能级转移至的较低振动能级转移至T T1 1的较高振动能级处的较高振动能级处的较高振动能级处的较高振动能级处。有时，通。有时，通过热激发，有可能发生过热激发，有可能发生T T1 1S S1 1，然后由然后由S S1 1发生荧光。这是产生发生荧光。这是产生延迟荧光的机理。延迟荧光的机理。荧光、磷光荧光、磷光 能级图能级
10、图S0S2S1T1吸光1吸光2荧光3系间窜跃系间窜跃12一、基本原理一、基本原理磷光发射磷光发射磷光发射磷光发射 电子由基态单重态激发至第一激发三电子由基态单重态激发至第一激发三重态的几率很小，因为这是禁阻跃迁。重态的几率很小，因为这是禁阻跃迁。但是，由第一激发单重态的最低振动但是，由第一激发单重态的最低振动能级，有可能以系间窜跃方式转至第能级，有可能以系间窜跃方式转至第一激发三重态，再经过振动驰豫，转一激发三重态，再经过振动驰豫，转至其最低振动能级，由此激发态跃回至其最低振动能级，由此激发态跃回至基态时，便发射磷光，这个跃迁过至基态时，便发射磷光，这个跃迁过程（程（T T1 1S S0 0）
11、也是自旋禁阻的，其发也是自旋禁阻的，其发光速率较慢，约为光速率较慢，约为1010-4-4-10-10s s。因此，因此，这种跃迁所发射的光，这种跃迁所发射的光，在光照停止后，在光照停止后，在光照停止后，在光照停止后，仍可持续一段时间。仍可持续一段时间。仍可持续一段时间。仍可持续一段时间。荧光、磷光荧光、磷光 能级图能级图S0S1S2T1吸光1吸光2荧光3磷光磷光13一、基本原理一、基本原理外转移外转移外转移外转移指激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用及能量转指激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用及能量转指激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用及能量转指激发分子与溶剂分子或其它溶
12、质分子的相互作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失。这一现象称为移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失。这一现象称为移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失。这一现象称为移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失。这一现象称为“熄灭熄灭熄灭熄灭”或或或或“猝灭猝灭猝灭猝灭”。14一、基本原理一、基本原理荧光与磷光的根本区别：荧光与磷光的根本区别：荧光与磷光的根本区别：荧光与磷光的根本区别：荧光荧光荧光荧光是由激发是由激发单重态单重态单重态单重态最低振动能级至基态各振动能级间跃迁最低振动能级至基态各振动能级间跃迁产生的；而产生的；而磷光磷光磷光磷光是由是由激发三重态激发三重态激发三重态激发三重态的最低振动能级至基
13、态各振的最低振动能级至基态各振动能级间跃迁产生的。动能级间跃迁产生的。15一、基本原理一、基本原理（二）激发光谱曲线和荧光、磷光光谱曲线（二）激发光谱曲线和荧光、磷光光谱曲线（二）激发光谱曲线和荧光、磷光光谱曲线（二）激发光谱曲线和荧光、磷光光谱曲线2.1 2.1 激发光谱曲线激发光谱曲线荧光和磷光均为光致发光，因此必须选择合适的激发光波长，荧光和磷光均为光致发光，因此必须选择合适的激发光波长，可根据它们的激发光谱曲线来确定。可根据它们的激发光谱曲线来确定。绘制激发光谱曲线时，绘制激发光谱曲线时，绘制激发光谱曲线时，绘制激发光谱曲线时，固定测量波长为荧光（或磷光）最大发射波长，然后改变激固定测
14、量波长为荧光（或磷光）最大发射波长，然后改变激固定测量波长为荧光（或磷光）最大发射波长，然后改变激固定测量波长为荧光（或磷光）最大发射波长，然后改变激发波长，根据所测得的荧光（磷光）强度与激发光波长的关发波长，根据所测得的荧光（磷光）强度与激发光波长的关发波长，根据所测得的荧光（磷光）强度与激发光波长的关发波长，根据所测得的荧光（磷光）强度与激发光波长的关系，即可绘制系，即可绘制系，即可绘制系，即可绘制 激发光谱曲线激发光谱曲线16 应该指出，激发光谱曲线与其吸收曲线可能相同，但应该指出，激发光谱曲线与其吸收曲线可能相同，但激发光激发光激发光激发光谱曲线谱曲线谱曲线谱曲线是是荧光强度与波长的关
15、系曲线荧光强度与波长的关系曲线，吸收曲线则是吸收曲线则是吸收曲线则是吸收曲线则是吸光吸光度与波长的关系曲线度与波长的关系曲线，两者在性质上是不同的。，两者在性质上是不同的。17一、基本原理一、基本原理2.2 2.2 荧光或磷光光谱曲线荧光或磷光光谱曲线如果如果 固定激发光波长为其最大激发波长，然后测定不同波长固定激发光波长为其最大激发波长，然后测定不同波长时所发射的荧光或磷光强度时所发射的荧光或磷光强度，即可绘制即可绘制荧光或磷光光谱曲线荧光或磷光光谱曲线荧光或磷光光谱曲线荧光或磷光光谱曲线。在荧光和磷光的产生过程中，由于存在各种形式的无辐射跃在荧光和磷光的产生过程中，由于存在各种形式的无辐射
16、跃迁，损失能量，所以它们的最大发射波长都向长波方向移动，迁，损失能量，所以它们的最大发射波长都向长波方向移动，以磷光波长的移动最多，而且它的强度也相对较弱。以磷光波长的移动最多，而且它的强度也相对较弱。18激发波长的选择与发射波长的判断19一、基本原理一、基本原理2.3 2.3 荧光发射光谱的普遍特性：荧光发射光谱的普遍特性：荧光发射光谱的普遍特性：荧光发射光谱的普遍特性：（1 1）StokesStokes位移位移位移位移 在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长位移到较长的波长位移到较长的波长位移到较长的波长，称为称为StokesStokes位移位
17、移位移位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去能。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去能量，也由于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量量，也由于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量的损失。因此，在激发和发射之间产生了能量损失。的损失。因此，在激发和发射之间产生了能量损失。20一、基本原理一、基本原理2.3 2.3 荧光发射光谱的普遍特性：荧光发射光谱的普遍特性：荧光发射光谱的普遍特性：荧光发射光谱的普遍特性：（2 2）荧光发射光谱的形状与激发波长无关）荧光发射光谱的形状与激发波长无关）荧光发射光谱的形状与激发波长无关）荧光发射光谱的形状与激发波长无关分子吸收不同能量的光子可以由基态激
18、发到几个分子吸收不同能量的光子可以由基态激发到几个不同的电子不同的电子不同的电子不同的电子激发态激发态激发态激发态，而具有几个吸收带。由于较高激发态通过内转换及，而具有几个吸收带。由于较高激发态通过内转换及转动弛豫回到第一电子激发态的几率较高，远大于由高能激转动弛豫回到第一电子激发态的几率较高，远大于由高能激发态直接发射光子的速度，故在荧光发射时，不论用哪一个发态直接发射光子的速度，故在荧光发射时，不论用哪一个波长的光辐射激发，电子都波长的光辐射激发，电子都从第一电子激发态的最低振动能从第一电子激发态的最低振动能从第一电子激发态的最低振动能从第一电子激发态的最低振动能层返回到基态的各个振动能层
19、层返回到基态的各个振动能层层返回到基态的各个振动能层层返回到基态的各个振动能层，所以荧光发射光谱与激发波，所以荧光发射光谱与激发波长无关。长无关。21一、基本原理一、基本原理（3 3）镜像规则）镜像规则）镜像规则）镜像规则通常通常荧光发射光谱荧光发射光谱荧光发射光谱荧光发射光谱和它的和它的吸收光谱吸收光谱吸收光谱吸收光谱呈镜像对称关系。呈镜像对称关系。22 S0S2S1T1吸光1吸光2荧光323一、基本原理一、基本原理（3 3）镜像规则）镜像规则）镜像规则）镜像规则通常通常荧光发射光谱荧光发射光谱荧光发射光谱荧光发射光谱和它的和它的吸收光谱吸收光谱吸收光谱吸收光谱呈镜像对称关系。呈镜像对称关系
20、。吸收光谱吸收光谱吸收光谱吸收光谱是物质分子由基态激发至第一电子激发态的各振动能是物质分子由基态激发至第一电子激发态的各振动能级形成的。其形状决定于级形成的。其形状决定于第一电子激发态第一电子激发态第一电子激发态第一电子激发态中各中各 振动能级的分布振动能级的分布振动能级的分布振动能级的分布情况情况情况情况。荧光光谱荧光光谱荧光光谱荧光光谱是激发分子从第一电子激发态的最低振动能级回到基是激发分子从第一电子激发态的最低振动能级回到基态中各不同能级形成的。所以态中各不同能级形成的。所以荧光光谱的形状荧光光谱的形状荧光光谱的形状荧光光谱的形状决定于决定于基态中各基态中各基态中各基态中各振动能级的分布
21、情况振动能级的分布情况振动能级的分布情况振动能级的分布情况。24基态中振动能级的分布和第一电子激发态中振动能级的分布基态中振动能级的分布和第一电子激发态中振动能级的分布基态中振动能级的分布和第一电子激发态中振动能级的分布基态中振动能级的分布和第一电子激发态中振动能级的分布情况是类似的。情况是类似的。情况是类似的。情况是类似的。因此荧光光谱的形状和吸收光谱的形状极为因此荧光光谱的形状和吸收光谱的形状极为相似。相似。由基态最低振动能级跃迁到由基态最低振动能级跃迁到 第一电子激发态各个振动能级的第一电子激发态各个振动能级的第一电子激发态各个振动能级的第一电子激发态各个振动能级的吸收过程中，振动能级越
22、高吸收过程中，振动能级越高吸收过程中，振动能级越高吸收过程中，振动能级越高，两个能级之间的能量差越大，两个能级之间的能量差越大，即激发所需的能量越高，所以吸收峰的波长越短。反之，由即激发所需的能量越高，所以吸收峰的波长越短。反之，由 第一电子激发态的最低振动能级降落到基态各个振动能级的第一电子激发态的最低振动能级降落到基态各个振动能级的第一电子激发态的最低振动能级降落到基态各个振动能级的第一电子激发态的最低振动能级降落到基态各个振动能级的荧光发射过程中，基态振动能级越高荧光发射过程中，基态振动能级越高荧光发射过程中，基态振动能级越高荧光发射过程中，基态振动能级越高，两个能级之间的能量，两个能级
23、之间的能量差越小，荧光峰的波长越长。差越小，荧光峰的波长越长。25也可以从位能曲线解释镜像规则。由于光吸收在大约也可以从位能曲线解释镜像规则。由于光吸收在大约1010-15-15的的短时间内发生，原子核没有发生明显的位移，即电子与核之短时间内发生，原子核没有发生明显的位移，即电子与核之间的位移没有发生变化。假如在吸收过程中，基态的零振动间的位移没有发生变化。假如在吸收过程中，基态的零振动能级与激发态的第二振动能级之间的能级与激发态的第二振动能级之间的跃迁几率跃迁几率跃迁几率跃迁几率最大，那么，最大，那么，在荧光发射过程中，其相反在荧光发射过程中，其相反跃迁的几率跃迁的几率跃迁的几率跃迁的几率也
24、应该最大。也就是也应该最大。也就是说，吸收和发射的能量都最大。说，吸收和发射的能量都最大。26一、基本原理一、基本原理（三）荧光和分子结构的关系（三）荧光和分子结构的关系（三）荧光和分子结构的关系（三）荧光和分子结构的关系分子产生荧光必须具备两个条件：分子产生荧光必须具备两个条件：分子产生荧光必须具备两个条件：分子产生荧光必须具备两个条件：分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构，才分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构，才 能吸收激发光；能吸收激发光；吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，必须具有吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，必须具有 一定的荧光量子产率。一定的荧光量子产率。2
25、7一、基本原理一、基本原理1.1.量子产率量子产率量子产率量子产率荧光量子产率也叫荧光效率或量子效率，它荧光量子产率也叫荧光效率或量子效率，它表示物质发射荧表示物质发射荧表示物质发射荧表示物质发射荧光的能力光的能力光的能力光的能力，通常用下式表示，通常用下式表示 =发射荧光分子数发射荧光分子数/激发分子总数激发分子总数 或或 =发射荧光量子数发射荧光量子数/吸收光量子数吸收光量子数 在产生荧光的过程中，涉及到许多在产生荧光的过程中，涉及到许多辐射辐射辐射辐射和和无辐射跃迁无辐射跃迁无辐射跃迁无辐射跃迁过程，过程，如荧光发射、内转移，系间窜跃和外转移等。很明显，荧光如荧光发射、内转移，系间窜跃和
26、外转移等。很明显，荧光的量子产率，将与上述每一个过程的速率常数有关。的量子产率，将与上述每一个过程的速率常数有关。28若用数学式来表达这些关系，得到若用数学式来表达这些关系，得到 =k kf f /（k kf f+k ki i）K Kf f 为为荧光发射荧光发射荧光发射荧光发射过程的过程的速率常数速率常数速率常数速率常数，k ki i 为为其它有关过程的速率其它有关过程的速率常数的总和常数的总和。凡是能使凡是能使凡是能使凡是能使k kf f 值升高而使其它值升高而使其它值升高而使其它值升高而使其它k ki i 值降低的因素，都可增强荧值降低的因素，都可增强荧值降低的因素，都可增强荧值降低的因素
27、，都可增强荧光。光。光。光。29 实际上，对于高荧光分子，例如荧光素，其量子产率在实际上，对于高荧光分子，例如荧光素，其量子产率在某些情况下接近某些情况下接近1 1，说明，说明 k ki i 很小，可以忽略不计。一般来很小，可以忽略不计。一般来说，说，k kf f 主要取决于化学结构，而主要取决于化学结构，而 k ki i 则主要取决于化学环境，则主要取决于化学环境，同时也与化学结构有关。同时也与化学结构有关。磷光的量子产率与此类似磷光的量子产率与此类似30一、基本原理一、基本原理2.2.荧光与有机化合物的结构荧光与有机化合物的结构荧光与有机化合物的结构荧光与有机化合物的结构（1 1）跃迁类型
28、）跃迁类型）跃迁类型）跃迁类型 跃迁是产生荧光的主要跃迁类型跃迁是产生荧光的主要跃迁类型跃迁是产生荧光的主要跃迁类型跃迁是产生荧光的主要跃迁类型31一、基本原理一、基本原理激发：激发：或或n n（非键电子轨道）非键电子轨道）发射：发射：或或 n n跃迁跃迁 跃迁具有较大的摩尔吸光系数（一般比跃迁具有较大的摩尔吸光系数（一般比 n n 大大100-1000100-1000倍）倍）跃迁的寿命约为跃迁的寿命约为1010-7-71010-9-9s s，比比n n 跃跃 迁的寿命迁的寿命1010-5-51010-7-7s s 跃迁过程中，通过系间窜跃至三重态的跃迁过程中，通过系间窜跃至三重态的 速率常数
29、也较小（速率常数也较小（S S1 1T T1 1能级差较大）能级差较大）32一、基本原理一、基本原理（2 2）共轭效应）共轭效应）共轭效应）共轭效应 容易实现容易实现 激发激发 的芳香族化合物容易发生荧光，能发生的芳香族化合物容易发生荧光，能发生荧光的脂肪族和脂环族化合物极少（仅少数高度共轭体系化荧光的脂肪族和脂环族化合物极少（仅少数高度共轭体系化合物除外）合物除外）增加体系的共轭度增加体系的共轭度增加体系的共轭度增加体系的共轭度，荧光效率一般也将增大荧光效率一般也将增大荧光效率一般也将增大荧光效率一般也将增大。例如，在多烯。例如，在多烯结构中，结构中，phph（CH=CHCH=CH）3 3
30、ph ph和和phph（CH=CHCH=CH）2 2 ph ph在苯中的荧在苯中的荧光效率分别为光效率分别为0.680.68和和0.280.28。33一、基本原理一、基本原理共轭效应使荧光增强的原因共轭效应使荧光增强的原因共轭效应使荧光增强的原因共轭效应使荧光增强的原因 ：主要是由于增大荧光物质的摩尔吸光系数，有利于产生更多主要是由于增大荧光物质的摩尔吸光系数，有利于产生更多的激发态分子，从而有利于荧光的发生。的激发态分子，从而有利于荧光的发生。34一、基本原理一、基本原理(3)(3)(3)(3)刚性平面结构刚性平面结构刚性平面结构刚性平面结构多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光。多数
31、具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光。这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其它溶质分这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其它溶质分这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其它溶质分这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减少，也就减少了碰撞去活的可能性。子的相互作用减少，也就减少了碰撞去活的可能性。子的相互作用减少，也就减少了碰撞去活的可能性。子的相互作用减少，也就减少了碰撞去活的可能性。35一、基本原理一、基本原理（4 4）取代基效应）取代基效应）取代基效应）取代基效应 芳香族化合物苯环上的不同取代基对该化合物的荧光强度和芳香族化合物苯环上的不同取代
32、基对该化合物的荧光强度和荧光光谱有很大的影响。荧光光谱有很大的影响。36一、基本原理一、基本原理 给电子基团给电子基团给电子基团给电子基团，如，如-OHOH、-OR-OR、-CN-CN、-NHNH2 2 、-NR-NR2 2等，使荧光增强等，使荧光增强 产生了产生了p-p-共轭作用，增强了共轭作用，增强了 电子共轭程度，使最低激发单电子共轭程度，使最低激发单 重态与基态之间的跃迁几率增大。重态与基态之间的跃迁几率增大。吸电子基团吸电子基团吸电子基团吸电子基团，如，如-COOHCOOH、-NO-NO、-C-C O O、卤素等，会减弱甚至会卤素等，会减弱甚至会 猝猝灭荧光。灭荧光。37一、基本原理
33、一、基本原理 卤素取代基随原子序数的增加而荧光降低卤素取代基随原子序数的增加而荧光降低卤素取代基随原子序数的增加而荧光降低卤素取代基随原子序数的增加而荧光降低“重原子效应重原子效应重原子效应重原子效应”使系间跨越速率增加使系间跨越速率增加使系间跨越速率增加使系间跨越速率增加（在重原子中，能级之间的交叉现象比较严重，因此容易发生自旋轨道（在重原子中，能级之间的交叉现象比较严重，因此容易发生自旋轨道（在重原子中，能级之间的交叉现象比较严重，因此容易发生自旋轨道（在重原子中，能级之间的交叉现象比较严重，因此容易发生自旋轨道的相互作用，增加了由单重态转化为三重态的速率）的相互作用，增加了由单重态转化为
34、三重态的速率）的相互作用，增加了由单重态转化为三重态的速率）的相互作用，增加了由单重态转化为三重态的速率）取代基的空间障碍对荧光也有影响取代基的空间障碍对荧光也有影响取代基的空间障碍对荧光也有影响取代基的空间障碍对荧光也有影响 立体异构现象对荧光强度有显著的影响立体异构现象对荧光强度有显著的影响立体异构现象对荧光强度有显著的影响立体异构现象对荧光强度有显著的影响38一、基本原理一、基本原理3.3.金属螯合物的荧光金属螯合物的荧光金属螯合物的荧光金属螯合物的荧光除过渡元素的顺磁性原子会发生线状荧光光谱外，大多数无除过渡元素的顺磁性原子会发生线状荧光光谱外，大多数无机盐类金属离子，在溶液中只能发生
35、无辐射跃迁，因而不产机盐类金属离子，在溶液中只能发生无辐射跃迁，因而不产生荧光。但是，在某些情况下，金属螯合物却能产生很强的生荧光。但是，在某些情况下，金属螯合物却能产生很强的荧光，并可用于痕量金属元素分析。荧光，并可用于痕量金属元素分析。39一、基本原理一、基本原理（1 1）螯合物中配位体的发光）螯合物中配位体的发光）螯合物中配位体的发光）螯合物中配位体的发光不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性结构，不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性结构，分子处于非同一平面，因而不发生荧光。若这些化合物和金分子处于非同一平面，因而不发生荧光。若这些化合物和金属离子形成螯合物，随着分子的
36、刚性增强，平面结构的增大，属离子形成螯合物，随着分子的刚性增强，平面结构的增大，常会发生荧光。常会发生荧光。如如8-8-羟基喹啉本身有很弱的荧光，但羟基喹啉本身有很弱的荧光，但其金属螯合物具有很强的荧光其金属螯合物具有很强的荧光40一、基本原理一、基本原理（2 2）螯合物中金属离子的特征荧光）螯合物中金属离子的特征荧光）螯合物中金属离子的特征荧光）螯合物中金属离子的特征荧光这类发光过程通常是螯合物首先通过配位体的这类发光过程通常是螯合物首先通过配位体的 跃迁激发，跃迁激发，接着配位体把能量转给金属离子，导致接着配位体把能量转给金属离子，导致d dd d 跃迁和跃迁和f ff f 跃迁，跃迁，最
37、终发射的是最终发射的是d*d*d d跃迁和跃迁和f*f*f f 跃迁光谱。跃迁光谱。41一、基本原理一、基本原理（四）溶液的荧光（或磷光）强度（四）溶液的荧光（或磷光）强度（四）溶液的荧光（或磷光）强度（四）溶液的荧光（或磷光）强度（1 1）荧光强度与溶液浓度的关系荧光强度与溶液浓度的关系荧光强度与溶液浓度的关系荧光强度与溶液浓度的关系 荧光强度荧光强度I If f 正比于吸收的光量正比于吸收的光量I Ia a与荧光量子产率与荧光量子产率 I If f =I Ia a式中式中 为荧光量子效率，又根据为荧光量子效率，又根据BeerBeer定律定律 I Ia a=I=I0 0-I-It t=I=I
38、0 0(1-e(1-e-l l C C)I I0 0和和I It t分别是入射光强度和透射光强度。代入上式得分别是入射光强度和透射光强度。代入上式得 I If f=I I0 0(1-10(1-10-l l c c)=)=I I0 0(1-e(1-e-2.3-2.3 l c l c)42在极稀的溶液中，在极稀的溶液中，当当当当 l l l lc c 0.050.050.050.05时时时时 I If f =2.3=2.3 I I0 0 l lc c当入射光强度当入射光强度当入射光强度当入射光强度I I0 0 和和和和l l l l一定时一定时一定时一定时，上式为：，上式为：I If f =K=K
39、 c c 较浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，较浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，使荧光强度和浓度不呈线性关系使荧光强度和浓度不呈线性关系43一、基本原理一、基本原理（2 2）影响荧光强度的因素）影响荧光强度的因素）影响荧光强度的因素）影响荧光强度的因素 溶剂溶剂溶剂溶剂对荧光强度的影响对荧光强度的影响对荧光强度的影响对荧光强度的影响 溶剂的折射率和介电常数的影响。溶剂的折射率和介电常数的影响。荧光体和溶剂分子间的特殊化学作用荧光体和溶剂分子间的特殊化学作用如氢键的生成和化合作用如氢键的生成和化合作用一般溶剂效应一般溶剂效应一般溶剂效应一般溶剂效应特殊溶剂效应特殊溶剂效应特殊溶剂效应特殊溶
40、剂效应44一般溶剂效应是普遍的，而特殊溶剂效应则决定于溶剂和荧一般溶剂效应是普遍的，而特殊溶剂效应则决定于溶剂和荧光体的化学结构光体的化学结构特殊溶剂效应所引起荧光光谱的移动值，往往大于一般溶剂特殊溶剂效应所引起荧光光谱的移动值，往往大于一般溶剂效应所引起的影响。由于溶质分子与溶剂分子间的作用，效应所引起的影响。由于溶质分子与溶剂分子间的作用，使同一种荧光物质在不同的溶剂中的荧光光谱使同一种荧光物质在不同的溶剂中的荧光光谱可能会有显著不同可能会有显著不同45增大溶剂的极性，将使增大溶剂的极性，将使n n 跃迁的能量增大，跃迁的能量增大，跃迁的跃迁的能量减小，而导致荧光增强，荧光峰红移能量减小，
41、而导致荧光增强，荧光峰红移苯胺萘磺酸类化合物在戊醇、丁醇、丙醇、乙醇和甲醇中，苯胺萘磺酸类化合物在戊醇、丁醇、丙醇、乙醇和甲醇中，随着醇的极性增大，荧光强度减小，荧光峰蓝移随着醇的极性增大，荧光强度减小，荧光峰蓝移荧光光谱的位置和强度与溶剂极性之间的荧光光谱的位置和强度与溶剂极性之间的关系，应根据荧光物质与溶剂的不同而异关系，应根据荧光物质与溶剂的不同而异46一、基本原理一、基本原理 温度对荧光强度的影响温度对荧光强度的影响温度对荧光强度的影响温度对荧光强度的影响温度上升使荧光强度下降温度上升使荧光强度下降1 1.分子内部能量转化作用分子内部能量转化作用分子内部能量转化作用分子内部能量转化作用
42、2 2.碰撞频率增加碰撞频率增加碰撞频率增加碰撞频率增加，使外转换的去活几率增加。，使外转换的去活几率增加。47一、基本原理一、基本原理 溶液溶液溶液溶液pHpH值对荧光强度的影响值对荧光强度的影响值对荧光强度的影响值对荧光强度的影响带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的荧光与溶液带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的荧光与溶液的的pHpH有关。不同的有关。不同的pHpH值，化合物所处状态不同，不同的化值，化合物所处状态不同，不同的化合物或化合物的分子与其离子在电子构型上有所不同，因此，合物或化合物的分子与其离子在电子构型上有所不同，因此，它们的荧光强度和荧光光谱就有一定的差别它们的荧
43、光强度和荧光光谱就有一定的差别48一、基本原理一、基本原理对于金属离子与有机试剂形成的发光鏊合物，一方面对于金属离子与有机试剂形成的发光鏊合物，一方面pHpH会影会影响鏊合物的形成，另一方面还会影响鏊合物的组成，因而影响鏊合物的形成，另一方面还会影响鏊合物的组成，因而影响它们的荧光性质。响它们的荧光性质。49一、基本原理一、基本原理 内滤光作用和自吸收现象内滤光作用和自吸收现象内滤光作用和自吸收现象内滤光作用和自吸收现象溶液中若存在能吸收激发或荧光物质所发射光能的物质，就溶液中若存在能吸收激发或荧光物质所发射光能的物质，就溶液中若存在能吸收激发或荧光物质所发射光能的物质，就溶液中若存在能吸收激
44、发或荧光物质所发射光能的物质，就会使荧光减弱，这种现象称为会使荧光减弱，这种现象称为会使荧光减弱，这种现象称为会使荧光减弱，这种现象称为“内滤光作用内滤光作用内滤光作用内滤光作用”。内滤光作用的另一种情况是荧光物质的荧光发射光的短波长内滤光作用的另一种情况是荧光物质的荧光发射光的短波长的一端与该物质的吸收光谱的长波长一端有重叠。的一端与该物质的吸收光谱的长波长一端有重叠。在溶液浓度较大时，一部分荧光发射被自身吸收，产生在溶液浓度较大时，一部分荧光发射被自身吸收，产生“自自吸收吸收”现象而降低了溶液的荧光强度。现象而降低了溶液的荧光强度。50一、基本原理一、基本原理（3 3）溶液荧光猝灭）溶液荧
45、光猝灭）溶液荧光猝灭）溶液荧光猝灭荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用引起荧荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用引起荧荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用引起荧荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象称为光强度降低的现象称为光强度降低的现象称为光强度降低的现象称为荧光猝灭荧光猝灭荧光猝灭荧光猝灭能引起荧光强度降低的物质称为猝灭剂能引起荧光强度降低的物质称为猝灭剂51一、基本原理一、基本原理导致荧光猝灭的主要类型：导致荧光猝灭的主要类型：碰撞猝灭碰撞猝灭碰撞猝灭碰撞猝灭碰撞猝灭碰撞猝灭碰撞猝灭碰撞猝灭是指处于激发单重态的荧光分子与猝灭剂分
46、子相碰是指处于激发单重态的荧光分子与猝灭剂分子相碰撞，使激发单重态的荧光分子以无辐射跃迁的方式回到基态，撞，使激发单重态的荧光分子以无辐射跃迁的方式回到基态，产生猝灭作用。产生猝灭作用。52一、基本原理一、基本原理 静态猝灭（组成化合物的猝灭）静态猝灭（组成化合物的猝灭）静态猝灭（组成化合物的猝灭）静态猝灭（组成化合物的猝灭）由于部分荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧光的配由于部分荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧光的配合物而产生的。此过程往往还会引起溶液吸收光谱的改变。合物而产生的。此过程往往还会引起溶液吸收光谱的改变。转入三重态的猝灭转入三重态的猝灭转入三重态的猝灭转入三重态的猝灭 分子由于系
47、间的跨越跃迁，由单重态跃迁到三重态。分子由于系间的跨越跃迁，由单重态跃迁到三重态。转入三重态的分子在常温下不发光，它们在与其它分子的碰转入三重态的分子在常温下不发光，它们在与其它分子的碰撞中消耗能量而使荧光猝灭。撞中消耗能量而使荧光猝灭。溶液中的溶解氧对有机化合物的荧光产生猝灭效应是溶液中的溶解氧对有机化合物的荧光产生猝灭效应是53一、基本原理一、基本原理由于三重态基态的氧分子和单重激发态的荧光物质分子碰撞，由于三重态基态的氧分子和单重激发态的荧光物质分子碰撞，形成了单重激发态的氧分子和三重态的荧光物质分子，使荧形成了单重激发态的氧分子和三重态的荧光物质分子，使荧光猝灭。光猝灭。发生电子转移反
48、应的猝灭发生电子转移反应的猝灭发生电子转移反应的猝灭发生电子转移反应的猝灭 某些猝灭剂分子与荧光物质分子相互作用时，发生了某些猝灭剂分子与荧光物质分子相互作用时，发生了电子转移反应，因而引起荧光猝灭。电子转移反应，因而引起荧光猝灭。荧光物质的自猝灭荧光物质的自猝灭荧光物质的自猝灭荧光物质的自猝灭 在浓度较高的荧光物质溶液中，单重激发态的分子在在浓度较高的荧光物质溶液中，单重激发态的分子在发生荧光之前和未激发的荧光物质分子碰撞而引起的自猝灭。发生荧光之前和未激发的荧光物质分子碰撞而引起的自猝灭。有些荧光物质分子在溶液浓度较高时会形成二聚体或有些荧光物质分子在溶液浓度较高时会形成二聚体或54一、基
49、本原理一、基本原理多聚体，使它们的吸收光谱发生变化，也引起溶液荧光强度的降低或消失。55二、荧光分析仪二、荧光分析仪由激发光源、样品池、用于选择激发光波长和荧光波长的单色器以及检测器四部分组成56二、荧光分析仪二、荧光分析仪（1 1）激发光源）激发光源）激发光源）激发光源在紫外在紫外-可见区范围，通常的光源是氙灯和高压汞灯可见区范围，通常的光源是氙灯和高压汞灯（2 2）样品池）样品池）样品池）样品池荧光用的样品池须用低荧光的材料制成，通常用石英，形状荧光用的样品池须用低荧光的材料制成，通常用石英，形状以方形和长方形为宜以方形和长方形为宜57二、荧光分析仪二、荧光分析仪（3）单色器）单色器 光栅
50、（4）检测器）检测器由光电管和光电倍曾管作检测器，并与激发光成直角58三、分子荧光分析法及其应用1.荧光分析方法的特点（1）灵敏度高 （2）选择性强（3）试样量少，方法简单 （4）提供比较多的物理参数59三、分子荧光分析法及其应用弱点弱点应用范围小。因为本身能发荧光的物质相对较少，用加入某应用范围小。因为本身能发荧光的物质相对较少，用加入某种试剂的方法将非荧光物质转化为荧光物质进行分析，其数种试剂的方法将非荧光物质转化为荧光物质进行分析，其数量也不多；另一方面，由于荧光分析的灵敏度高，测定对环量也不多；另一方面，由于荧光分析的灵敏度高，测定对环境因素敏感，干扰因素较多。境因素敏感，干扰因素较多