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1、第七章第七章 酶的分子工程酶的分子工程之二：之二：酶蛋白的化学修饰酶蛋白的化学修饰酶修饰的方向酶修饰的方向l1 1 核酸水平核酸水平l2 2 蛋白质水平蛋白质水平本章主要介绍第二个部分本章主要介绍第二个部分一、酶蛋白的化学修饰一、酶蛋白的化学修饰 酶的化学修饰主要是利用修饰剂所具有的酶的化学修饰主要是利用修饰剂所具有的各类化学基团的特性，直接或经一定的活化步各类化学基团的特性，直接或经一定的活化步骤后与酶分子上的某种氨基酸残基产生化学反骤后与酶分子上的某种氨基酸残基产生化学反应，从而改造酶分子的结构与功能。应，从而改造酶分子的结构与功能。二、酶的分子修饰的目的：二、酶的分子修饰的目的：l1.1
2、.研究酶的结构与功能研究酶的结构与功能l2.2.增强酶天然构象的稳定性与耐热性增强酶天然构象的稳定性与耐热性l3.3.维持酶结构功能的完整性与抗蛋白水解酶维持酶结构功能的完整性与抗蛋白水解酶l4.4.消除酶的抗原性及稳定酶的微环境消除酶的抗原性及稳定酶的微环境SODSOD：l对普通非活性部位赖氨酸中对普通非活性部位赖氨酸中氨基的修饰氨基的修饰l在保留原有的生物活性，稳定性增强、在体内半衰期在保留原有的生物活性，稳定性增强、在体内半衰期长，由长，由6min-15min,6min-15min,延长到延长到15hr15hr以上。以上。lSODSOD的化学修饰可以增强的化学修饰可以增强SODSOD构象
3、的稳定性、抗蛋白水构象的稳定性、抗蛋白水解酶的能力及消除对人体的免疫原性。真正能够产生解酶的能力及消除对人体的免疫原性。真正能够产生抗氧化、抗衰老、抗辐射、抗炎、祛班美容等功效。抗氧化、抗衰老、抗辐射、抗炎、祛班美容等功效。具体说来，如：具体说来，如：提高酶活力提高酶活力改进酶的稳定性改进酶的稳定性允许酶在一个变化的环境中起作用允许酶在一个变化的环境中起作用改变最适改变最适pHpH值或最适温度值或最适温度改改变变酶酶的的特特异异性性；使使它它能能催催化化不不同同的的底底物物，使使之之转转化化为产物为产物改变催化反应的类型改变催化反应的类型提高催化过程的反应效率提高催化过程的反应效率 等等等等三
4、、影响蛋白质化学修饰反应进程的因素三、影响蛋白质化学修饰反应进程的因素 （一）影响蛋白质功能基反应性的因素（一）影响蛋白质功能基反应性的因素l微区的极性微区的极性l氢键效应氢键效应l静电效应静电效应l位阻效应位阻效应l蛋白质功能基的超反应性蛋白质功能基的超反应性（二）修饰剂反应性的决定因素（二）修饰剂反应性的决定因素l选择吸附选择吸附l静电相互作用静电相互作用l位阻因素位阻因素l催化因素催化因素l局部环境的极性局部环境的极性四、设计酶的化学修饰四、设计酶的化学修饰（一）对酶性质的了解（一）对酶性质的了解l酶的活性中心酶的活性中心l酶的稳定条件酶的稳定条件l最佳反应条件最佳反应条件l酶的侧链基团
5、的性质酶的侧链基团的性质l等等等等（二）修饰剂的选择（二）修饰剂的选择l实际要根据修饰实际要根据修饰目的目的来选择来选择：1 1）：如：对氨基的修饰可有几种情况：）：如：对氨基的修饰可有几种情况：修饰所有氨基，而不修饰其它基团；修饰所有氨基，而不修饰其它基团；仅修饰仅修饰-氨基；氨基；修饰暴露的或反应性高的氨基以及修饰具有催化活性的氨基等。修饰暴露的或反应性高的氨基以及修饰具有催化活性的氨基等。修饰的部位和程度一般可用选择适当的试剂和反应条修饰的部位和程度一般可用选择适当的试剂和反应条件来控制。件来控制。1.选择修饰剂要考虑的问题选择修饰剂要考虑的问题2 2）：如果修饰目的是希望改变蛋白质的带
6、电状）：如果修饰目的是希望改变蛋白质的带电状态或溶解性，则必须选择能引入最大电荷量的态或溶解性，则必须选择能引入最大电荷量的试剂。试剂。用顺丁烯二酸酐可将中性的巯基和酸性用顺丁烯二酸酐可将中性的巯基和酸性pHpH下带正电下带正电荷的氨基转变成在中性荷的氨基转变成在中性pHpH下带负电的衍生物。下带负电的衍生物。l3 3）：如果要修饰的蛋白质对有机溶剂不稳定，）：如果要修饰的蛋白质对有机溶剂不稳定，必须在水介质中进行反应，则试剂应选择在必须在水介质中进行反应，则试剂应选择在水中有一定溶解性的。水中有一定溶解性的。4 4）.在选择试剂时，还必须考虑反应生成物容易在选择试剂时，还必须考虑反应生成物容
7、易进行定量测定。进行定量测定。如果引入的基团有特殊的光吸收如果引入的基团有特殊的光吸收用同位素标记用同位素标记。5 5）.试剂体积过大，往往由于空间障碍而不能与试剂体积过大，往往由于空间障碍而不能与作用的基团接近。作用的基团接近。一般来说，试剂的体积小一些为宜，这样既能保证一般来说，试剂的体积小一些为宜，这样既能保证修饰反应顺利进行，又可减少因空间障碍而破坏蛋修饰反应顺利进行，又可减少因空间障碍而破坏蛋白质分子严密结构的危险。白质分子严密结构的危险。选择修饰剂是个综合权衡的过程：选择修饰剂是个综合权衡的过程：l修饰反应要完成到什么程度；修饰反应要完成到什么程度；l对个别氨基酸残基是否专一；对个
8、别氨基酸残基是否专一；l在反应条件下，修饰反应有没有限度；在反应条件下，修饰反应有没有限度；l修饰后蛋白质的构象是否基本保持不变；修饰后蛋白质的构象是否基本保持不变；l是否需要分离修饰后的衍生物；是否需要分离修饰后的衍生物；l反应是否需要可逆；反应是否需要可逆；l是否适合于建立快速、方便的分析方法是否适合于建立快速、方便的分析方法l等等等等 就修饰剂本身而言：就修饰剂本身而言：l修饰剂自身的性质：修饰剂自身的性质：修饰剂的分子量、修饰剂链的长度对蛋白的吸附性修饰剂的分子量、修饰剂链的长度对蛋白的吸附性修饰剂反应基团的数目和位置修饰剂反应基团的数目和位置修饰剂上反应基团的活化方法与条件修饰剂上反
9、应基团的活化方法与条件l一般而言：一般而言：要求修饰剂有较大的分子量、良好要求修饰剂有较大的分子量、良好的生物相容性和水溶性、修饰剂分子表面有较的生物相容性和水溶性、修饰剂分子表面有较多的反应活性基团及修饰后酶活的半衰期较长多的反应活性基团及修饰后酶活的半衰期较长2.2.用于用于修饰酶活性中心的氨基酸残基的试剂修饰酶活性中心的氨基酸残基的试剂应具应具备以下备以下些特征：些特征：l选择性地与一个氨基酸残基反应；选择性地与一个氨基酸残基反应；l反应在酶蛋白不变性的条件下进行；反应在酶蛋白不变性的条件下进行；l标记的残基在肽中稳定，很易通过降解分离出来，进标记的残基在肽中稳定，很易通过降解分离出来，
10、进行鉴定；行鉴定；l反应的程度能用简单的技术测定。反应的程度能用简单的技术测定。l当然，不是单独一种试剂就能满足所有这些条件。一当然，不是单独一种试剂就能满足所有这些条件。一种试剂可能在某一方面比其它试剂优越，而在另种试剂可能在某一方面比其它试剂优越，而在另方方面则较差。因此，必须根据实验目的和特定的样品来面则较差。因此，必须根据实验目的和特定的样品来决定使用什么样的试剂。决定使用什么样的试剂。(三）反应条件的选择三）反应条件的选择l除允许修饰能顺利进行外，还必须满足如下要求：除允许修饰能顺利进行外，还必须满足如下要求：一是不造成蛋白质的不可逆变性。（必须做对照试验）一是不造成蛋白质的不可逆变
11、性。（必须做对照试验）二是有利于专一性修饰蛋白质。二是有利于专一性修饰蛋白质。l为此，反应条件应尽可能在保证蛋白质特定空间构象为此，反应条件应尽可能在保证蛋白质特定空间构象不变或少变的情况下进行。不变或少变的情况下进行。l要考虑反应的温度、要考虑反应的温度、pHpH、反应介质和缓冲液组成、反应介质和缓冲液组成缓冲液可改变蛋白质的构象或封闭反应部位，因而影响修饰缓冲液可改变蛋白质的构象或封闭反应部位，因而影响修饰反应，如，磷酸盐是某些酶的竞争性抑制剂，碳酸酐酶的酯反应，如，磷酸盐是某些酶的竞争性抑制剂，碳酸酐酶的酯酶活力能被氯离子抑制酶活力能被氯离子抑制反应基本条件反应基本条件l1.1.反应体系
12、中酶与修饰剂的分子比例反应体系中酶与修饰剂的分子比例l2.2.反应体系的溶剂性质、盐浓度和反应体系的溶剂性质、盐浓度和pHpH条件条件l3.3.反应温度和时间反应温度和时间以上条件随修饰类型不同有很大差异，需做大以上条件随修饰类型不同有很大差异，需做大量实验验证确定量实验验证确定（四）反应的专一性（四）反应的专一性l在蛋白质化学修饰研究中，反应的专一性非常在蛋白质化学修饰研究中，反应的专一性非常重要。若修饰剂专一性较差，除控制反应条件重要。若修饰剂专一性较差，除控制反应条件外，还可利用其它途径来实现修饰的专一性。外，还可利用其它途径来实现修饰的专一性。1 1利用蛋白质分子中某些基团的特殊性利用
13、蛋白质分子中某些基团的特殊性 l活性蛋白质特殊的空间结构能影响某些基团的活性。活性蛋白质特殊的空间结构能影响某些基团的活性。同样条件下，二异丙基氟磷酸酯（同样条件下，二异丙基氟磷酸酯（DFPDFP）能能与与胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶的的SerSer作用，迅速使酶失活作用，迅速使酶失活不能不能与与胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶原及一些简单的模拟化合物作用。及一些简单的模拟化合物作用。F在蛋白质分子中特别活泼的基团，在适当条件下只是在蛋白质分子中特别活泼的基团，在适当条件下只是其本身发生作用，而其它基团皆不作用，这种现象称其本身发生作用，而其它基团皆不作用，这种现象称为为“位置专一性位置专一性”，这是由
14、于它在蛋白质分子中所处，这是由于它在蛋白质分子中所处的位置环境所决定的的位置环境所决定的 2 2选择不同的反应选择不同的反应pH pH l蛋白质分子中各功能基的解离常数蛋白质分子中各功能基的解离常数(pKa)(pKa)是不是不同的。同的。l所以控制不同的反应所以控制不同的反应pHpH，也就控制了各功能基，也就控制了各功能基的解离程度，从而有利于修饰的专一性的解离程度，从而有利于修饰的专一性 l如：用溴如：用溴(碘碘)代乙酸代乙酸(或它的酰胺或它的酰胺)对蛋白质进行修饰时，对蛋白质进行修饰时，试剂在不同试剂在不同pHpH条件下可与半胱氨酸、甲硫氨酸、组氨酸的条件下可与半胱氨酸、甲硫氨酸、组氨酸的
15、侧链及侧链及-氨基、氨基、-氨基发生作用。氨基发生作用。pH pH ICH2COOICH2COO-+蛋白质蛋白质-SH -SH 蛋白质蛋白质-S-CH2COO-S-CH2COO-+H+H+I+I-pH pH 2 2 ICH2COO-+ICH2COO-+蛋白质蛋白质-SCH3 -SCH3 蛋白质蛋白质-S(CH3)CH2COO-S(CH3)CH2COO-+I+I-pHpH8.58.5ICH2COO-+ICH2COO-+蛋白质蛋白质-NH2-NH2 蛋白质蛋白质-NH-CH2COO-NH-CH2COO-+H+H+I+I-pHpH5.55.5ICH2COO-+ICH2COO-+蛋白质蛋白质咪唑基咪唑
16、基-NH -NH 蛋白质蛋白质-咪唑基咪唑基-N-CH2COO-N-CH2COO-3 3利用某些产物的不稳定性利用某些产物的不稳定性 在高在高pHpH下：下：氰酸、二硫化碳、氰酸、二硫化碳、O-O-甲基异脲和亚氨酸等甲基异脲和亚氨酸等l氨基氨基 脲和胍的衍生物。脲和胍的衍生物。l虽然巯基也能与上述试剂作用，但因虽然巯基也能与上述试剂作用，但因pHpH高，与高，与巯基形成的产物迅速被分解巯基形成的产物迅速被分解 4 4亲和标记亲和标记 l亲和标记是实现专一性修饰的重要途径。亲和标记是实现专一性修饰的重要途径。l亲和标记试剂除了能与蛋白质作用外，还要求试剂的亲和标记试剂除了能与蛋白质作用外，还要求
17、试剂的结构和与蛋白质作用的底物或抑制剂相似。结构和与蛋白质作用的底物或抑制剂相似。l在作用前，试剂先以非共价形式结合到蛋白质的活性在作用前，试剂先以非共价形式结合到蛋白质的活性部位上，然后再发生化学作用，将试剂挂在活性部位部位上，然后再发生化学作用，将试剂挂在活性部位基团上。基团上。l例如，对甲基苯磺酰氯能作用于胰凝乳蛋白酶的活性例如，对甲基苯磺酰氯能作用于胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸上丝氨酸上 又如：又如：TPCKTPCK对胰凝乳蛋白酶活性中心组氨酸咪唑环的亲和标记对胰凝乳蛋白酶活性中心组氨酸咪唑环的亲和标记 5 5差别标记差别标记 l在底物或抑制剂存在下进行化学修饰时，由于它们保在底物或抑制剂
18、存在下进行化学修饰时，由于它们保护着蛋白质的活性部位基团，使这些基团不能与试剂护着蛋白质的活性部位基团，使这些基团不能与试剂作用。然后将底物或抑制剂除去，所得到的部分修饰作用。然后将底物或抑制剂除去，所得到的部分修饰的蛋白质再与含同位素标记的同样试剂作用，结果只的蛋白质再与含同位素标记的同样试剂作用，结果只有原来被底物或抑制剂保护的基团是带放射性同位素有原来被底物或抑制剂保护的基团是带放射性同位素标记的。标记的。l用这一方法可直接得到蛋白质发挥功能作用的必需基用这一方法可直接得到蛋白质发挥功能作用的必需基团。团。6 6利用蛋白质状态的差异利用蛋白质状态的差异 l有时在结晶状态下进行反应，可以提
19、高修饰的专有时在结晶状态下进行反应，可以提高修饰的专一性。例如，一性。例如，核糖核酸酶在晶体状态下进行羧甲基化时，反应主要核糖核酸酶在晶体状态下进行羧甲基化时，反应主要集中在集中在119119号号HisHis上，对第上，对第1212号号HisHis的修饰很少，两者的修饰很少，两者之比为之比为6060：1 1。但在水溶液中进行同样的修饰时，两。但在水溶液中进行同样的修饰时，两者之比为者之比为15:115:1，换言之，在晶体状态下羧甲基化反应的专一性比溶液换言之，在晶体状态下羧甲基化反应的专一性比溶液状态下提高状态下提高3 3倍倍 目前采用的方法：目前采用的方法：对酶蛋白的非活性主链进行部分水解；
20、对酶蛋白的非活性主链进行部分水解；利用小分子或大分子物质对酶的活性部位或非活性部利用小分子或大分子物质对酶的活性部位或非活性部位的侧链基团进行化学修饰；位的侧链基团进行化学修饰；对酶辅因子的置换而力图改变酶的反应类型对酶辅因子的置换而力图改变酶的反应类型等等等等五、酶分子的化学修饰五、酶分子的化学修饰（一）酶的表面修饰（一）酶的表面修饰l1.1.化学固定化：化学固定化：一般是直接通过酶表面的氨基酸残基将酶分子一般是直接通过酶表面的氨基酸残基将酶分子共价连接到惰性载体上；共价连接到惰性载体上；由于载体的引入，使酶所处的微环境发生改变，由于载体的引入，使酶所处的微环境发生改变，进而改变了酶的性质，
21、特别是动力学性质发生进而改变了酶的性质，特别是动力学性质发生了改变。了改变。l2.2.酶的小分子修饰作用酶的小分子修饰作用：主要是利用一些小分子修饰试剂，通过共价结合来主要是利用一些小分子修饰试剂，通过共价结合来修饰酶的一些基团（如修饰酶的一些基团（如-COO-COO-、-NH3+-NH3+、-SH-SH、-OH-OH、咪唑基等），提高酶的稳定性。咪唑基等），提高酶的稳定性。常用的小分子修饰试剂有乙基、糖基和甲基等。常用的小分子修饰试剂有乙基、糖基和甲基等。几种重要的修饰反应几种重要的修饰反应l1 1酰化及其相关反应酰化及其相关反应2 2烷基化反应烷基化反应 3 3氧化和还原反应氧化和还原反应
22、 4 4芳香环取代反应芳香环取代反应 附：特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰附：特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰 1巯基的化学修饰巯基的化学修饰常用：烷基化剂、酰化基、马常用：烷基化剂、酰化基、马来酰亚胺来酰亚胺2 2氨基的化学修饰氨基的化学修饰 3 3羧基的化学修饰羧基的化学修饰 4 4咪唑基的化学修饰咪唑基的化学修饰 5 5胍基的化学修饰胍基的化学修饰 3.3.酶的大分子修饰作用：酶的大分子修饰作用：可分为非共价修饰和共价修饰两大类：可分为非共价修饰和共价修饰两大类：1 1）大分子非共价修饰大分子非共价修饰：利用一些大分子试剂通过与酶利用一些大分子试剂通过与酶非共价相互作用，对酶进行有效的保
23、护。非共价相互作用，对酶进行有效的保护。例如：聚乙二醇、右旋糖苷等通过氢键固定于酶分子的例如：聚乙二醇、右旋糖苷等通过氢键固定于酶分子的表面，同时又有效地与外部水相连，从而保护酶的活力；表面，同时又有效地与外部水相连，从而保护酶的活力；一些多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶一些多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶活力；另外一些蛋白质可以通过相互的微环境来保护酶活力；另外一些蛋白质可以通过相互作用，排除分子表面的水分子，降低介电常数，使酶的作用，排除分子表面的水分子，降低介电常数，使酶的稳定性增加。稳定性增加。2 2）大分子共价修饰：大分子共价修饰：利用一些可溶
24、性大分子，通利用一些可溶性大分子，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层，形成的可溶性酶具有许多有用的性质。，形成的可溶性酶具有许多有用的性质。例如：用聚乙二醇共价修饰例如：用聚乙二醇共价修饰SODSOD，不仅可以降低或消除，不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了半衰酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了半衰期，从而提高了药效。期，从而提高了药效。聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）_常使用的水溶性大分子修饰剂常使用的水溶性大分子修饰剂 溶解度高溶解度高既溶于水，又溶于大多数有机试剂既溶于水，又溶于大多数有机试剂通常无
25、毒性，也无抗原性通常无毒性，也无抗原性生物相容性好生物相容性好4.4.分子内交联：分子内交联：l增加酶分子表面的交联键数目是提高酶稳定性增加酶分子表面的交联键数目是提高酶稳定性的有效方法之一，的有效方法之一，l例如：胰凝乳蛋白酶上的羧基经过羰二亚胺活化后，例如：胰凝乳蛋白酶上的羧基经过羰二亚胺活化后，可以与一系列二胺发生作用，使酶的稳定性得到改善。可以与一系列二胺发生作用，使酶的稳定性得到改善。5.5.分子间交联：分子间交联：利用一些双功能或多功能试剂将不同的酶交联在一起利用一些双功能或多功能试剂将不同的酶交联在一起形成杂化酶。形成杂化酶。例如：用戊二醛把胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交联在一例如：用
26、戊二醛把胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交联在一起，可以降低胰凝乳蛋白酶的自溶性；将胰蛋白酶与起，可以降低胰凝乳蛋白酶的自溶性；将胰蛋白酶与碱性磷酸脂酶交联形成的杂化酶可作为部分代谢途径碱性磷酸脂酶交联形成的杂化酶可作为部分代谢途径的模型。的模型。蛋白质类修饰蛋白质类修饰l血浆蛋白质，其中人血清白蛋白应用较多血浆蛋白质，其中人血清白蛋白应用较多6.6.脂质体包埋：脂质体包埋：一些医药用酶，如一些医药用酶，如 SODSOD、溶菌酶等，由于分子量较、溶菌酶等，由于分子量较大，不易进入人体细胞内，而且在体内半衰期短，大，不易进入人体细胞内，而且在体内半衰期短，产生免疫原性反应；用脂质体包埋法纪可解决这些产生免
27、疫原性反应；用脂质体包埋法纪可解决这些问题。制止提是天然脂类或类固醇组成的问题。制止提是天然脂类或类固醇组成的 微球体，微球体，酶分子包埋在其内部，可以通过与细胞的膜融合或酶分子包埋在其内部，可以通过与细胞的膜融合或内吞作用而进入细胞内。内吞作用而进入细胞内。7.7.反相胶团微囊化：反相胶团微囊化：这是近年来发展起来的酶在有剂相中进行催化的技这是近年来发展起来的酶在有剂相中进行催化的技术，反相胶团中酶的稳定性大大提高；一些表面活术，反相胶团中酶的稳定性大大提高；一些表面活性剂溶解在非极性有机溶剂中时可自发地形成近似性剂溶解在非极性有机溶剂中时可自发地形成近似球状的反相胶团，反相胶团是表面活性剂
28、的疏水尾球状的反相胶团，反相胶团是表面活性剂的疏水尾部朝外而极性头部朝内的微胶团，其内部可容纳一部朝外而极性头部朝内的微胶团，其内部可容纳一定量的水，酶溶解在其中避免变性定量的水，酶溶解在其中避免变性。加加H2O 疏水尾部疏水尾部 亲水头部亲水头部 加酶液加酶液 S PEEE 图：反相胶团的结构和酶的分布图：反相胶团的结构和酶的分布（二）酶分子的内部修饰（二）酶分子的内部修饰非催化活性基团的修饰：非催化活性基团的修饰：通过对非催化残基的修饰可通过对非催化残基的修饰可以改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物的亲和力；以改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物的亲和力；通常可被修饰的氨基酸残基既可以是亲
29、核的，也可以通常可被修饰的氨基酸残基既可以是亲核的，也可以是亲电子的，还可以是是可氧化残基。是亲电子的，还可以是是可氧化残基。酶蛋白主链的修饰：酶蛋白主链的修饰：主要是靠酶法进行修饰，用蛋白主要是靠酶法进行修饰，用蛋白酶对主链进行部分水解，可以改变酶的催化特性。酶对主链进行部分水解，可以改变酶的催化特性。催化活性基团的修饰：催化活性基团的修饰：通过选择性修饰催化活性氨基通过选择性修饰催化活性氨基酸的侧链来实现氨基酸残基的取代，使一种氨基酸侧酸的侧链来实现氨基酸残基的取代，使一种氨基酸侧链转化为另一种氨基酸侧链，这种方法又称为化学突链转化为另一种氨基酸侧链，这种方法又称为化学突变法。变法。肽链伸
30、展后的修饰：肽链伸展后的修饰：酶蛋白经过脲、盐酸胍处理，使酶蛋白经过脲、盐酸胍处理，使肽链充分伸展，对酶分子内部的疏水基团进行修饰，肽链充分伸展，对酶分子内部的疏水基团进行修饰，然后在适当条件下，重新进行折叠然后在适当条件下，重新进行折叠（三）与辅因子相关的修饰（三）与辅因子相关的修饰1.1.对依赖辅因子的酶可用两种方法进行修对依赖辅因子的酶可用两种方法进行修饰：饰：如果辅因子与酶是非共价结合的如果辅因子与酶是非共价结合的,可以将辅因可以将辅因子共价结合于酶分子上；子共价结合于酶分子上；引入新的具有更强反应的辅因子。引入新的具有更强反应的辅因子。（四）金属酶的金属取代（四）金属酶的金属取代：酶
31、分子中的金属离子可以被其他金属离子取代，可以酶分子中的金属离子可以被其他金属离子取代，可以改变酶的专一性、稳定性等。改变酶的专一性、稳定性等。概念概念 通过改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和通过改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法称为金属离子置换修饰。功能发生改变的方法称为金属离子置换修饰。l常用二价金属离子。常用二价金属离子。金属离子置换修饰法只适用于本来在结构中含有金金属离子置换修饰法只适用于本来在结构中含有金属离子的酶属离子的酶举例举例l将锌型蛋白酶的将锌型蛋白酶的ZnZn2+2+除去，然后用除去，然后用CaCa2+2+置换成钙型置换成钙型蛋白酶，则酶活力可提
32、高蛋白酶，则酶活力可提高20-30%20-30%。若将钙型蛋白。若将钙型蛋白酶制成结晶，则其酶活力比锌型蛋白酶结晶的酶酶制成结晶，则其酶活力比锌型蛋白酶结晶的酶活力提高活力提高2-32-3倍。倍。修饰效果评价修饰效果评价,对修饰反应评价因素：对修饰反应评价因素：有多少修饰剂已经结合到蛋白质上；有多少修饰剂已经结合到蛋白质上；哪些氨基酸被修饰剂修饰，修饰度是多少；哪些氨基酸被修饰剂修饰，修饰度是多少；修饰物中有多少种不同形式的修饰剂蛋白质偶合物，修饰物中有多少种不同形式的修饰剂蛋白质偶合物，每种各有多少每种各有多少 酶的化学修饰对其活性的影响酶的化学修饰对其活性的影响 酶酶化学修饰化学修饰影响影
33、响淀粉酶淀粉酶 修饰活性部位的修饰活性部位的Trp Trp 产产物物中中葡葡萄萄糖糖与与麦麦芽芽糖糖百百分含量加大分含量加大 胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶 加入吡哆醛加入吡哆醛 可可使使带带有有自自由由氨氨基基的的D D芳芳香香族族氨氨基基酸酸酯酯水水解解，减减少少对对正正常常底底物物的的活活力力 木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶 用用77溴溴乙乙酰酰1010甲甲基基异异噁噁烷烷将将CysCys烷烷基基化化 使二氢尼古丁酰胺氧化使二氢尼古丁酰胺氧化 凝乳酶凝乳酶 用各种酐进行酰化用各种酐进行酰化 使使牛牛奶奶凝凝结结力力增增加加100100倍倍以上以上 修饰蛋白在医学上的应用修饰蛋白在医学上的应用 如如:抗抗
34、白白血血病病药药物物天天冬冬酞酞胺胺酶酶的的游游离离氨氨基基经经过过脱脱氨氨基基作作用用，酰酰化化反反应应或或羰羰工工亚亚胺胺反反应应进进行行修修饰饰后后，该该酶酶在在血浆中的稳定性得到很大的提高；血浆中的稳定性得到很大的提高；人人的的-半半乳乳糖糖苷苷酶酶A A经经交交联联反反应应修修饰饰后后，酶酶活活性性比比自然酶稳定；自然酶稳定；酶酶与与聚聚乙乙二二醇醇、多多糖糖、某某些些蛋蛋白白质质结结合合后后酶酶的的性性质质亦亦可可得得到到改改善善，淀淀粉粉酶酶与与葡葡聚聚糖糖结结合合后后，热热稳稳定定性性显显著著增增加加，该该自自然然酶酶的的半半寿寿期期只只有有2.52.5分分钟钟，结结合合酶则为
35、酶则为6363分钟。分钟。六、修饰酶的化学性质六、修饰酶的化学性质1.1.热稳定性：热稳定性：一般来说，经过化学修饰的酶，热稳定性有较大的提一般来说，经过化学修饰的酶，热稳定性有较大的提高。主要是由于修饰试剂的多个功能基团与酶分子的高。主要是由于修饰试剂的多个功能基团与酶分子的多个功能基团相互交联增加了酶分子构象的稳定性。多个功能基团相互交联增加了酶分子构象的稳定性。天然酶和修饰酶的热稳定性比较天然酶和修饰酶的热稳定性比较 酶酶 修饰剂修饰剂 修饰酶修饰酶 天然酶天然酶 处理条件处理条件(/(/时间时间)残留酶活残留酶活(%)(%)酰苷脱氢酶酰苷脱氢酶 胰蛋白酶胰蛋白酶 过氧化氢酶过氧化氢酶
36、溶菌酶溶菌酶 尿激酶尿激酶糜蛋白酶糜蛋白酶 右旋糖苷右旋糖苷 右旋糖苷右旋糖苷 右旋糖苷右旋糖苷 右旋糖苷右旋糖苷 人血清白蛋白人血清白蛋白 肝肝 素素 37/100min37/100min 100/30min100/30min 50/10min50/10min 100/30min100/30min 37/48h37/48h 37/24h37/24h 7070 100100 4646 6464 4040 9090 2020 9999 8080 0 0 9595 50502.2.抗原性：抗原性：修饰酶的抗原性与修饰剂有关，目前比较公认的是修饰酶的抗原性与修饰剂有关，目前比较公认的是PEGPEG和
37、人血清白蛋白在消除酶分子抗原性方面效果和人血清白蛋白在消除酶分子抗原性方面效果较好。较好。酶酶L-Asn L-Asn 酶酶SODSOD酶酶 Gln-Aln Gln-Aln 酶酶尿酸酶尿酸酶腺苷脱氢酶腺苷脱氢酶Arg Arg 酶酶过氧化氢酶过氧化氢酶胰蛋白酶胰蛋白酶抗原性抗原性修饰剂修饰剂 -葡萄糖苷葡萄糖苷酶酶核糖核酸酶酶核糖核酸酶酶PEGPEGPEGPEGPEGPEGPEGPEGPEGPEGPEGPEG白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白Poly-DL-AlaPoly-DL-Ala消消 除除消消 除除消消 除除消消 除除消消 除除消消 除除消消 除除降降 低低降降 低低消消 除除 修饰酶的抗
38、原性变化修饰酶的抗原性变化3.3.对各类失活因子的抵抗力对各类失活因子的抵抗力:化学修饰酶与天然酶相比化学修饰酶与天然酶相比,对蛋白酶、抑制剂等失对蛋白酶、抑制剂等失活因子的抵抗力均有不同程度的提高活因子的抵抗力均有不同程度的提高 天然酶和修饰酶抗失活因子能力比较天然酶和修饰酶抗失活因子能力比较酶酶抗抑制剂抗抑制剂抗蛋白酶抗蛋白酶修饰剂修饰剂抗失活剂抗失活剂过氧化氢酶过氧化氢酶核糖核酸酶核糖核酸酶溶菌酶溶菌酶胰蛋白酶胰蛋白酶 -葡萄糖苷葡萄糖苷酶酶尿激酶尿激酶右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷白蛋白白蛋白右旋糖苷右旋糖苷抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶抗蛋白酶抗蛋白酶抗糜蛋白
39、酶抗糜蛋白酶抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶抗抗SDSSDS抗大豆抑制剂抗大豆抑制剂抗胃蛋白酶抗胃蛋白酶抗胎盘抑制剂抗胎盘抑制剂抗尿素抗尿素抗抗SDSSDS天然酶与修饰酶的半衰期比较天然酶与修饰酶的半衰期比较酶酶羧肽酶羧肽酶Arg Arg 酶酶Gln-AsnGln-Asn酶酶尿酸酶尿酸酶超氧化物岐化酶超氧化物岐化酶过氧化氢酶过氧化氢酶修饰剂修饰剂半衰期半衰期天然酶天然酶修饰酶修饰酶白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白糖肽糖肽右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷PEGPEG3.5h3.5h17h17h1.4h1.4h1h1h4h4h6min6min6h6h12h12h8h8h20h20h4h4h8h8h4.4.修饰酶在体内
40、的半衰期：修饰酶在体内的半衰期：多数修饰酶在体内的半衰期得到有效延长。多数修饰酶在体内的半衰期得到有效延长。天然酶与修饰酶的最适天然酶与修饰酶的最适pHpH酶酶修饰酶修饰酶天然酶天然酶修饰剂修饰剂糜蛋白酶糜蛋白酶猪肝尿酸酶猪肝尿酸酶吲哚吲哚-3-3-链烷羟化酶链烷羟化酶猪肝尿酸酶猪肝尿酸酶产沅假丝酵母尿酸酶产沅假丝酵母尿酸酶白蛋白白蛋白PEGPEGPEGPEG聚丙烯酸聚丙烯酸肝肝 素素10.510.57.4-8.57.4-8.55.0-5.55.0-5.59.09.08.88.83.53.58.28.28.28.28.08.09.09.05.5.最适最适pH:pH:大多数酶经化学修饰后，最适大
41、多数酶经化学修饰后，最适pHpH发生了变化，这发生了变化，这在应用上具有重要意义。在应用上具有重要意义。6.Km 6.Km 的变化的变化:有些酶经化学修饰后，有些酶经化学修饰后，KmKm变大，这可能是由于屏蔽变大，这可能是由于屏蔽效应引起的。效应引起的。七、酶化学修饰的应用领域七、酶化学修饰的应用领域=在基础酶学研究上4探测酶活性必需氨基酸的性质和数目探测酶活性必需氨基酸的性质和数目4酶蛋白一级结构的测定酶蛋白一级结构的测定4酶蛋白的结构变化与运动酶蛋白的结构变化与运动4酶蛋白部分区域的构象状态酶蛋白部分区域的构象状态4酶的作用机理与催化反应历程酶的作用机理与催化反应历程4酶分子的拓扑学以及寡
42、聚酶的亚基结合状态酶分子的拓扑学以及寡聚酶的亚基结合状态4酶的固定化技术酶的固定化技术4酶纯度的分析与检测酶纯度的分析与检测=在疾病治疗上4克服酶在体内的不稳定性克服酶在体内的不稳定性 4消除或降低酶的抗原性消除或降低酶的抗原性4有助于酶分子到达并集中于病灶细胞有助于酶分子到达并集中于病灶细胞=在工业上的应用4酶稳定性提高，使生产成本降低酶稳定性提高，使生产成本降低4反应条件的改善和酶寿命的延长导致生产工艺的技术反应条件的改善和酶寿命的延长导致生产工艺的技术革新和改进。革新和改进。八、蛋白质化学修饰的局限性八、蛋白质化学修饰的局限性l（1 1）某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性）某种修
43、饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性是相对的，很少有是相对的，很少有对某一氨基酸侧链绝对专一的化对某一氨基酸侧链绝对专一的化学修饰剂。因为同一种氨基酸残基在不同酶分子中所学修饰剂。因为同一种氨基酸残基在不同酶分子中所存在的状态不同，所以同一种修饰剂对不同酶的修饰存在的状态不同，所以同一种修饰剂对不同酶的修饰行为也不同。行为也不同。l（2 2）化学修饰后酶的构象或多或少都有一些改变，因）化学修饰后酶的构象或多或少都有一些改变，因此这种构象的变化将妨碍对修饰结果的解释。但是，此这种构象的变化将妨碍对修饰结果的解释。但是，如果在实验中控制好温度，如果在实验中控制好温度，p p等实验条件，选择适当等实
44、验条件，选择适当的修饰剂，这个问题可以得到解决。的修饰剂，这个问题可以得到解决。l（3 3）酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链）酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行，但是射线衍射结构分析结果表明其它氨基上进行，但是射线衍射结构分析结果表明其它氨基酸侧链在维持酶的空间构像方面也有重要作用，而且酸侧链在维持酶的空间构像方面也有重要作用，而且从种属差异的比较分析，它们在进化中是比较保守的。从种属差异的比较分析，它们在进化中是比较保守的。目前还不能用化学修饰的方法研究这些氨基酸残基在目前还不能用化学修饰的方法研究这些氨基酸残基在酶结构与功能关系中的作用。酶结构与功能关系中的作用。l（4 4）酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关系）酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关系能提供一些信息，如某一氨基酸残基被修饰后，酶活能提供一些信息，如某一氨基酸残基被修饰后，酶活完全丧失，说明该残基是酶活性所完全丧失，说明该残基是酶活性所“必需必需“的，为什的，为什么是必需的，还得用射线和其它方法。因此化学修么是必需的，还得用射线和其它方法。因此化学修饰法研究酶结构与功能关系尚缺乏准确性和系统性。饰法研究酶结构与功能关系尚缺乏准确性和系统性。