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1、生物化学有动画第1页，共13页，编辑于2022年，星期一已知某蛋白的分子量约为已知某蛋白的分子量约为17 kDa17 kDa，等电点，等电点3.94.13.94.1，它能耐一定的，它能耐一定的高温，在高温，在90 C90 C加热加热34 min34 min后仍然能够保持后仍然能够保持80%80%的活性。该蛋白含的活性。该蛋白含有较多的疏水性残基，与有较多的疏水性残基，与CaCa2+2+结合后可以暴露它的疏水基团。结合后可以暴露它的疏水基团。该蛋白该蛋白的作用是作为生物体内酶的激活剂的作用是作为生物体内酶的激活剂。题目解析在钙离子的作用下才能起到暴露疏水集团发挥性能，结合蛋白质基础知识从而可以判
2、断其为钙调蛋白。第2页，共13页，编辑于2022年，星期一钙调蛋白（英语：Calmodulin，又称钙调素、携钙素，简称CaM），是一种能与钙离子结合的蛋白质，普遍存在真核生物细胞中。钙调素由148个氨基酸组成（分子量为16700）；含有大量酸性氨基酸（有1/3是谷氨酸和天冬氨酸），为酸性蛋白质（等电点为4.3）。钙调素含有4个EF手结构片断，其中每一个都可以结合一个钙离子。钙调蛋白是一种钙结合蛋白，存在于几乎所有的真核细胞中。它的作用是对任何微量的钙都能敏感地捕获。钙调蛋白只有在与Ca2+结合后才有活性。与钙结合后，CaM发生构型上的变化，成为一些酶的激活物。因不含有易氧化的络氨酸、半胱氨酸
3、，因此十分的稳定第3页，共13页，编辑于2022年，星期一实验方法：热变性吸附层析法，基因重组大 肠杆菌法（论文无法下载）蛋白检测：分为定性检测和活性检测实验总结：总结当前实验第 18 卷第 4 期Journal of Shanxi Teachers UniversityVol.18 No.42004 年 12 月Natural Science Edition动物脑组织中钙调蛋白的分离纯化动物脑组织中钙调蛋白的分离纯化 袁丽环,段江燕第4页，共13页，编辑于2022年，星期一试剂准备：试剂准备：新鲜鼠脑；标准钙调蛋白；PDE；Pipes；BufferA：10 mmol/L Pipes,1 mm
4、ol/L EDTA,pH=7.0;BufferB：10 mmol/L Pipes,1 mmol/L CaCl2,pH=7.0;BufferC：50 mmol/L Tris-HCl,0.5 mmol/L NaCl,10 mmol/L EDTA,pH=8.0;测定Buffer：360 mmol/L Tris-HCl，360 mmol/L 咪唑，4.5 mmol/L MgAc2。第5页，共13页，编辑于2022年，星期一仪器准备：仪器准备：TGL-16L-A 高速冷冻离心机；2001-B-C七件套豪华层析系统；UV-2201紫外分光光度计。第6页，共13页，编辑于2022年，星期一取新鲜的鼠脑共20
5、 g，切碎并于100 mL BufferA 中匀浆 将匀浆液置100 水浴中煮沸 3 min，冷却后离心 10000rpm，60min.取上清液调成2 mmol/L CaCl2 溶液。取样，采用离心法：取样，采用离心法：第7页，共13页，编辑于2022年，星期一粗样品的纯化粗样品的纯化：（吸附层析法）：（吸附层析法）装柱：采用葡聚糖G-5 0(分离蛋白质的范围在 1.5103-3104 )用蒸馏水浸充分膨胀(3 h-4 h)后再装柱；平衡：用提取钙调蛋白的缓冲溶液BufferA平衡；上样：经过平衡的凝胶过滤柱。当平衡液流动到与固定相表面一致时，用滴管轻轻地把分离样品的溶液加到固定相表面，要尽量
6、避免冲毁基质 加入样品液的体积一般应少于床体积的1/2;洗脱：待样品液的液面流到固定相表面时，用50 mL BufferB 淋洗之后用200 mL 0.5 mol/L NaCl 的BufferB淋洗，最后用BufferC洗脱；收集：在进行洗脱的同时柱的下端与部分收集器接通。按时间分管收集，每管滴2 min，流速控制在大约1.5 mL/min。第8页，共13页，编辑于2022年，星期一钙调蛋白的定性检测如图，倘若两者最大吸收峰以及峰形基本重合，那么可以判断该物质即为钙调蛋白采用紫外光谱法：第9页，共13页，编辑于2022年，星期一钙调蛋白的活性检测根据磷酸二酯酶(PDE)可特异地把环核苷酸水解为
7、 5-核苷酸,并在蛇毒中的核苷酸作用下,进一步水解成腺苷和磷酸.而钙调蛋白可以激活 PDE,从而使最终的产物无机磷的量增加,因此可依据磷的含量判断钙调蛋白的生物学活性.机理图如下对活性的计算存在以下定量关系：采用PDE法：第10页，共13页，编辑于2022年，星期一热变性离心，以及用钙离子络合钙调蛋白组提取采用葡聚糖柱交换吸附法钙调蛋白纯化采用紫外光谱法与标准CaM谱图对比钙调蛋白定性鉴别采用PDE水解法和磷的含量测定钙调蛋白活性测定第11页，共13页，编辑于2022年，星期一本文通过动物脑组织为材料经热变性、离心、葡聚糖SephadexG-50分离纯化，通过紫外吸收图谱、二步酶解法检验钙调蛋白的纯度、浓度。说明此方法可分离纯化得到具生物活性的钙调蛋白，且取材容易，简便经济，为进一步研究钙调蛋白的结构与功能提供了快捷省时的提纯方法。第12页，共13页，编辑于2022年，星期一谢谢！谢谢！第13页，共13页，编辑于2022年，星期一