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1、石蜡制片技术第1页，共22页，编辑于2022年，星期一三、实验原理三、实验原理 石蜡切片的原理是利用石蜡的熔点是58C左右和对不同化学物质溶解性不同，通过透明剂，在石蜡熔点以上，将石蜡渗透进入植物组织和细胞之间，当温度降低到石蜡熔点以下时，凝结成固态固定组织和细胞以利于切片。第2页，共22页，编辑于2022年，星期一一、石蜡制片技术的优点石蜡切片法是一种最常用的显微制片方法，它的优点是可切出大量极薄的连续切片，且成本教低。石蜡切片技术适应细胞水平的研究。第3页，共22页，编辑于2022年，星期一二、实验目的二、实验目的 了解石蜡切片的基本原理，掌握石蜡切片的基本过程和制作方法，学会制作石蜡切片
2、中一些常用试剂的配制方法，认识石蜡切片的实用范围。第4页，共22页，编辑于2022年，星期一四、实验器材、试剂四、实验器材、试剂 手摇切片机、展片台、温箱、镊子、解剖刀、酒精灯、盖玻片、指形管等。番红染色液、固绿染色液、FAA固定液、二甲苯、各级酒精、石蜡、加拿大树胶、蛋白胶等第5页，共22页，编辑于2022年，星期一五、石蜡制片的操作流程五、石蜡制片的操作流程 （一）（一）（一）（一）取材取材取材取材（二）固定和抽气（二）固定和抽气（二）固定和抽气（二）固定和抽气（三）脱水、透明及渗蜡（三）脱水、透明及渗蜡（三）脱水、透明及渗蜡（三）脱水、透明及渗蜡（四）（四）包埋包埋包埋包埋（五）修块（五
3、）修块（五）修块（五）修块 、切片和烫片、切片和烫片（六）烘干（六）烘干（六）烘干（六）烘干（七）脱蜡、染色、脱水、透明（七）脱蜡、染色、脱水、透明（七）脱蜡、染色、脱水、透明（七）脱蜡、染色、脱水、透明 （八）封片（八）封片（八）封片（八）封片 第6页，共22页，编辑于2022年，星期一（一）取材 选取经过自己设计实验的对照和处理的材选取经过自己设计实验的对照和处理的材料，根据不同的要求，从植物体上选取有代料，根据不同的要求，从植物体上选取有代表性的器官或组织，取材力求新鲜，以避免表性的器官或组织，取材力求新鲜，以避免组织发生死后变化。取材时要用快刀切割材组织发生死后变化。取材时要用快刀切割
4、材料，不能挤压，所取的材料不宜过大，在不料，不能挤压，所取的材料不宜过大，在不影响观察的情况下应尽可能小些，这样有利影响观察的情况下应尽可能小些，这样有利于药剂透入组织和细胞中。于药剂透入组织和细胞中。第7页，共22页，编辑于2022年，星期一（二）固定和抽气（二）固定和抽气 （一）将切取的植物材料放入固定液中，使其细胞原生质在极短的时间内停止生命活动，尽量保持细胞原有的细微结构，也可使某些柔软的材料适当硬化，便于切片。材料的长和宽最大不超过1cm。固定液为材料的20倍左右。固定时间24小时，其间要放入抽真空机中抽气15-30分钟至材料完全沉浸在固定液下面。并用铅笔写好标签。第8页，共22页，
5、编辑于2022年，星期一固定剂的种类 1.1.福尔马林福尔马林醋酸醋酸酒精固定剂（酒精固定剂（FAAFAA）70%70%或或50%50%酒精酒精 90CC90CC 冰醋酸冰醋酸 5CC5CC 福尔马林福尔马林 5CC5CC 2.2.醋酸醋酸酒精固定剂（卡诺固定剂）酒精固定剂（卡诺固定剂）此固定剂的主要成分是冰醋酸和纯酒精，也可加入此固定剂的主要成分是冰醋酸和纯酒精，也可加入氯仿。氯仿。纯酒精（纯酒精（95%95%酒精）酒精）3 3份份 冰醋酸冰醋酸 1 1份份第9页，共22页，编辑于2022年，星期一（三）脱水、透明及渗蜡（三）脱水、透明及渗蜡将材料从固定液中取出后，其具体流程如下：A：酒精
6、X：二甲苯 70%A（2h）85%A（2h）95%A（2h）100%A（2h）100%A（2h）3/4A+1/4X（2h）1/2A+1/2X（2-3h、过夜）1/4A+3/4X（2h）X（2h）1/2X+1/2蜡（过夜）渗蜡1（2h）渗蜡2（2h）渗蜡3（2h）第10页，共22页，编辑于2022年，星期一（四）包埋包埋 将渗蜡后的材料和石蜡一起倒入小纸盒，用加热的镊子迅速把材料按需要的切面和一定的间隔排列整齐并使其竖直，倒入纯蜡进行包埋。稍微凝固后倒置于清水盆中彻底冷却凝固。第11页，共22页，编辑于2022年，星期一（五）修块（五）修块、切片和烫片 1 1、修块修块修块修块 将包埋好的材料切
7、割成小块，每个小块包含一个材料，并修将包埋好的材料切割成小块，每个小块包含一个材料，并修成梯形，切面在梯形的上部。注意上部矩形对边平行，梯形底部用烧热成梯形，切面在梯形的上部。注意上部矩形对边平行，梯形底部用烧热的蜡将其固定在木块上。的蜡将其固定在木块上。2 2、切片切片切片切片 将粘有蜡块的小木块至于切片机上，调整切距到适当大将粘有蜡块的小木块至于切片机上，调整切距到适当大小，转动调节器条切片厚度小，转动调节器条切片厚度12m12m左右进行切片。注意切片时要一手左右进行切片。注意切片时要一手转动切片机，另一手执毛笔将切下来的片子摊开以形成一长条蜡带。转动切片机，另一手执毛笔将切下来的片子摊开
8、以形成一长条蜡带。3 3、烫片烫片烫片烫片 滴一滴蛋白胶于干净载玻片中央，用干净的手指涂抹均匀后，滴一滴蛋白胶于干净载玻片中央，用干净的手指涂抹均匀后，滴上清水，将取下的蜡带切成小段置于载玻片上（放上两至三段），然滴上清水，将取下的蜡带切成小段置于载玻片上（放上两至三段），然后将载玻片放到展片台上后将载玻片放到展片台上(保持保持4040)烫片。烫片。待充分烫平后用吸水纸待充分烫平后用吸水纸吸去多余的水。吸去多余的水。第12页，共22页，编辑于2022年，星期一（六）烘干（六）烘干 将烫好的片子自然烘干，或45烤片箱干燥12天，注意防尘。第13页，共22页，编辑于2022年，星期一（七）脱蜡、染
9、色、脱水、透（七）脱蜡、染色、脱水、透明明 将玻片标本放于将玻片标本放于100%X100%X（15-30min)100%X(1-15-30min)100%X(1-2min)50%X+50%A(1-2min)100%A(1-2min)50%X+50%A(1-2min)100%A(1-2min)95%A(1-2min)85%A(1-2min)2min)95%A(1-2min)85%A(1-2min)番红（番红（85%A85%A配制）配制）(2-4h)85%A(3-5s(2-4h)85%A(3-5s）95%A(3-5s95%A(3-5s）固绿固绿（100%A100%A配制）配制）(30s)95%A(
10、1-2min)100%A(1-(30s)95%A(1-2min)100%A(1-2min)100%A(1-2min2min)100%A(1-2min）50%X+50%A(1-50%X+50%A(1-2min)100%X(1-2min)100%X(1-2min)2min)100%X(1-2min)100%X(1-2min)注意番红染色时间要长些（至少注意番红染色时间要长些（至少3h3h以上），随后的两次经以上），随后的两次经过酒精的时间都应很短，以免洗掉染上的番红，固绿的染色时过酒精的时间都应很短，以免洗掉染上的番红，固绿的染色时间大约在间大约在20-30s,20-30s,其他各步的时间大约其他
11、各步的时间大约1 1至至2 2分钟，均要视具分钟，均要视具体情况而定。体情况而定。第14页，共22页，编辑于2022年，星期一番红固绿染色法 此法应用甚广，是研究植物一般形态结构的重要方法。番红为碱性染料，常用的是混合物（二甲基酚番红，三甲基酚番红），可将细胞核、染色体、核仁等染成红色，对木化、栓化、角化的细胞壁也有很好的染色效果。固绿为酸性染料，能对细胞质、纤维素细胞壁染色。番红与固绿对染，效果很好。第15页，共22页，编辑于2022年，星期一番红染液配法配方配方配方配方药药药药品品品品I IIIII IIIIII IVIV番番番番红红红红1g1g1g1g1g1g1g1g蒸蒸蒸蒸馏馏馏馏水水
12、水水100cc100cc5%5%酒精酒精酒精酒精95cc95cc70%70%酒精酒精酒精酒精100cc100cc95cc95cc苯胺油苯胺油苯胺油苯胺油5cc5cc5cc5cc第16页，共22页，编辑于2022年，星期一 固绿染液配法 配配配配方方方方药药药药品品品品 I I IIII IIIIII IVIV V V VIVI固固固固绿绿绿绿0.5-1g0.5-1g0.5-1g0.5-1g0.5-1g0.5-1g0.5-1g0.5-1g0.3-0.3-0.5g0.5g1-2g1-2g95%95%酒精酒精酒精酒精100cc100cc无水无水无水无水酒精酒精酒精酒精100cc100cc50-50-
13、60cc60cc95cc95cc80cc80cc苯胺苯胺苯胺苯胺油油油油5cc5cc20cc20cc丁香丁香丁香丁香油油油油100cc100cc40-40-50cc50cc第17页，共22页，编辑于2022年，星期一铁矾苏木精染色法 次法在细胞学及胚胎学上广为应用，是显示细胞一般结构及细胞分裂的良好染色方法，它能将细胞核、细胞分裂时的染色体染成蓝黑色，且能长久保持颜色。苏木精（C16H14O6）不能直接染色，必须氧化成熟为氧化苏木精，同时还要经过媒剂的作用，才能染上颜色，所以这种染色法必须配制两种溶液。第18页，共22页，编辑于2022年，星期一染液的配制甲液：4%铁矾（硫酸铁胺）水溶液，这是
14、一种媒染剂，冲淡成2%的浓度时，又可作分色剂使用，临用时配用较好。乙液：苏木精10g+无水酒精100CC，这是母液，要经12个月才能氧化成熟，染色时，将此母液5CC加入100CC蒸馏水，冲淡应用。第19页，共22页，编辑于2022年，星期一染色过程玻片材料经脱蜡、各级酒精、蒸馏水，进入4%铁矾媒染054小时，水洗约5分钟，换蒸馏水2次，每次23分钟，然后05%苏木精染色14小时或更长，蒸馏水换洗数次，再用2%铁矾分色，一般大约半分钟至数分钟。在分色时，要随时在低倍镜下检查，直到满意为止。然后，用水冲洗30分钟，最后换蒸馏水数分钟。第20页，共22页，编辑于2022年，星期一（八）封片、干燥、贴标签（八）封片、干燥、贴标签 1、从二甲苯中取出然好色的片子，用中性树胶进行封片。注意封片用的该玻片要清洁，封片时要注意不要产生气泡。2、一般一个月以上，树胶才能干燥，如加热烤片，可缩短干片时间，在载玻片的一端贴上标签，注明材料名称、制片时间等，最后将制成后的玻片置于切片盒中保存。第21页，共22页，编辑于2022年，星期一六、思考题为什么固定材料时最好抽气，材料中有气泡对切片有何影响？为什么制作营养器官的石蜡切片常用番红固绿染色，而制作生殖器官的切片则多用苏木精固绿染色？第22页，共22页，编辑于2022年，星期一