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1、常用培养基配方一、实验目的掌握在真菌、细菌、放线菌分离培养工作中常用的合成和半合成培养基配制的一般原理、方法、程序、环节及要求和注意事项。实验内容二、实验原理培养基的配制是进行微生物学实验工作的重要基础。由于微生物种类及代谢类型的多样性，因而用于培养微生物培养基的种类也很多，它们的配方组成及配制方法虽各有差异,但一般培养基配制的常规程序却大致相同，例如器皿的准备，培养基的配制与分装，棉塞的制作，培养基的灭菌，斜面与平板的制作以及培养基的无菌检查等基本环节。肉膏蛋白胨培养基是一种广泛用于培养细菌的培养基，属于半合成培养基。其主要成分是牛肉膏、蛋白胨和NaCl。它们分别提供微生物生长繁殖所需要的碳
2、源、氮源、能源、生长因子和无机盐等。培养基都是水溶液，这是因为一切生物细胞都必须要有水的参与。高氏一号培养基是一种用于培养放线菌的合成培养基。培养基中的可溶性淀粉作为碳源和能源，KNO3作为氮源，K2HPO4、MgSO4和FeSO4作为无机盐等。马铃薯葡萄糖培养基被广泛用于培养酵母菌和霉菌，为半合成培养基。食品检测国标使用虎红培养基。1.培养基的配制过程1.1液体培养基的配制1.1.1称量 一般可用1/100粗天平称量配制培养基所需的各种药品。先按培养基配方计算各成分的用量然后进行准确称量。染料、指示剂、胆盐等物质何时加入？调整pH后。1.1.2溶化 将称好的药品置于一烧杯中，先加入少量水，然
3、后加热溶解，并不断用玻璃棒搅动。含铜大于0.3mol/L时，细菌不易生长；含铁大于0.14mol/L妨碍细菌产生毒素。1.1.3定容待全部药品溶解后，倒入一量筒中，加水至所需体积。问：如某种药品用量太少如何称量？答：可先配置成较浓溶液，然后按比例吸收一定体积溶液，加入到培养基中。1.1.4调PH一般用pH试纸测定培养基pH。用剪刀剪出一段pH纸，然后用镊子夹取此段pH试纸，在培养基中蘸一下，观察其pH范围，如培养基偏酸或偏碱时，可用1mol/LNaOH或1mol/LHCl溶液进行调节。调节pH时，应逐渐加入NaOH或HCl溶液，防止局部过酸或过碱，破坏培养基中成分。边加边搅拌，并不时用pH试纸
4、测试，直至达到所需pH为止。注：一般将培养基pH调整高出所需值的0.1-0.2个pH单位，经高压灭菌后，其pH要降低0.1-0.2个单位。1.1.5过滤用滤纸或多层纱布过滤培养基。一般无特殊要求时，此步可省去。1.2固体培养基的配制配制固体培养基时，应将已配好的液体培养基加热煮沸，再将称好的琼脂加入，并用玻棒不断搅拌，以免糊底烧焦。继续加热至琼脂全部融化，最后补足因蒸发而失去的水分。2.培养基的分装根据不同需要，可将已配好的培养基分装入试管或锥形瓶内，分装时注意不要使培养基沾污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培养基沾污管口或瓶口时，可用镊子夹一小块脱脂棉，擦去管口或瓶口的培养基，并将脱脂棉
5、弃去。2.1试管的分装取一个玻璃漏斗，装在铁架上，漏斗下连一根橡皮管，橡皮管下端再与玻璃管相接，橡皮管的中部加一弹簧夹。分装时，用左手拿住空试管中部，并将漏斗下的玻璃管嘴插入试管内，以右手拇指及食指开放弹簧夹，中指及无名指夹住玻璃嘴，使培养基直接流入试管内。注：分装在不同规格三角烧瓶、试管等容器中，分装量不宜超过容器的2/3，否则会溢出。装入试管培养基的量，视试管大小及需要而定。若所用试管大小为15*150mm时，液体培养基可分装至试管高度1/4左右为宜；如分装固体或半固体培养基时，琼脂完全融化后，应趁热分装于试管中。用于制作斜面的固体培养基的分装量为管高1/5，半固体培养基分装量为管高的1/
6、3为宜。2.2锥形瓶的分装用于振荡培养微生物时，可在250ml锥形瓶中加入50ml的液体培养基；若用于制作平板培养基时，可在250ml锥形瓶中加入150ml培养基，然后再加入3g琼脂粉（按2%计算）。灭菌时瓶中琼脂粉同时被融化。3.棉塞的制作及试管、锥形瓶的包扎为了培养好氧性微生物，需提供优良通气条件，同时为防止杂菌污染，则必须对通入试管或锥形瓶内空气先进行过滤，除菌。通常方法是在试管及锥形瓶口加上棉花塞等。3.1试管棉塞的制作制棉塞时，应选取用大小，厚薄适中的普通棉花一块，铺展于左手拇指和食指扣成的圆孔中，用右手食指将棉花从中央压入圆孔中制成棉塞，然后直接压入试管或锥形瓶口。也可借用玻璃棒塞
7、入，也可用折叠法制作棉塞。制作的棉塞应紧贴管壁，不留缝隙，以防外界微生物沿缝隙侵入，棉塞不宜过紧或过松，塞好后以手提棉塞，试管不下落为准。棉塞的2/3在试管内，1/3在试管外。将装好培养基并塞好棉塞或盖好管帽的试管捆成一捆，外面包上一层牛皮纸。用铅笔注明培养基名称及配制日期。灭菌待用。3.2锥形瓶棉塞制作通常在棉塞外包上一层纱布，再塞在瓶口上。有时为了进行液体振荡培养加大通气量，则可用8层纱布代替棉塞包在瓶口上。在装好培养基并塞好棉塞或包上8层纱布或盖好培养容器封口膜的锥形瓶口上，再包上一层牛皮纸并用线捆好，灭菌待用。4.培养基的灭菌下一章节详述。5.斜面和平板的制作5.1斜面的制作将已灭菌装
8、有琼脂培养基的试管，趁热倾斜固定，凝固后即成斜面。斜面长度不超过试管长度1/2为宜。如制作半固体或固体深层培养基时，灭菌后则应垂直放置至冷凝。1.葡萄糖：乳糖1：92.下黄上不黄 为分解葡萄糖，不分解乳糖3.上下均黄 为分解葡萄糖、乳糖4.上下均不黄 为非发酵菌5.中间变为黑色为产H2S5.2平板的制作将装在锥形瓶或试管中已灭菌的琼脂培养基融化后，冷却至50摄氏度左右倾入无菌培养皿中。温度过高时，皿盖上冷凝水太多，温度低于50摄氏度，培养基易于凝固而无法制作平板。平板的制作应在酒精灯旁进行，左手拿培养皿，右手拿锥形瓶的底部或试管，左手同时用小指和手掌将棉塞打开，灼瓶口。用左手大拇指将培养皿盖打
9、开一缝。置于桌上，轻轻旋转平皿。使培养基均匀分布于整个平皿中，冷凝后即成平板。三、实验材料3.1药品牛肉膏、蛋白胨、NaCl、酵母膏、可溶性淀粉、KNO3、K2HPO4、MgSO47H2O和FeSO47H2O、马铃薯、葡萄糖、琼脂等。3.2溶液1mol/LNaOH、1mol/LHCl。3.2溶液天平、高压蒸汽灭菌器。3.4玻璃器皿移液管、试管、量筒、锥形瓶、培养皿、玻璃漏斗等。3.5其他常用器皿药匙、pH试纸、称量纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑料试管盖、牛皮纸、报纸等。四、实验内容4.1肉膏蛋白胨培养基的配制4.1.1培养基成分牛肉膏 5g蛋白胨 10gNaCl 5g琼脂 15-20g水 1
10、000mlPh 7.24.1.2配制方法（1）称量及融化分别称取蛋白胨和NaCl的所需量，置于烧杯中，加入所需水量的2/3左右的蒸馏水，用玻璃棒挑取牛肉膏置于另一烧杯中，进行称量。然后加入少量蒸馏水于小烧杯中，加热融化。倒入上述烧杯中。将烧杯置于石棉网上加热，用玻璃棒搅拌，使药品全部融化。（2）调Ph 待溶液冷却至室温时，用1mol/lNaOH溶液调pH至7.2。（3）定容 将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。（4）加琼脂 加入所需量的琼脂，加热融化，补充失水。（5）分装、加塞、包扎。（6）高压蒸汽灭菌0.1MPa灭菌20min。4.2高氏合成一号培养基4.3马铃薯葡萄糖培养基4.4干粉培养
11、基使用注意事项培养基摇匀后准确称量；使用蒸馏水或去离子水配制培养基；宜用中性玻璃质容器，不宜用铜或铁质容器；加热溶解时应适当搅拌，培养基不能过度加热；含琼脂的培养基高压灭菌后不能长时间处于高温状态，应适当水浴及时使用或迅速冷却保存。五、实验报告内容5.1记录所配制的培养基的名称及成分。5.2分析你配制培养基的碳源、氮源、能源、无机盐及维生素的来源。六、思考题6.1培养细菌一般常用什么培养基？培养放线菌常用什么培养基？培养酵母和霉菌常用什么培养基？现行国家标准培养基。6.2牛肉膏应置于何种容器中称量为宜？6.3何谓培养基的自然pH？为什么在配制培养基时经常需要调节pH？第三节 玻璃器皿的包扎1.
12、培养皿的包扎培养皿常用牛皮纸或旧报纸包紧，一般以5-8套培养皿包成1包。包好后干热或湿热灭菌。或者不用纸包扎，直接放入特制的金属（不锈钢或铁皮）筒内，加盖干热灭菌。2.吸管的包扎在干燥吸管的上端约0.5cm处，塞入一小段1-1.5cm的棉花，目的是避免将外界或嘴中杂菌吹入罐内，或不慎将菌液吸出馆外。棉花松紧要合适，若过紧，吹吸液体太费力；过松，吹气时棉花则会下滑。挑取4-5cm宽的长纸条，将吸管尖端斜放在纸条的一端，与纸约呈30度角，折叠纸条包住尖端，左手握住吸管身，右手将吸管压紧，在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎。上端多余的纸条打一小结。包好的多支吸管可再用一张大报纸包成一捆灭菌。干热灭菌时，吸管可不用报纸包扎，直接放入不锈钢筒内，只需尖端朝筒底。3.试管和三角瓶的包扎试管塞上棉花塞，三角瓶塞上棉花塞或“通气式”纱布塞（用8层纱布代替棉花制成的塞子），目的是提供通气条件和防止杂菌污染，外用牛皮纸或2层旧报纸与细线扎好。试管可以多支扎成一捆灭菌。