哺乳动物基因工程精选PPT.ppt

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1、哺乳动物基因工程哺乳动物基因工程哺乳动物基因工程哺乳动物基因工程第1页，此课件共42页哦基因工程5 2 3 4 1 6 7 8 9 基因工程的基本概念基因工程的基本概念基因工程的基本原理基因工程的基本原理基因工程所需的基本条件基因工程所需的基本条件基因工程的操作过程基因工程的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建目的基因的克隆与基因文库的构建大肠杆菌基因工程大肠杆菌基因工程酵母基因工程酵母基因工程哺乳动物基因工程哺乳动物基因工程高等植物基因工程高等植物基因工程第2页，此课件共42页哦D D 高等哺乳动物的基因转移高等哺乳动物的基因转移8 8 哺乳动物基因工程哺乳动物基因工程C C 高等哺乳动物

2、的载体系统高等哺乳动物的载体系统B B 高等哺乳动物的受体系统高等哺乳动物的受体系统A A 高等哺乳动物基因工程的基本概念高等哺乳动物基因工程的基本概念E E 利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白第3页，此课件共42页哦A A 高等哺乳动物基因工程的基本概念高等哺乳动物基因工程的基本概念8 8 哺乳动物基因工程哺乳动物基因工程高等哺乳动物基因工程高等哺乳动物基因工程高等哺乳动物细胞基因表达技术高等哺乳动物细胞基因表达技术高等哺乳动物转基因技术高等哺乳动物转基因技术转基因动物个体转基因动物个体动物工程细胞动物工程细胞哺乳动物遗传性状改良哺乳动物遗传性状改良药物筛选研究

3、评价模型药物筛选研究评价模型人体基因治疗人体基因治疗蛋白多肽物质大规模生产蛋白多肽物质大规模生产药物筛选研究评价模型药物筛选研究评价模型第4页，此课件共42页哦B B 高等哺乳动物的受体系统高等哺乳动物的受体系统8 8 哺乳动物基因工程哺乳动物基因工程高等哺乳动物细胞的生长特性高等哺乳动物细胞的生长特性高等哺乳动物受体细胞的条件高等哺乳动物受体细胞的条件高等哺乳动物受体细胞的遗传标记高等哺乳动物受体细胞的遗传标记常用的高等哺乳动物受体细胞常用的高等哺乳动物受体细胞第5页，此课件共42页哦高等哺乳动物细胞的生长特性高等哺乳动物细胞的生长特性正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征：正常的哺乳类

4、动物细胞具有下列四大生物学特征：锚地依赖性：锚地依赖性：细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂 血清依赖性：血清依赖性：细胞必须具有生长因子才能生长细胞必须具有生长因子才能生长 接触抑制性：接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长便受到抑制细胞与细胞接触后，生长便受到抑制 形态依赖性：形态依赖性：细胞称扁平状，并有长纤维网状结构细胞称扁平状，并有长纤维网状结构上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培养中，一般只能存活上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培养中，一般只能存活5050代代且在培养皿上以平面的形式生长，即单层细胞生长。有时，正常细胞且在培养皿上以

5、平面的形式生长，即单层细胞生长。有时，正常细胞会改变某些特征而越过生理临界点，继续增殖并无限制分裂，这种状会改变某些特征而越过生理临界点，继续增殖并无限制分裂，这种状态称为态称为细胞系形成细胞系形成，此时的细胞成为，此时的细胞成为细胞系细胞系。第6页，此课件共42页哦高等哺乳动物受体细胞的条件高等哺乳动物受体细胞的条件以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞应具备下列条件以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞应具备下列条件 细胞系特征细胞系特征 丧失细胞接触抑制性和锚地依赖性特征，便于大丧失细胞接触抑制性和锚地依赖性特征，便于大 遗传稳定性遗传稳定性 外源基因多次传代后不至于丢失

6、，易于长期保存外源基因多次传代后不至于丢失，易于长期保存 合适的标记合适的标记 便于转化株的筛选和维持便于转化株的筛选和维持 生长快且齐生长快且齐 分裂周期短，生长均一，便于控制分裂周期短，生长均一，便于控制 规模培养规模培养 大多数正常的高等哺乳动物细胞并不能同时具备上述条件，癌细胞能大多数正常的高等哺乳动物细胞并不能同时具备上述条件，癌细胞能 安全性能好安全性能好 不合成分泌致病物质，不致癌不合成分泌致病物质，不致癌满足上述前四项要求，但在安全性能上有欠缺。满足上述前四项要求，但在安全性能上有欠缺。第7页，此课件共42页哦高等哺乳动物受体细胞的遗传标记高等哺乳动物受体细胞的遗传标记营养缺陷

7、型的哺乳动物受体细胞营养缺陷型的哺乳动物受体细胞5-5-磷酸核糖磷酸核糖-1-1-焦磷酸（焦磷酸（PRPPPRPP）次黄嘌呤核苷一磷酸（次黄嘌呤核苷一磷酸（HMPHMP）次黄嘌呤核苷（次黄嘌呤核苷（HRHR）GMPGMPAMPAMP尿嘧啶核苷一磷酸（尿嘧啶核苷一磷酸（UMPUMP）胸腺嘧啶核苷一磷酸（胸腺嘧啶核苷一磷酸（TMPTMP）胸腺嘧啶核苷（胸腺嘧啶核苷（TRTR）嘌呤核苷酸生物合成途径嘌呤核苷酸生物合成途径嘧啶核苷酸生物合成途径嘧啶核苷酸生物合成途径次黄嘌呤磷酸次黄嘌呤磷酸核糖转移酶核糖转移酶（HPRTHPRT）（TKTK）胸腺嘧啶胸腺嘧啶核苷激酶核苷激酶氨基喋呤（氨基喋呤（APAP）

8、氨基喋呤（氨基喋呤（APAP）从头合成途径从头合成途径补救合成途径补救合成途径第8页，此课件共42页哦高等哺乳动物受体细胞的遗传标记高等哺乳动物受体细胞的遗传标记营养缺陷型的哺乳动物受体细胞营养缺陷型的哺乳动物受体细胞含有胸腺嘧啶核苷激酶（含有胸腺嘧啶核苷激酶（TKTK）编码基因缺陷的受体细胞（）编码基因缺陷的受体细胞（tk tk-）不能在含有不能在含有次黄嘌呤核苷次黄嘌呤核苷、氨基喋呤氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷胸腺嘧啶核苷的培养基的培养基上（上（HATHAT培养基培养基）生长，载体上的标记基因）生长，载体上的标记基因tktk能与之遗传互补能与之遗传互补含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（含有次黄嘌呤磷酸

9、核糖转移酶（HPRTHPRT）编码基因缺陷的受体细胞）编码基因缺陷的受体细胞不能在含有不能在含有次黄嘌呤核苷次黄嘌呤核苷、氨基喋呤氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷胸腺嘧啶核苷的培养基的培养基上（上（HATHAT培养基培养基）生长，载体上的标记基因）生长，载体上的标记基因hprthprt与之遗传互补与之遗传互补（hprt hprt-）第9页，此课件共42页哦高等哺乳动物受体细胞的遗传标记高等哺乳动物受体细胞的遗传标记哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记遗传标记遗传标记编码产物编码产物筛选药物筛选药物作用机理作用机理APHAPH-氨基糖苷磷酸转移酶氨基糖苷磷酸转移酶 G418

10、G418 APHAPH灭活灭活G418G418DHFRDHFR 二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶 氨甲喋呤氨甲喋呤 DHFRDHFR变体抗氨甲喋呤变体抗氨甲喋呤 HPHHPH-潮霉素潮霉素BB磷酸转移酶磷酸转移酶 潮霉素潮霉素BB HPHHPH灭活潮霉素灭活潮霉素BB TKTK-胸腺嘧啶核苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶 氨基喋呤氨基喋呤 TKTK合成合成TMPTMPXGPRTXGPRT-黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 霉酚酸霉酚酸 XGPRTXGPRT合成合成GMPGMPADAADA-腺嘌呤核苷脱氨酶腺嘌呤核苷脱氨酶 腺嘌呤木酮糖苷腺嘌呤木酮糖苷 ADAADA灭活灭活Xyl-AXyl

11、-A 第10页，此课件共42页哦常用的高等哺乳动物受体细胞常用的高等哺乳动物受体细胞 迄今为止，用于医疗用品（药物、抗体、诊断试剂）大规模生产迄今为止，用于医疗用品（药物、抗体、诊断试剂）大规模生产的高等哺乳动物受体细胞主要还是的高等哺乳动物受体细胞主要还是中国仓鼠卵巢细胞中国仓鼠卵巢细胞（CHOCHO），其优），其优势有如下几个方面：势有如下几个方面：遗传背景清楚，生理代谢稳定遗传背景清楚，生理代谢稳定与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确基因转移和载体表达系统完善基因转移和载体表达系统完善耐受剪切力，便于大规模培养耐受剪切力，便于大规模培养被美国被美国FD

12、AFDA确认为安全的基因工程受体细胞（确认为安全的基因工程受体细胞（GRASGRAS）第11页，此课件共42页哦C C 高等哺乳动物的载体系统高等哺乳动物的载体系统8 8 哺乳动物基因工程哺乳动物基因工程人腺病毒人腺病毒DNADNA猴空泡病毒猴空泡病毒DNADNA（SV40SV40）人乳多瘤病毒人乳多瘤病毒DNADNA（BKVBKV）人牛痘病毒人牛痘病毒DNADNA第12页，此课件共42页哦人腺病毒人腺病毒DNADNA 腺病毒科为线状双链腺病毒科为线状双链DNADNA病毒，无包膜，呈二十面体，共有病毒，无包膜，呈二十面体，共有9393个个成员，分哺乳动物腺病毒和禽腺病毒两个属。目前已鉴定的人腺

13、病毒成员，分哺乳动物腺病毒和禽腺病毒两个属。目前已鉴定的人腺病毒腺病毒的生物学特性有有6 6个亚属，其中常用来构建载体的主要是个亚属，其中常用来构建载体的主要是CC亚属的亚属的2 2型（型（Ad2Ad2）和）和5 5型型（Ad5Ad5）病毒。）病毒。腺病毒感染人细胞时呈裂解型，不致癌；但对啮齿目动物来说，腺病毒感染人细胞时呈裂解型，不致癌；但对啮齿目动物来说，绝大多数的腺病毒成员均能致癌。绝大多数的腺病毒成员均能致癌。第13页，此课件共42页哦人腺病毒人腺病毒DNADNA腺病毒的基因组DNAITRITRITRITRE1E1E2E2E3E3E4E4IVa2IVa2VAVAL1L1L2L2L3L3

14、L4L4L5L5 腺病毒基因组腺病毒基因组DNADNA全长全长36 36 kbkb，其包装上限为原基因组的，其包装上限为原基因组的105%105%，DNADNA两端各有两端各有一个反向重复序列（一个反向重复序列（ITRITR）；）；E1-E4E1-E4为早期基因，与病毒基因组的复制及晚期基因的为早期基因，与病毒基因组的复制及晚期基因的表达调控有关，其中表达调控有关，其中E3E3编码晚期基因的调控因子，编码晚期基因的调控因子，L1-L5L1-L5为编码病毒包装蛋白的晚期为编码病毒包装蛋白的晚期基因；基因；IVa2IVa2和和VAVA均为病毒均为病毒RNARNA聚合酶的亚基编码基因。聚合酶的亚基编

15、码基因。E3E3区缺失只会影响病毒颗粒区缺失只会影响病毒颗粒的成熟，不影响基因组的复制功能，因而在构建载体时往往除去这个的成熟，不影响基因组的复制功能，因而在构建载体时往往除去这个2.2 2.2 kbkb的片段的片段，使得载体的装载量提高到使得载体的装载量提高到4 4 kbkb以上。以上。第14页，此课件共42页哦人腺病毒人腺病毒DNADNA基因重排低基因重排低 外源基因与病毒外源基因与病毒DNADNA重组后能稳定复制几个周期重组后能稳定复制几个周期腺病毒DNA载体的特点安全性能好安全性能好 不整合人的染色体不整合人的染色体DNADNA，不会导致恶性肿瘤，不会导致恶性肿瘤宿主范围广宿主范围广

16、对受体细胞是否处于分裂期要求不严格对受体细胞是否处于分裂期要求不严格使用效果好使用效果好 外源基因在载体上容易高效表达外源基因在载体上容易高效表达第15页，此课件共42页哦猴多瘤病毒猴多瘤病毒DNADNA（SV40SV40）SV40SV40属于乳多瘤病毒科多瘤病毒属，呈小型二十面体，由属于乳多瘤病毒科多瘤病毒属，呈小型二十面体，由VP1VP1、VP2VP2、VP3VP3三种衣壳蛋白包装而成，基因组为三种衣壳蛋白包装而成，基因组为52245224bpbp的双链环状的双链环状DNADNASV40的生物学特性SV40SV40可以与所有哺乳动物宿主细胞中的组蛋白可以与所有哺乳动物宿主细胞中的组蛋白H2

17、H2、H3H3、H4H4结合，从结合，从而使其而使其DNADNA形成类似核小体的形成类似核小体的微型染色体微型染色体结构。结构。SV40SV40感染猴细胞时呈裂解型，不致癌；但感染啮齿类动物后，感染猴细胞时呈裂解型，不致癌；但感染啮齿类动物后，便发生便发生非同源整合非同源整合而致癌。而致癌。第16页，此课件共42页哦猴多瘤病毒猴多瘤病毒DNADNA（SV40SV40）SV40的基因组DNA t t/T T基因编码病毒的小抗原和大基因编码病毒的小抗原和大SV40 DNASV40 DNAorioriVP2VP2TTVP3VP3VP1VP1t t抗原与病毒的致癌作用密切相关抗原与病毒的致癌作用密切相

18、关 SV40SV40在裂解宿主细胞前的晚期在裂解宿主细胞前的晚期状态时，每个状态时，每个宿主细胞含有宿主细胞含有105105个病个病毒毒DNADNA拷贝，因此十分适合用于高效拷贝，因此十分适合用于高效表达外源蛋白表达外源蛋白第17页，此课件共42页哦猴多瘤病毒猴多瘤病毒DNADNA（SV40SV40）SV40 DNA-质粒DNA杂合载体的构建 重组的重组的SV40 DNASV40 DNA分子必须经过分子必须经过包装后才具有感染能力，因此插入的包装后才具有感染能力，因此插入的外源外源DNADNA片段不能太大。为了尽量提片段不能太大。为了尽量提高高SV40SV40的装载量，必须删除一些基因的装载量

19、，必须删除一些基因片段，因此重组的片段，因此重组的SV40SV40分子必须与野分子必须与野生型病毒共感染受体细胞，才能形成生型病毒共感染受体细胞，才能形成有感染力的重组病毒颗粒。有感染力的重组病毒颗粒。ApAprrorioriviral geneviral genegptgptSV40 oriSV40 oripV2-GPTpV2-GPTpBR322pBR322pBR322pBR322SV40 SV40 pV2-GPT pV2-GPT是一种是一种SV40 DNASV40 DNA与大肠杆菌质粒与大肠杆菌质粒DNADNA杂合的载体，其杂合的载体，其中中gptgpt为细菌来源的为细菌来源的谷氨酸谷氨酸

20、-丙氨酸转氨酶基因丙氨酸转氨酶基因，用于筛选重组子。该，用于筛选重组子。该载体曾被成功地用于在猴肾细胞中表达有生物活性的兔载体曾被成功地用于在猴肾细胞中表达有生物活性的兔b b-珠蛋白珠蛋白.第18页，此课件共42页哦猴多瘤病毒猴多瘤病毒DNADNA（SV40SV40）利用SV40 DNA载体表达外源基因的程序SV40 SV40 载体载体病毒晚期基因启动子病毒晚期基因启动子筛选标记筛选标记oriori缺陷的缺陷的SV40 SV40 辅助病毒辅助病毒去除细菌序列去除细菌序列插入外源基因插入外源基因重组分子重组分子分离病毒分离病毒DNADNA转化转化筛选筛选增殖增殖感染感染第19页，此课件共42页

21、哦猴多瘤病毒猴多瘤病毒DNADNA（SV40SV40）基因表达好基因表达好 外源基因能高效表达外源基因能高效表达SV40 DNA载体的特点基因重排高基因重排高 病毒基因组和重组分子常发生重排和缺失现象病毒基因组和重组分子常发生重排和缺失现象宿主范围窄宿主范围窄 只能转染猴细胞只能转染猴细胞装载量较小装载量较小第20页，此课件共42页哦人乳多瘤病毒人乳多瘤病毒DNADNA（BKVBKV）人乳多瘤人乳多瘤病毒（病毒（BKVBKV）属于）属于乳多瘤乳多瘤病毒科乳头瘤病毒属，其基因病毒科乳头瘤病毒属，其基因组为双链组为双链DNADNA，感染宿主细胞后基因不发生整合，独立于染色体而自，感染宿主细胞后基因

22、不发生整合，独立于染色体而自人乳多瘤病毒的生物学特性主复制，每个宿主细胞最高可达主复制，每个宿主细胞最高可达500500个拷贝个拷贝第21页，此课件共42页哦人乳多瘤病毒人乳多瘤病毒DNADNA（BKVBKV）人乳多瘤病毒表达载体的构建BKV-E.coliBKV-E.coli 穿梭载体穿梭载体BKVBKV ori oriBKVBKV gene geneDREDREMMTPMMTPAp Ap rrE.coliE.coli ori oriSV40 PSV40 PNeo Neo rr删除编码病毒核心蛋白和外壳蛋白的删除编码病毒核心蛋白和外壳蛋白的基因，并与大肠杆菌质粒拼接，构成基因，并与大肠杆菌质粒

23、拼接，构成穿梭载体，它不能整合，同时也不能穿梭载体，它不能整合，同时也不能形成成熟的病毒颗粒裂解受体细胞。形成成熟的病毒颗粒裂解受体细胞。安装细胞色素安装细胞色素P450 dioxinP450 dioxin介导的增强介导的增强子子DREDRE，控制小鼠乳腺癌启动子，控制小鼠乳腺癌启动子MMTPMMTP，由其带动外源基因的表达。，由其带动外源基因的表达。SV40SV40来源的启动子控制来源的启动子控制NeoNeorr 标记基因，以标记基因，以G418G418筛选重组子。筛选重组子。以此载体在人细胞系中表达以此载体在人细胞系中表达b b1-1-干扰素和单纯疱疹病毒干扰素和单纯疱疹病毒B B蛋白获得

24、成功。蛋白获得成功。第22页，此课件共42页哦人牛痘病毒人牛痘病毒DNADNA 人牛痘人牛痘病毒是一个大型病毒是一个大型DNADNA病毒，基因组长病毒，基因组长185 185 kbkb，能在宿主细，能在宿主细胞质中自主复制。以前外源基因插在病毒基因组的非必需区内，构建胞质中自主复制。以前外源基因插在病毒基因组的非必需区内，构建人牛痘病毒的生物学特性出的重组病毒具有感染力，而且一经转染，外源基因即可在最邻近的出的重组病毒具有感染力，而且一经转染，外源基因即可在最邻近的病毒启动子的控制下高效表达。然而由于病毒启动子的控制下高效表达。然而由于牛痘牛痘病毒基因组较大，体外病毒基因组较大，体外DNADN

25、A重组很困难，因此通常采用体内重组的方式进行。重组很困难，因此通常采用体内重组的方式进行。第23页，此课件共42页哦人牛痘病毒人牛痘病毒DNADNA 目前广泛使用的牛痘病毒表达系统是一种预先构建好的重组病毒目前广泛使用的牛痘病毒表达系统是一种预先构建好的重组病毒其基因组上插入了一个可表达的大肠杆菌其基因组上插入了一个可表达的大肠杆菌T7RNAT7RNA聚合酶聚合酶编码基因。在编码基因。在人牛痘病毒DNA表达载体的构建外源基因导入受体细胞之前，先以上述的重组病毒感染细胞，使其大外源基因导入受体细胞之前，先以上述的重组病毒感染细胞，使其大量表达量表达T7RNAT7RNA聚合酶，然后再将含有外源基因

26、和聚合酶，然后再将含有外源基因和T7T7启动子的细菌型重启动子的细菌型重组质粒导入哺乳动物受体细胞，此时外源基因整合在受体细胞染色体组质粒导入哺乳动物受体细胞，此时外源基因整合在受体细胞染色体DNADNA上，并在上，并在T7RNAT7RNA聚合酶的作用下表达出重组蛋白。聚合酶的作用下表达出重组蛋白。人囊状纤维化基因就是采用这种战略高效表达的。人囊状纤维化基因就是采用这种战略高效表达的。第24页，此课件共42页哦人牛痘病毒人牛痘病毒DNADNA利用人牛痘病毒载体表达外源基因的程序牛痘病毒牛痘病毒启动子启动子T7 RNAT7 RNA聚合酶基因聚合酶基因T7T7启动子启动子外源基因外源基因细菌重组质

27、粒细菌重组质粒感染感染转化转化培养培养收集收集第25页，此课件共42页哦D D 高等哺乳动物的基因转移高等哺乳动物的基因转移8 8 哺乳动物基因工程哺乳动物基因工程哺乳动物细胞的物理转化法哺乳动物细胞的物理转化法哺乳动物细胞的病毒转染法哺乳动物细胞的病毒转染法第26页，此课件共42页哦哺乳动物细胞的物理转化法哺乳动物细胞的物理转化法 利用物理方法转化高等哺乳动物细胞的主要优点是外源基因表达利用物理方法转化高等哺乳动物细胞的主要优点是外源基因表达盒中不含任何病毒基因序列，这对外源基因表达产物的分离纯化减轻盒中不含任何病毒基因序列，这对外源基因表达产物的分离纯化减轻了负担。但了负担。但外源基因表达

28、外源基因表达盒进入受体细胞后，往往以多拷贝的形式随盒进入受体细胞后，往往以多拷贝的形式随机整合在染色体机整合在染色体DNADNA上，导致受体细胞基因灭活、外源基因不表达。上，导致受体细胞基因灭活、外源基因不表达。第27页，此课件共42页哦哺乳动物细胞的物理转化法哺乳动物细胞的物理转化法 将待转化的将待转化的DNADNA溶解在磷酸缓冲液中，加入溶解在磷酸缓冲液中，加入CaClCaCl22溶液混匀，此溶液混匀，此时时DNADNA被包裹在磷酸钙晶体颗粒内；被包裹在磷酸钙晶体颗粒内；此时细胞膜形成吞噬泡，此时细胞膜形成吞噬泡，磷酸钙晶体局部溶解膜结构，磷酸钙晶体局部溶解膜结构，DNADNA便进入受便进

29、入受体细胞；体细胞；磷酸钙共沉淀法 将上述制备的颗粒悬浮液滴入细胞培养皿中，将上述制备的颗粒悬浮液滴入细胞培养皿中，3737保温保温4-164-16小时小时 弃去弃去DNADNA溶液，加入新鲜培养基，继续培养溶液，加入新鲜培养基，继续培养7 7天即可筛选转化株。天即可筛选转化株。如果在外源如果在外源DNADNA中掺入少量的受体细胞内源性中掺入少量的受体细胞内源性DNADNA可以提高转化可以提高转化效率。利用磷酸钙共沉淀法转化肿瘤病毒效率。利用磷酸钙共沉淀法转化肿瘤病毒DNADNA，可使正常细胞转化为，可使正常细胞转化为癌细胞，这是人们对肿瘤发生机制的最早理解。癌细胞，这是人们对肿瘤发生机制的最

30、早理解。第28页，此课件共42页哦哺乳动物细胞的物理转化法哺乳动物细胞的物理转化法 将待转化的将待转化的DNADNA溶解受体细胞悬浮液中，然后加入电击转化仪的溶解受体细胞悬浮液中，然后加入电击转化仪的样品槽内，两端施加瞬时高压电场，使细胞膜产生细小的缝隙，此时样品槽内，两端施加瞬时高压电场，使细胞膜产生细小的缝隙，此时 电击转化法常用于对磷酸钙共沉淀法无效的细胞类型，如生长在电击转化法常用于对磷酸钙共沉淀法无效的细胞类型，如生长在悬浮液中的淋巴细胞等。悬浮液中的淋巴细胞等。电击转化法DNADNA片段便可不经过胞饮作用直接进入受体细胞。片段便可不经过胞饮作用直接进入受体细胞。第29页，此课件共4

31、2页哦哺乳动物细胞的物理转化法哺乳动物细胞的物理转化法 将待转化的将待转化的DNADNA溶解与天然或人工合成的磷脂混合，后者在表面溶解与天然或人工合成的磷脂混合，后者在表面活性剂的存在下形成包埋水相活性剂的存在下形成包埋水相DNADNA的的脂质体脂质体结构。结构。合，合，DNADNA随即进入胞质和核内。随即进入胞质和核内。利用上述程序曾将外源基因成功地导入了小鼠的淋巴细胞和利用上述程序曾将外源基因成功地导入了小鼠的淋巴细胞和HeLaHeLa脂质体介导法 将这种将这种脂质体悬浮液加入到细胞培养液中，便会与受体细胞膜融脂质体悬浮液加入到细胞培养液中，便会与受体细胞膜融细胞。细胞。第30页，此课件共

32、42页哦哺乳动物细胞的物理转化法哺乳动物细胞的物理转化法 通过激素疗法使雌鼠超数排卵，并与雄性小鼠交配，然后杀死雌通过激素疗法使雌鼠超数排卵，并与雄性小鼠交配，然后杀死雌鼠，从其输卵管内取出受精卵；鼠，从其输卵管内取出受精卵；性原核内。性原核内。上述程序多用于动物个体的转基因过程，由于必须单细胞逐一操上述程序多用于动物个体的转基因过程，由于必须单细胞逐一操显微注射法 借助于显微镜将纯化的借助于显微镜将纯化的DNADNA溶液迅速注入到受精卵中变大了的雄溶液迅速注入到受精卵中变大了的雄作，所以不太适用于基因的克隆和表达。作，所以不太适用于基因的克隆和表达。第31页，此课件共42页哦哺乳动物细胞的物

33、理转化法哺乳动物细胞的物理转化法 血影细胞血影细胞是指哺乳动物的红细胞在机械作用、病毒诱导、低渗环是指哺乳动物的红细胞在机械作用、病毒诱导、低渗环境下发生溶血，血红蛋白大量溢出，最后形成仅被细胞膜包裹的细胞境下发生溶血，血红蛋白大量溢出，最后形成仅被细胞膜包裹的细胞同时，外源同时，外源DNADNA也容易进入。当上述外界条件消失后，红细胞膜又可也容易进入。当上述外界条件消失后，红细胞膜又可恢复原来的通透性。因此，可先将外源恢复原来的通透性。因此，可先将外源DNADNA转入转入血影细胞，然后再将血影细胞，然后再将血影细胞介导法核结构。在核结构。在溶血过程中，红细胞膜的通透性大增，在血红蛋白溢出的溶

34、血过程中，红细胞膜的通透性大增，在血红蛋白溢出的血影细胞与受体细胞在适当条件下发生融合，从而将外源血影细胞与受体细胞在适当条件下发生融合，从而将外源DNADNA转入受转入受体细胞。体细胞。第32页，此课件共42页哦哺乳动物细胞的病毒转染法哺乳动物细胞的病毒转染法 以病毒以病毒DNADNA为载体可以将外源基因直接转染或与野生型病毒颗粒为载体可以将外源基因直接转染或与野生型病毒颗粒共转染特定的受体细胞。这种方法具有定向性好、实验重复性佳、导共转染特定的受体细胞。这种方法具有定向性好、实验重复性佳、导入效率高等优点，但也存在一定的缺陷，如目前常用的载体宿主范围入效率高等优点，但也存在一定的缺陷，如目

35、前常用的载体宿主范围有限，往往无法转染一些具有重要经济价值的家禽和牲畜细胞等。有限，往往无法转染一些具有重要经济价值的家禽和牲畜细胞等。第33页，此课件共42页哦E E 利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白8 8 哺乳动物基因工程哺乳动物基因工程哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小鼠抗体利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小鼠抗体利用哺乳动物工程细胞生产人组织型纤溶酶原激活剂利用哺乳动物工程细胞生产人组织型纤溶酶原激活剂利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因子利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因子VIIIV

36、III第34页，此课件共42页哦哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理 基因扩增是外源基因在哺乳动物细胞内高效稳定表达的一种特殊基因扩增是外源基因在哺乳动物细胞内高效稳定表达的一种特殊方式。方式。氨甲喋呤氨甲喋呤（MTXMTX）是动物细胞中的关键代谢酶）是动物细胞中的关键代谢酶二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中，数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中，dhfrdhfr基因均得以扩基因均得以扩增。这些抗性细胞正是通过增加相关基因的拷贝数、提高关键代谢酶增。这些抗性细胞正是通过增加相关基因的拷贝数、提高关键代谢酶通过强化

37、基因扩增高效表达外源基因（DHFRDHFR）的特异性抑制剂，细胞培养物经）的特异性抑制剂，细胞培养物经氨甲喋呤氨甲喋呤处理后，绝大多处理后，绝大多的表达水平，从而抵消的表达水平，从而抵消氨甲喋呤氨甲喋呤的抑制效应。更重要的是，扩增的区的抑制效应。更重要的是，扩增的区哺乳动物细胞内的基因扩增现象哺乳动物细胞内的基因扩增现象域远远大于域远远大于dhfrdhfr基因本身，即与基因本身，即与dhfrdhfr基因相邻的基因相邻的DNADNA区域同时被扩增。区域同时被扩增。第35页，此课件共42页哦哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理通过强化基因扩增高效表达外源基因

38、DHFR-MTXDHFR-MTX高效表达系统高效表达系统外源基因外源基因dhfrdhfr转染转染dhfr dhfr-细胞系细胞系单克隆单克隆培养培养转移转移0.05 0.05 m mm mM MTXM MTX培养培养单克隆单克隆转移转移培养培养单克隆单克隆转移转移5 5 m mm mM MTXM MTX0.25 0.25 m mm mM MTXM MTX培养培养单克隆单克隆外源基因扩增至外源基因扩增至100100拷贝拷贝第36页，此课件共42页哦哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理通过强化基因扩增高效表达外源基因GS-MSXGS-MSX高效表达系统高效表

39、达系统 谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺合成酶（GSGS）能解除）能解除甲硫氨酸亚砜甲硫氨酸亚砜（MSXMSX）对动物细）对动物细胞的毒害作用。先将带有胞的毒害作用。先将带有GSGS编码基因编码基因的载体转入培养的哺乳动物细的载体转入培养的哺乳动物细中不必使用中不必使用GSGS缺陷型的受体细胞，而且在正常的缺陷型的受体细胞，而且在正常的MSXMSX浓度下就能筛浓度下就能筛选到含有高拷贝外源基因的转染细胞，这是选到含有高拷贝外源基因的转染细胞，这是GS-MSXGS-MSX系统比系统比DHFR-DHFR-胞中，由于只有多拷贝的胞中，由于只有多拷贝的GSGS编码基因才能抗编码基因才能抗MSXMSX，所以在转染

40、过程，所以在转染过程MTXMTX系统优越之处。系统优越之处。第37页，此课件共42页哦哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理通过强化基因转录高效表达外源基因 在载体上安装病毒或细胞来源的强启在载体上安装病毒或细胞来源的强启Ap Ap rrM13 oriM13 oriColE1 oriColE1 oriCMVPCMVPPolylinkerPolylinkerGeneGeneIntronIntronSV40 TSV40 TPolyA signalPolyA signal高效表达载体高效表达载体mRNAmRNA前体前体AAAAAAAAAAAAAAAAAAmRNA

41、mRNA动子以及有效的翻译元件，也是使外源基动子以及有效的翻译元件，也是使外源基因高效表达的一种手段，如：因高效表达的一种手段，如：细胞巨化病毒细胞巨化病毒CMVCMV的启动子的启动子 动物珠蛋白基因的动物珠蛋白基因的内含子内含子 SV40 SV40的的终止子终止子和和polyApolyA化化信号序列信号序列 绝大多数哺乳动物细胞的表达型载体绝大多数哺乳动物细胞的表达型载体上携带内含子结构，因为上携带内含子结构，因为mRNAmRNA前体的剪前体的剪切能促进成熟切能促进成熟mRNAmRNA向胞质的运输，有利向胞质的运输，有利于翻译。有的还含有各种信号肽序列。于翻译。有的还含有各种信号肽序列。第3

42、8页，此课件共42页哦哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理利用哺乳动物工程细胞生产的重组蛋白 迄今为止，已有大约迄今为止，已有大约300300种重组蛋白药物正在进行临床试验，但种重组蛋白药物正在进行临床试验，但在哺乳动物工程细胞中大规模生产的只有少数几种：在哺乳动物工程细胞中大规模生产的只有少数几种：b b 干扰素干扰素g g 干扰素干扰素凝血因子凝血因子VIIIVIII凝血因子凝血因子IXIX促红细胞生成素（促红细胞生成素（EPOEPO）生长因子（生长因子（hGHhGH）白介素白介素 2 2（IL-2IL-2）乙型肝炎表面抗原乙型肝炎表面抗原单克隆抗体

43、单克隆抗体 CD4CD4受体受体组织型纤溶酶原激活剂（组织型纤溶酶原激活剂（tPAtPA）第39页，此课件共42页哦利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小鼠抗体利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小鼠抗体大多数恶性淋巴大多数恶性淋巴NeoNeorr鼠金属硫蛋白启动子鼠金属硫蛋白启动子bb 肌动蛋白启动子肌动蛋白启动子抗体轻链抗体轻链cDNAcDNAbb 肌动蛋白终止子肌动蛋白终止子pLpLdhfrdhfrSV40SV40启动子启动子bb 肌动蛋白启动子肌动蛋白启动子抗体重链抗体重链cDNAcDNAbb 肌动蛋白终止子肌动蛋白终止子pHpH瘤细胞表面上都瘤细胞表面上都有一种特异性的有一种特异性的糖蛋白糖

44、蛋白campathcampath用人源化的小鼠用人源化的小鼠抗抗campathcampath抗体抗体治疗非霍金淋巴治疗非霍金淋巴细胞瘤患者，效细胞瘤患者，效果良好。重组抗果良好。重组抗体采用体采用DHFR-MDHFR-MTXTX系统表达。系统表达。第40页，此课件共42页哦利用哺乳动物工程细胞生产人组织纤溶酶原激活剂利用哺乳动物工程细胞生产人组织纤溶酶原激活剂 第一个由重组哺乳动物第一个由重组哺乳动物dhfrdhfr启动子启动子人人tPA cDNAtPA cDNA终止子终止子细胞规模化生产的医用蛋白细胞规模化生产的医用蛋白是治疗急性心肌梗塞的溶血是治疗急性心肌梗塞的溶血栓药物：栓药物：人组织纤

45、溶酶原激人组织纤溶酶原激活剂活剂（tPAtPA）。同样采用）。同样采用DHFR-MTXDHFR-MTX系统表达，受体系统表达，受体细胞选用细胞选用CHOCHO系统。目前，系统。目前，用该工艺路线生产的重组人用该工艺路线生产的重组人tPAtPA已经商品化。已经商品化。信号肽编码序列信号肽编码序列 此外，人此外，人tPAtPA也可由重组大肠杆菌生产，但蛋白的重折叠效率低。也可由重组大肠杆菌生产，但蛋白的重折叠效率低。第41页，此课件共42页哦利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因子利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因子VIIIVIII 凝血因子凝血因子VIIIVIII编码基因的缺陷与血友病密切相关。多年来，

46、血友病编码基因的缺陷与血友病密切相关。多年来，血友病用从人血中分离纯化的凝血因子用从人血中分离纯化的凝血因子VIIIVIII生物制品进行治疗，然生物制品进行治疗，然而由于人的血源污染乙肝病毒或爱滋病病毒，数千名使用这种血液制而由于人的血源污染乙肝病毒或爱滋病病毒，数千名使用这种血液制品的血友病人惨遭感染，其中品的血友病人惨遭感染，其中10%10%的病人最终死于爱滋病而非血友病。的病人最终死于爱滋病而非血友病。早在上述情况发生之前，人凝血因子早在上述情况发生之前，人凝血因子VIIIVIII的的cDNAcDNA便已被克隆和鉴便已被克隆和鉴定，血源的污染则加速了利用基因工程技术生产该药物的进程。与定，血源的污染则加速了利用基因工程技术生产该药物的进程。与tPAtPA相似，人凝血因子相似，人凝血因子VIIIVIII也是一种结构复杂的大分子，必须通过重组哺乳也是一种结构复杂的大分子，必须通过重组哺乳动物细胞生产，但目前商品化了的重组人凝血因子动物细胞生产，但目前商品化了的重组人凝血因子VIIIVIII尚不能满足几代尚不能满足几代血友病人的大量需求。血友病人的大量需求。第42页，此课件共42页哦