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1、荧光探针定量PCR技术在临床实验室诊断中的应用重庆医科大学附属第一医院检验科重庆医科大学附属第一医院检验科 胥飚胥飚38,200,000(PCR)8,800,000(周杰伦）内容提要一、基因诊断技术在医学检验中的地位一、基因诊断技术在医学检验中的地位二、荧光探针定量二、荧光探针定量PCR的技术特点的技术特点三、荧光探针定量三、荧光探针定量PCR在临床医学中的应用在临床医学中的应用临床实验医学发展 三个时代三个时代 标志技术标志技术 性质性质生化诊断时代生化诊断时代 生化分析生化分析 表象表象免疫学诊断时代免疫学诊断时代 酶免、放免酶免、放免 表象表象分子分子(基因基因)诊断时代诊断时代 基因体
2、外扩增基因体外扩增(PCR)本质本质基因诊断技术的发展及在临床诊断中的地位 基因诊断（分子诊断）：以核酸作为诊断的物质基础基因诊断（分子诊断）：以核酸作为诊断的物质基础 主要包括：主要包括：遗传性疾病遗传性疾病 有遗传趋向疾病的连锁分析有遗传趋向疾病的连锁分析 疾病及肿瘤易感基因的分析疾病及肿瘤易感基因的分析 病原体的检测病原体的检测 亲子鉴定和个人认定亲子鉴定和个人认定 人类基因组计划（人类基因组计划（HGP）与基因诊断）与基因诊断 基因诊断技术：基因诊断技术：PCR技术为其标志性技术技术为其标志性技术聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCRPCR）PCR：Polymerase Chain Rea
3、ction基因体外扩增技术Saiki PK 等 1985年 Science 230：1350Mullis K 1993年 诺贝尔化学奖PCR循环次数与循环次数与DNA产量关系产量关系循环次数 DNA的链数1 22-2 22 23-2 63 24-2 1410 211-2 204615 216-2 6553420 221-2 209715025 226-2 67,108,86430 231-2 2,147,483,646荧光探针定量PCR的技术特点第一代第一代PCR技术：变性、退火、延伸技术：变性、退火、延伸 结果判断：电泳结果判断：电泳 缺点：假阳性（污染）、缺点：假阳性（污染）、假阴性（灵敏
4、度低）假阴性（灵敏度低）定性检测定性检测第二代第二代PCR技术：常规技术：常规PCR+探针探针 例如：荧光探针例如：荧光探针PCR技术技术 PCR-ELISAll 荧光探针定量荧光探针定量PCR技术的技术的原理原理及过程及过程分分 子子 学学 基基 础：常规础：常规PCR+荧光探针（荧光探针（TaqMan荧光探针荧光探针)酶酶 学学 基基 础：础：Taq酶的酶的5 3外切核酸酶活性外切核酸酶活性荧光化学基础：荧光报告基团和淬灭基团标记探针荧光化学基础：荧光报告基团和淬灭基团标记探针 荧光共振能量转移原理荧光共振能量转移原理(FRET)Ct值值：C代表代表Cycle，t代表代表threshold
5、，其其 含义是：每个反应管内的荧光信号到达含义是：每个反应管内的荧光信号到达 设定的阈值时所经历的循环数。设定的阈值时所经历的循环数。l定定 量量 的的 实实 现现：l 1、荧光探针与扩增产物结合、荧光探针与扩增产物结合l 2、Taq酶外切作用，探针裂解，荧光酶外切作用，探针裂解，荧光 被激发被激发l 3、荧光信号的检测、荧光信号的检测l 4、荧光强度与定量核酸模板相关性、荧光强度与定量核酸模板相关性l 5、实时定量与终产物定量、实时定量与终产物定量l l l l荧光定量PCR技术的主要优点一、真正的样品原始核酸模板的准确定量一、真正的样品原始核酸模板的准确定量二、定量范围宽（二、定量范围宽（
6、01010/ml)，无需梯度稀释，无需梯度稀释三、封闭状态检测，避免扩增产物污染三、封闭状态检测，避免扩增产物污染四、探针使用使特异性更强四、探针使用使特异性更强五、光谱分析技术使敏感性更高五、光谱分析技术使敏感性更高六、仪器读数，结果判断客观真实六、仪器读数，结果判断客观真实七、无需七、无需PCR后处理，操作更简便、快速后处理，操作更简便、快速八、数据电脑管理，利于医院管理八、数据电脑管理，利于医院管理荧光定量荧光定量PCR技术检测的报告形式技术检测的报告形式一、报告形式：一、报告形式：荧光定量荧光定量PCR检测的报告以：检测的报告以：“拷贝数拷贝数”（copy)二、拷贝数的意义：二、拷贝数
7、的意义：表示原始标本内可供探针结合的核酸片段数量。表示原始标本内可供探针结合的核酸片段数量。三、拷贝数与病原体的关系：三、拷贝数与病原体的关系：拷贝数与病原体的数量成正相关拷贝数与病原体的数量成正相关 一般来说：细菌是单拷贝的，病毒是多拷贝的。一般来说：细菌是单拷贝的，病毒是多拷贝的。检测结果分析荧光定量荧光定量PCR检测结果的正常值？检测结果的正常值？外源基因：正常值：外源基因：正常值：0拷贝拷贝 0拷贝：根据临床表现拷贝：根据临床表现内源基因：正常值：参照正常细胞相关基因表达水平内源基因：正常值：参照正常细胞相关基因表达水平FQ-PCR在临床医学中的应用1、病原体的定量检测；、病原体的定量
8、检测；2、肿瘤基因和肿瘤标志物表达、肿瘤基因和肿瘤标志物表达(mRNA)的检测；的检测；3、遗传病基因的检测；、遗传病基因的检测；4、与疾病相关的各种蛋白质（细胞因子、酶、与疾病相关的各种蛋白质（细胞因子、酶、激素、受体）的基因表达的定量检测；激素、受体）的基因表达的定量检测；5、药物疗效的考核手段。、药物疗效的考核手段。6、建立病原体的分子诊断标准、建立病原体的分子诊断标准FQ-PCR在病原体检测中的应用一、肝炎病毒定量检测一、肝炎病毒定量检测二、优生优育相关项目检测二、优生优育相关项目检测三、结核杆菌及呼吸道病原体检测三、结核杆菌及呼吸道病原体检测四、性病病原体检测四、性病病原体检测129
9、129例例HBVHBV定量检测结果定量检测结果ELISA 总数总数 阳性例数阳性例数 阳性率阳性率 平均数量平均数量 范围范围大三阳大三阳 81 81 100%3.98 108/ml 2.0 1078.0 1010/ml小三阳小三阳 48 39 81%3.30 106/ml 1.2 1033.8 106/mlHBV病毒载量与乙肝感染各期病毒载量与乙肝感染各期 平均拷贝数平均拷贝数 HBeAg阳性慢性乙肝阳性慢性乙肝 47例例 8.3X108拷贝拷贝/ml 干扰素治疗后干扰素治疗后HBeAg转阴转阴 40例例 6.2X103 拷贝拷贝/ml 非活动性非活动性HBsAg携带者携带者 57例例 5.
10、6X103 拷贝拷贝/ml HBV阳性痊愈后阳性痊愈后12个月个月 42例例 0 拷贝拷贝/ml Clin Diagn Lab Immunol 2000 Mar;7(2)298-300 肝炎病毒载量与疗效肝炎病毒载量与疗效 有专家提出有专家提出103/ml做为临床治愈标准之一做为临床治愈标准之一 肝炎病毒载量与干扰素治疗肝炎病毒载量与干扰素治疗 Kato(93)：HCV高，干扰素不敏感高，干扰素不敏感 HCV低，干扰素敏感低，干扰素敏感 Marcellin(95)：HBV100pg/ml组：组：11/30转阴转阴 HBV 100pg/ml组：组：1/30转阴转阴 根据病毒载量选择药物根据病毒载
11、量选择药物 拉咪呋定有显著降低高病毒载量作用拉咪呋定有显著降低高病毒载量作用 筛选肝炎治疗药物筛选肝炎治疗药物 中医药的现代化研究中医药的现代化研究 肝炎病毒传播途径肝炎病毒传播途径 垂直传播（母婴）垂直传播（母婴）血清与唾液、乳汁和精液肝炎病毒量的相关性血清与唾液、乳汁和精液肝炎病毒量的相关性 肝炎病毒（基因型、载量）与肝癌发生的关系肝炎病毒（基因型、载量）与肝癌发生的关系HIV载量与传染 选择选择415对性伴侣（来自对性伴侣（来自15，127人）人）观察时间观察时间30个月；个月；男男 女女12.0%，女，女 男男11.8%；51对性伴侣（对性伴侣（1,500copies/millilit
12、er)没有证据没有证据 传染；传染；The New England Journal of Medicine 342:921,Mar 30,2000EB病毒载量与鼻咽癌 血浆血浆EBV载量与鼻咽癌显著相关载量与鼻咽癌显著相关 鼻咽癌病人血浆鼻咽癌病人血浆EBV与肿瘤复发相关与肿瘤复发相关 10个复发病人：个复发病人：32，250copies/ml 15个二年持续缓解病人：个二年持续缓解病人：0 copies/ml 17个随访病人：临床恶化前个随访病人：临床恶化前6月显著升高月显著升高 Cancer Res,1999 Nov,59:21,5452-5优生优育相关项目检测 引起宫内感染病原体的定量检
13、测引起宫内感染病原体的定量检测 母体病原体的量与宫内感染的关系母体病原体的量与宫内感染的关系 遗传病产前诊断遗传病产前诊断 胚胎胚胎植入前诊断植入前诊断FQPCR诊断TORCH综合征传统的传统的TORCH病原体：病原体：TOX,other,RV,CMV,HSV新近发现的新近发现的TORCH：麻疹：麻疹V、腮腺炎、腮腺炎V、水痘、水痘带状带状 庖疹庖疹V、肠道、肠道V、乙肝、乙肝V、丙肝、丙肝V、HPV、EBV、HIV、人疱疹、人疱疹V6、人微小病毒人微小病毒B19等等TORCH感染的实验室诊断一、组织培养：慢，费力，阳性率低一、组织培养：慢，费力，阳性率低二、血清学诊断：二、血清学诊断：IgG
14、：流行病学调查：流行病学调查 IgM：有一定的意义，但存在问题：有一定的意义，但存在问题：1、不能定量分析、不能定量分析 2、抗体的产生受多种因素的影响、抗体的产生受多种因素的影响 3、产生假阳性、产生假阳性三、基因诊断方法三、基因诊断方法原理：检测原理：检测TORCH病原体的核酸病原体的核酸优点：优点：1、客观指标、客观指标 2、敏感性、特异性高、敏感性、特异性高 3、定量指标、定量指标FQPCR在在TORCH诊断中的应用：诊断中的应用：1、筛选、筛选TORCH的患者的患者 2、建立、建立TORCH的分子诊断标准的分子诊断标准FQPCR在TORCH检测中的应用一一.FQPCR技术用于技术用于
15、TORCH抗体阳性者的检测抗体阳性者的检测二二.FQPCR技术用于技术用于TORCH病原体载量的检测病原体载量的检测三三.分析分析TORCH病原体载量与宫内感染的关系病原体载量与宫内感染的关系四四.建立本地区建立本地区TORCH病原体感染的分子诊断标准病原体感染的分子诊断标准FQPCR技术用于遗传性疾病的产前诊断一、等位基因的检测一、等位基因的检测 双色荧光分别标记正常和突变基因，判断正常、双色荧光分别标记正常和突变基因，判断正常、纯合子、杂合子纯合子、杂合子二、多基因遗传病的突变检测二、多基因遗传病的突变检测三、基因表达异常所致的遗传病三、基因表达异常所致的遗传病地中海贫血的基因诊断一、一、
16、地贫的诊断：地贫的诊断：检测检测 株蛋白基因（株蛋白基因（16号染色体）的缺失号染色体）的缺失二、二、地贫的诊断：地贫的诊断：1、扩增出、扩增出 株蛋白基因（株蛋白基因（11号染色体）的片段号染色体）的片段 2、反向斑点杂交、反向斑点杂交FQPCR技术用于性别鉴定FQPCR检测检测SRY基因：基因：取材：取材：1、孕妇外周血（胎儿性别鉴定）、孕妇外周血（胎儿性别鉴定）2、头发等（性别鉴定）、头发等（性别鉴定）注意事项：女性操作、阴阳性对照注意事项：女性操作、阴阳性对照 临床应用：伴性遗传病的检测临床应用：伴性遗传病的检测FQPCR技术检测21三体综合征 孕妇外周血中有胎儿的少量细胞孕妇外周血中
17、有胎儿的少量细胞 通过通过PCR技术检测孕妇外周血中的胎儿细胞技术检测孕妇外周血中的胎儿细胞Increased fetal DNA concentrations in the plasma of pregnant women carrying feruses with trisomy 21 Clin chem,1999 Oct,45:10,1749-51 FQPCR技术用于植入前诊断移入前诊断是第三代试管婴儿的核心技术移入前诊断是第三代试管婴儿的核心技术在胚胎分裂至在胚胎分裂至48细胞阶段时，取细胞阶段时，取12个细胞作筛选个细胞作筛选技术难点：细胞数少，获取核酸困难。需要高灵敏度技术难点：细
18、胞数少，获取核酸困难。需要高灵敏度 的检测方法的检测方法发展方向：筛选疾病基因、常见病基因、肿瘤基因等发展方向：筛选疾病基因、常见病基因、肿瘤基因等FQPCR双色及多色荧光标记技术的应用双色及多色荧光标记技术的应用FQPCR用于肺部感染的诊断一、肺一、肺炎支原体的检测：炎支原体的检测：二、肺炎衣原体的检测：二、肺炎衣原体的检测：意义：意义：1、快速诊断、快速诊断 2、治疗方案与细菌感染的治疗方案、治疗方案与细菌感染的治疗方案 不同不同FQPCR技术用于幽门螺杆菌（HP）的检测HP与慢性胃炎、胃溃疡、胃癌有密切的关系与慢性胃炎、胃溃疡、胃癌有密切的关系我国胃癌发病率高、发病年龄轻与我国胃癌发病率
19、高、发病年龄轻与HP的感染与关系的感染与关系方法：取胃活检标本方法：取胃活检标本 口腔标本口腔标本意义：意义：1、HP感染的诊断感染的诊断 2、探讨、探讨HP载量与治疗的关系载量与治疗的关系FQPCR技术对性传播疾病的检测一、梅毒螺旋体（一、梅毒螺旋体（TP）二、淋球菌（二、淋球菌（NG）三、沙眼衣原体、解脲脲原体（三、沙眼衣原体、解脲脲原体（CT、UU）四、单纯庖疹病毒（四、单纯庖疹病毒（HSV）五、乳头瘤病毒（五、乳头瘤病毒（HPV）六、人类免疫缺陷病毒（六、人类免疫缺陷病毒（HIV）七、其它病原体七、其它病原体FQPCR技术检测CT、UU 发病率最高的性传播疾病发病率最高的性传播疾病 治
20、疗与淋病完全不同治疗与淋病完全不同 FDA批准的批准的PCR检测试剂盒检测试剂盒 意义：可作为首选方法意义：可作为首选方法FQPCR技术检测HIV HIV载量与感染的发展和愈后载量与感染的发展和愈后 Bagnarell:(92)HIV量高量高,免疫缺陷症状严重、潜伏期短免疫缺陷症状严重、潜伏期短 Pantaleo(95)HIV量低，潜伏期长，症状轻量低，潜伏期长，症状轻 根据根据HIV量预测发病时间和预后量预测发病时间和预后FQ-PCR在肿瘤研究和诊断中的应用一、病毒感染与肿瘤一、病毒感染与肿瘤二、肿瘤相关基因的检测二、肿瘤相关基因的检测:常见癌基因常见癌基因C-erbB2、c-myc、N-m
21、yc、K-ras、int2、N-ras、Mdm2、C-fas、K-sam、Met.三、肿瘤标志物的三、肿瘤标志物的mRNA表达表达关于结核杆菌等关于结核杆菌等5项检测的项检测的 具体应用具体应用 概概 述述 用于临床用于临床PCR常规检测三条件：常规检测三条件：SDA批准使用的试剂盒批准使用的试剂盒 国家批准符合要求的实验室国家批准符合要求的实验室 经行政部门同意并培训后持证上岗经行政部门同意并培训后持证上岗 结核分枝杆菌结核分枝杆菌(TB)靶序列来源靶序列来源:a.单抗检出的单抗检出的TB抗原旦白编码基因抗原旦白编码基因 b.TB特异性核酸片段克隆特异性核酸片段克隆 c.插入序列插入序列实验
22、设计特点实验设计特点 结核的结核的PCR临床主要应用临床主要应用 a.结核与其他分枝杆菌区分结核与其他分枝杆菌区分 b.结核耐药基因结核耐药基因 c.对含菌量低的标本的分离对含菌量低的标本的分离 d.为临床可疑者捕捉信息为临床可疑者捕捉信息临床评价临床评价 沙眼衣原体沙眼衣原体(Ct)实验设计特点实验设计特点 靶及引物选择靶及引物选择 外膜蛋白基因外膜蛋白基因(MOMP-OMPI)7.5KD质粒质粒 隐蔽性基因质粒拷贝隐蔽性基因质粒拷贝 16srRNA基基因因临床评价临床评价 细胞培养细胞培养 McCoy.Hela-229金标准金标准 ELA法法 PCR法法.专家希望此法为新金标专家希望此法为
23、新金标 HBV-DNA临床评价：临床评价：1.一一 般临床靠免疫标志般临床靠免疫标志，但无法明确时可测但无法明确时可测2.拉米呋定、阿德福韦及干扰素治疗监测拉米呋定、阿德福韦及干扰素治疗监测3.新问题研究新问题研究 HCV-RNA 实验室设计特点实验室设计特点 需扩增二次需扩增二次 低温启动低温启动UDG系统系统-RNA不稳定性不稳定性注意事项注意事项 防止防止RNase污染污染 杜绝溶血杜绝溶血临床评估：临床评估：定性用于诊断定性用于诊断(只凭抗只凭抗HCV，无法，无法 决定病毒存在状况）决定病毒存在状况）定量用于治疗监测定量用于治疗监测 基因分型基因分型 HLA方法方法:免疫学免疫学 分子
24、生物学：分子生物学：PCR SSCP RFLP 基因芯片基因芯片I 类类(A,B,C)与疾病发生频率有关与疾病发生频率有关II 类类(DR,DQ,DP)等等 移植配型移植配型PCR在临床检验应用中的局限性差之毫厘，失之千里 1.要求高，影响因素多，严格遵守操作规范要求高，影响因素多，严格遵守操作规范 2.假阳性：实验条件设计欠佳；扩增产物或核酸提取中标假阳性：实验条件设计欠佳；扩增产物或核酸提取中标 本间的交叉污染本间的交叉污染 3.假阴性：在临床标本核酸提取过程中假阴性：在临床标本核酸提取过程中,靶核酸的丢失；靶核酸的丢失；提取试剂提取试剂(如有机溶剂等如有机溶剂等)的残留、标本中抑制的残留、标本中抑制 物的去除不彻底；扩增仪孔间温度差异物的去除不彻底；扩增仪孔间温度差异质量保证措施质量保证措施l防止假阳性：实验室首先要有严格的防止假阳性：实验室首先要有严格的分区；使用带滤心的吸头；阴性质控分区；使用带滤心的吸头；阴性质控样本应与临床标本一起处理样本应与临床标本一起处理,并适当散并适当散在分布于不同标本之间在分布于不同标本之间l防止假阴性：设立防止假阴性：设立“内标内标”l通过认证的参考品通过认证的参考品谢谢！晚安！