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1、兽用疫苗生用疫苗生产 一、一、兽用生物制品分用生物制品分类二、二、兽用疫苗的制用疫苗的制备技技术三、三、兽用用诊断断试剂的制的制备技技术四、四、兽用生物制品用生物制品检测技技术 一、一、兽用生物制品分用生物制品分类 兽用生物制品系指用天然或人工改造的微生物（用生物制品系指用天然或人工改造的微生物（细菌、菌、病毒、衣原体、病毒、衣原体、钩端螺旋体等）及其代端螺旋体等）及其代谢产物、寄生虫、物、寄生虫、动物血液或物血液或组织等等为原材料，采用生物学、分子生物学或原材料，采用生物学、分子生物学或生物化学等相生物化学等相应技技术制成的生物制制成的生物制剂，用于，用于预防、治防、治疗或或诊断畜禽疫病。断
2、畜禽疫病。11、按照性、按照性质和制造方法和制造方法疫（菌）苗、疫（菌）苗、类毒素、抗血毒素、抗血清、清、诊断制断制剂和微生和微生态制制剂等。等。22、按照作用与用途、按照作用与用途预防、防、诊断和治断和治疗用生物制品。用生物制品。（一）（一）预防用防用兽用生物制品用生物制品 将将细菌、病毒、寄生虫等接种于特殊基菌、病毒、寄生虫等接种于特殊基质进行培养，行培养，收收获其抗原其抗原单位或位或亚单位，或用人工合成的抗原位，或用人工合成的抗原单位或位或亚单位制位制备而成的活的或而成的活的或灭活的、具有特异性和免疫原性的活的、具有特异性和免疫原性的生物制品，用于生物制品，用于预防靶防靶动物的疾病。物的
3、疾病。预防用防用兽用生物制品包括：用生物制品包括：灭活疫苗、活疫苗、重活疫苗、活疫苗、重组亚单位疫苗、合成位疫苗、合成肽疫苗、基因缺失疫苗、重疫苗、基因缺失疫苗、重组活活载体疫体疫苗和核酸（苗和核酸（DNADNA）疫苗。）疫苗。1 1、灭活疫苗活疫苗(死疫苗死疫苗)1)1)强毒毒(菌菌)或弱毒（菌）或弱毒（菌）培养培养灭活或活或加加热纯化或化或浓缩佐佐剂或防腐或防腐剂。2)2)灭活的毒素或提取的活的毒素或提取的亚单位或位或rDNArDNA产生生亚单位。位。灭活疫苗活疫苗稳定、安全，便于运定、安全，便于运输和保存，和保存，易于提易于提纯纯化和制化和制备多价、多多价、多联苗。苗。但用量但用量较大、
4、接种次数多、免疫力大、接种次数多、免疫力产生慢、注射困生慢、注射困难、注射局部可能有反注射局部可能有反应等。等。2 2、活疫苗、活疫苗(弱毒疫苗弱毒疫苗)11）致弱的弱毒（菌、虫）株）致弱的弱毒（菌、虫）株动物、物、组织、细胞、胞、鸡胚或培养基胚或培养基培养培养降低毒力、保留降低毒力、保留免疫原性免疫原性筛选。22）自然弱（无）毒（菌、虫）株。）自然弱（无）毒（菌、虫）株。33）异种毒（菌、虫）株。）异种毒（菌、虫）株。44）基因工程改造弱毒株。）基因工程改造弱毒株。活疫苗活疫苗对原宿主原宿主动物无致病性或引起物无致病性或引起亚临床床感染，能感染，能产生主生主动免疫力，用量少、成本低、免免疫力
5、，用量少、成本低、免疫力疫力产生快、免疫期生快、免疫期长。但可能存在不安全。但可能存在不安全风险。3 3、重、重组亚单位疫苗位疫苗1 1）微生物）微生物物理和化学方法物理和化学方法提取有效抗原成分。提取有效抗原成分。22）病原）病原基因工程技基因工程技术保保护性抗原基因序列插入合适的表达性抗原基因序列插入合适的表达质粒粒高效高效稳定表达定表达生生产抗原抗原亚单位疫苗。位疫苗。4 4、合成、合成肽疫苗疫苗用化学方法人工合成多用化学方法人工合成多肽作作为抗抗原。原。纯度高、度高、稳定，但只能定，但只能线性性表达，不能折叠，免疫原性表达，不能折叠，免疫原性较差。差。5 5、基因缺失疫苗、基因缺失疫苗
6、病原体病原体基因工程方法基因工程方法缺失致缺失致病性基因或非必要糖蛋白病性基因或非必要糖蛋白保持免疫保持免疫原性原性降低致病性。疫苗毒力不易恢降低致病性。疫苗毒力不易恢复，复，稳定性好，可配合定性好，可配合鉴别诊断方法，断方法，区区别免疫免疫动物和自然感染物和自然感染动物。物。6 6、重、重组活活载体疫苗体疫苗病原保病原保护性抗原基因序列性抗原基因序列插入另一插入另一种无毒或弱毒的微生物基因种无毒或弱毒的微生物基因组表达表达构建重构建重组活活载体疫苗株。可以同体疫苗株。可以同时表达多种抗原，制成多价或多表达多种抗原，制成多价或多联疫苗，疫苗，毒力不返毒力不返强。7 7 7 7、核酸疫苗（基因或
7、、核酸疫苗（基因或、核酸疫苗（基因或、核酸疫苗（基因或DNADNADNADNA疫苗）疫苗）疫苗）疫苗）病原保病原保护性抗原基因性抗原基因连接接细菌或病毒菌或病毒DNADNA直接直接导入入动物体物体表达抗原表达抗原诱导产生免疫保生免疫保护。制。制造造简便、成本低、安全、免疫期便、成本低、安全、免疫期长、热稳定性好，但仍未商品化生定性好，但仍未商品化生产。（二）（二）诊断用制品断用制品1 1、常、常规免疫免疫 血清学血清学诊断技断技术（1 1）凝集）凝集试验抗原：抗原：直接凝集直接凝集试验（平板法、（平板法、试管法）：抗原和管法）：抗原和抗体混合后直接抗体混合后直接发生凝集反生凝集反应。间接凝集接
8、凝集试验（间接血凝、胶乳凝集和反相接血凝、胶乳凝集和反相间接血凝接血凝试验）。）。1 1、常、常规免疫免疫 血清学血清学诊断技断技术（2）免疫沉淀免疫沉淀试验抗原：包括抗原：包括试管沉淀法、管沉淀法、单相免疫相免疫扩散散试验和双相免疫和双相免疫扩散散试验、免疫、免疫电泳、泳、对流免疫流免疫电泳等。泳等。（3 3）中和）中和试验：将特异性血清与相：将特异性血清与相应病原混合，用血清病原混合，用血清 病毒混合物接种靶病毒混合物接种靶动物、物、鸡胚或胚或细胞培养，胞培养，观察感染情况察感染情况进行疾病行疾病诊断。断。（4 4）补体体结合合试验抗原：抗原抗体复合物可以激活抗原：抗原抗体复合物可以激活补
9、体，体，出出现各种生物学反各种生物学反应。1 1、常、常规免疫免疫 血清学血清学诊断技断技术（5 5）酶联免疫吸附免疫吸附试验（ELISAELISA）：包括直接法、）：包括直接法、间接法、接法、双抗体双抗体夹心、心、竞争争ELISAELISA等。等。（6 6）荧光抗体染色技光抗体染色技术：直接法、：直接法、间接法、接法、竞争法等。争法等。（7 7）胶体金免疫）胶体金免疫检测技技术。（8 8）免疫）免疫组化化诊断断试剂。2 2、生物技、生物技术和分子生物学和分子生物学诊断技断技术（1 1）生物技）生物技术：单克隆抗体技克隆抗体技术（荧光抗体染色技光抗体染色技术或或酶联免疫染色技免疫染色技术）。）
10、。（2 2）分子生物学技）分子生物学技术。PCRPCR（RTRTPCRPCR）扩增技增技术。荧光定量光定量PCRPCR（RTRTPCRPCR）。）。基于核酸序列基于核酸序列扩增技增技术（NASBANASBA）。）。核酸探核酸探针。（三）治（三）治疗及其他制品及其他制品1 1、抗血清：用抗原多次免疫、抗血清：用抗原多次免疫动物，提取血清制成，用于物，提取血清制成，用于治治疗或或预防防动物疾病。物疾病。2 2、微生、微生态制制剂：含活菌的制：含活菌的制剂，具有，具有调节机体菌群、增机体菌群、增强免疫力、促生免疫力、促生长等。等。3 3、卵黄抗体：用抗原多次免疫禽、卵黄抗体：用抗原多次免疫禽类，提取
11、卵黄抗体制成，提取卵黄抗体制成，用于治用于治疗或或预防防动物疾病。物疾病。4 4、干、干扰素：用病毒等素：用病毒等诱导产生干生干扰素。素。5 5、转移因子：用移因子：用动物物脏器或器或组织提取制成，作提取制成，作为非特异非特异性免疫性免疫调节剂，增，增强机体免疫力，提高生机体免疫力，提高生产性能。性能。二、二、兽用疫苗制用疫苗制备技技术（一）（一）兽用用灭活疫苗的制活疫苗的制备技技术 灭活疫苗是用菌（毒）种培养物或含毒活疫苗是用菌（毒）种培养物或含毒组织或或细胞培养物，胞培养物，经化学化学灭活活剂灭活或加活或加热处理，理，使微生物失去活性而保持免疫原性，再加入适当使微生物失去活性而保持免疫原性
12、，再加入适当的防腐的防腐剂或加入免疫佐或加入免疫佐剂制成。制成。1 1、菌（毒）种菌（毒）种1.11.1、菌（毒）种菌（毒）种标准准历史清楚；史清楚；生物学性状明生物学性状明显；遗传稳定；定；优良的免疫原性与反良的免疫原性与反应原性；原性；毒力在毒力在规定的范定的范围内。内。1.11.1、菌（毒）种菌（毒）种标准准原种原种细菌原种菌原种应规定其培养特性、生化特性、血清学特性、毒力和定其培养特性、生化特性、血清学特性、毒力和免疫原性等，并作免疫原性等，并作纯粹粹检查。病毒原种。病毒原种应规定其生物学特性、理化特定其生物学特性、理化特性、血清学特性、最小感染量、最小免疫量、安全性等，并性、血清学特
13、性、最小感染量、最小免疫量、安全性等，并纯粹。粹。基基础种子种子基基础种子由原种制种子由原种制备而来，基而来，基础种子种子为企企业生生产兽用生物用生物制品提供种子来源，制品提供种子来源，应作系作系统鉴定，并定，并规定代次。定代次。生生产种子种子生生产种子由生种子由生产企企业用基用基础种子种子进行复壮、繁殖。行复壮、繁殖。细菌等菌等生生产种子种子应作作纯粹粹检查。病毒生。病毒生产种子种子应作含量作含量测定和定和纯净检查。1.21.2、菌（毒）种、菌（毒）种选育育菌种的菌种的选育育分离病原分离病原纯粹粹检验致病性致病性鉴定和定和抗原性抗原性测定定设计制成制成灭活疫苗活疫苗接种接种实验室室动物物攻毒
14、攻毒用本用本动物物进行保行保护率率测定定以确定疫苗候以确定疫苗候选株。株。毒种的毒种的选育育弱毒毒种有天然弱毒株或人工致弱毒弱毒毒种有天然弱毒株或人工致弱毒株；株；强毒毒株分离毒毒株分离系系统鉴定（无定（无污染、毒力染、毒力强而而稳定、免疫原性好、抗原定、免疫原性好、抗原谱广、与流行毒血清型相广、与流行毒血清型相符）符）疫苗候疫苗候选株。株。1.31.3、菌（毒）种保存、菌（毒）种保存冷冷冻真空干燥法真空干燥法冻干的菌种一般在干的菌种一般在2828 C C保存；保存；冻干的毒种一般在干的毒种一般在-20-20 C C以下保存，以下保存，温度越低保存期越温度越低保存期越长。结冻保存保存有些病毒可
15、用含毒有些病毒可用含毒组织在低温条件下（在低温条件下（-2020 C C以下）。以下）。液氮保存液氮保存有些有些细胞胞结合毒合毒须在在196196 C C的液氮中保的液氮中保存。存。动物物继代保存代保存虫种一般通虫种一般通过动物物继代保存。代保存。1.41.4、菌（毒）种的管理、菌（毒）种的管理生生产检验用菌（毒）种用菌（毒）种实行分行分级管理制度，种子分管理制度，种子分三三级（原种、基（原种、基础种子和生种子和生产种子）。种子）。原种和由国家原种和由国家兽医微生物菌种保藏中心或分中心医微生物菌种保藏中心或分中心负责保管；基保管；基础种子由菌种中心或分中心种子由菌种中心或分中心负责制制备、鉴定
16、、保管和供定、保管和供应；生；生产种子由生种子由生产企企业自行制自行制备、鉴定和保管。定和保管。1.5、菌（毒）种索取与分菌（毒）种索取与分发 供供应：菌种中心及分中心：菌种中心及分中心统一供一供应。索取：索取：须持有相持有相应级别机构出具的正式公函，机构出具的正式公函，说明明菌种名称、型菌种名称、型别、数量及用途。一、二、数量及用途。一、二类菌种菌种时，必必须由省（市、自治区）由省（市、自治区）兽医行政主管部医行政主管部门审核，核，农业部批准后，方可供部批准后，方可供应。有。有产品批准文号者，可品批准文号者，可由生由生产企企业直接向菌种中心或分中心直接向菌种中心或分中心领取。取。要求：其他任
17、何要求：其他任何单位不得位不得转发生生产用菌（毒）种。用菌（毒）种。烈性烈性传染病或人畜共患染病或人畜共患传染病的染病的强毒菌（毒）种，毒菌（毒）种，必必须有有专职技技术人人员领取。取。1.21.2、病原培养、病原培养1.2.11.2.1细菌培养技菌培养技术细菌的繁殖是以二分裂法菌的繁殖是以二分裂法进行，分四个行，分四个时期：期：迟缓期（期（细菌菌处于静止适于静止适应状状态）；）；对数增殖期数增殖期（以恒定的速度增殖）；（以恒定的速度增殖）；稳定期（定期（细菌增加数与菌增加数与死亡数保存平衡）；衰退期（活菌数下降）。死亡数保存平衡）；衰退期（活菌数下降）。、细菌培养技菌培养技术需氧菌的培养需氧
18、菌的培养平板培养法平板培养法有平板划有平板划线培养法和培养法和倾注培养法。注培养法。需氧芽需氧芽孢菌的培养菌的培养将接种材料先接种于液体培养将接种材料先接种于液体培养基中，置水浴加入至基中，置水浴加入至8080 C C，维持持15152020分分钟，以，以杀死非芽死非芽孢菌，然后在菌，然后在3737 C C作增菌培养。作增菌培养。抑菌分离培养抑菌分离培养利用某些化学利用某些化学药品品对某某类细菌的抑菌的抑制或制或杀灭作用，而作用，而对另一些另一些细菌不生菌不生产明明显的作用，的作用，来分离培养某些来分离培养某些细菌。菌。接种接种试验动物物进行培养。行培养。、细菌培养技菌培养技术厌氧菌的培养氧菌
19、的培养生物学方法生物学方法在培养基中加入植物或在培养基中加入植物或动物物组织（如（如马铃薯、薯、发芽谷物、芽谷物、灭菌的新菌的新鲜动物物组织块），以消耗养气或使氧化），以消耗养气或使氧化还原原电势下下降。用降。用这些培养基培养些培养基培养厌氧菌氧菌时，先将培养，先将培养基煮沸基煮沸15153030分分钟，降温后在培养基表面加，降温后在培养基表面加一一层灭菌的液体石蜡，然后接种培养。菌的液体石蜡，然后接种培养。厌氧菌的培养氧菌的培养化学方法化学方法利用利用还原作用原作用强的化学物的化学物质，吸收，吸收环境或境或培养基内的养气或培养基内的养气或还原氧化型物原氧化型物质，降低氧化，降低氧化还原原电势
20、。物理学方法物理学方法利用加利用加热、密封、抽气等物理学方法，、密封、抽气等物理学方法，以以驱除或隔除或隔绝培养培养环境或培养基中的养气，形成无氧境或培养基中的养气，形成无氧状状态，以利于，以利于厌氧菌的生氧菌的生长。常用的有。常用的有厌氧罐法。氧罐法。含二氧化碳条件下的含二氧化碳条件下的含二氧化碳条件下的含二氧化碳条件下的细细菌培养菌培养菌培养菌培养有些有些细菌特菌特别是初次分离培养，在含有是初次分离培养，在含有5 51010CO2CO2环境下生境下生长良好，培养良好，培养时，可直接利用二氧化碳培养箱培养，按照需要，可直接利用二氧化碳培养箱培养，按照需要调节培养箱内二氧化碳的培养箱内二氧化碳
21、的浓度。度。在没有条件的在没有条件的实验室，室，简便的做法是用有盖玻璃容器，放入接便的做法是用有盖玻璃容器，放入接种的培养物后，点燃蜡种的培养物后，点燃蜡烛，加盖密，加盖密闭容器，由于燃容器，由于燃烧耗氧耗氧产生生二氧化碳，蜡二氧化碳，蜡烛即熄即熄灭。此。此时容器内含有容器内含有较高高浓度的二氧化碳，度的二氧化碳，将容器放入适宜温度培养。将容器放入适宜温度培养。、病毒培养基本技、病毒培养基本技术病毒是病毒是严格的格的细胞内寄生物，由于病毒缺乏自主复制的胞内寄生物，由于病毒缺乏自主复制的酶系系统，不能独自，不能独自进行物行物质代代谢，必，必须依依赖宿主宿主细胞或胞或细胞胞的某些成分合成核酸和蛋白
22、的某些成分合成核酸和蛋白质，所以只能在易感的，所以只能在易感的细胞内胞内以复制的方式以复制的方式进行增殖，而不能在任何无行增殖，而不能在任何无细胞的培养液内胞的培养液内生生长。除少数病毒外，大多数除少数病毒外，大多数动物病毒能在物病毒能在试验动物、受物、受精卵和精卵和细胞培养中增殖。胞培养中增殖。、病毒培养基本技、病毒培养基本技术病毒病毒细胞培养的胞培养的营养需求养需求1 1）无机离子）无机离子维持渗透持渗透压、提供、提供细胞胞酶与代与代谢活活动所需所需要的物要的物质，促，促进细胞胞贴壁等。常用弱碳酸壁等。常用弱碳酸氢盐来来调节培养培养液的液的pHpH值，培养液的，培养液的pHpH值一般一般维
23、持在。持在。2)2)碳水化合物碳水化合物常用的碳水化合物是葡萄糖。有些复常用的碳水化合物是葡萄糖。有些复杂的培养基，的培养基，还需添加其它糖需添加其它糖类或或简单的化合物如乳酸、丙的化合物如乳酸、丙酮酸及醋酸，或代替葡萄糖。酸及醋酸，或代替葡萄糖。3)3)氨基酸氨基酸细胞培养所用的氨基酸胞培养所用的氨基酸为左旋异构体。左旋异构体。维持持细胞生胞生长的最低的最低营养要求需要以下养要求需要以下1313种氨基酸。种氨基酸。病毒病毒细胞培养的胞培养的营养需求养需求4)4)维生素生素大部分大部分维生素与生素与细胞代胞代谢有关。使用有关。使用较多的多的维生素主要是生素主要是B B族族维生素，复生素，复杂的
24、培养液中的培养液中还含有含有还原原剂、谷胱甘谷胱甘肽、抗坏血酸及、抗坏血酸及L L半胱氨酸。在不含血清的培养半胱氨酸。在不含血清的培养液中，常含有脂溶性液中，常含有脂溶性维生素。生素。5)5)蛋白蛋白质 动物血清是蛋白物血清是蛋白质的主要来源，常用的有胎牛的主要来源，常用的有胎牛血清或血清或犊牛血清。血清起牛血清。血清起营养作用，保养作用，保护细胞或去毒，抑胞或去毒，抑制蛋白溶解制蛋白溶解酶，促，促进细胞在玻璃上附着和胞在玻璃上附着和铺开。开。6 6）抗生素）抗生素控制控制细胞培养中胞培养中细菌的菌的污染，常用的抗生素染，常用的抗生素有青霉素、有青霉素、链霉素、制霉菌素或两性霉素霉素、制霉菌素
25、或两性霉素B B。细胞培养技胞培养技术细胞培养胞培养类型型（1 1）原代）原代细胞胞原代原代细胞是用胞是用动物新物新鲜组织如胚胎或幼畜如胚胎或幼畜的的组织或受精卵，或受精卵，经胰蛋白胰蛋白酶消化分散后制消化分散后制备而成。病毒而成。病毒对原代原代细胞易感，繁殖滴度高，且无致瘤性等。但原代胞易感，繁殖滴度高，且无致瘤性等。但原代细胞不能在体外多次胞不能在体外多次传代，代，组织原材料的来源不固定，易混原材料的来源不固定，易混入外源病原，造成外源病毒入外源病原，造成外源病毒污染，不易控制其染，不易控制其质量，影响量，影响产品的品的纯净和安全性。和安全性。细胞培养胞培养类型型2 2）二倍体二倍体细胞株
26、胞株原代原代细胞胞次代次代细胞胞多次多次连续传代代成成为二倍体二倍体细胞。二倍体胞。二倍体细胞的胞的细胞形胞形态学可能学可能发生生变化，化，但但细胞染色体数与原代胞染色体数与原代细胞一胞一样。不能在体外无限制。不能在体外无限制传代，代，从几代至几十代，兼有原代从几代至几十代，兼有原代细胞和胞和传代代细胞的胞的优点，病毒点，病毒对其易感，其易感，质量可控，适用于繁殖病毒。量可控，适用于繁殖病毒。3 3）传代代细胞系胞系由由肿瘤瘤组织培养而成或由培养而成或由细胞株胞株转化而化而来。可在体外无限制的来。可在体外无限制的传代，其染色体数不正常，成代，其染色体数不正常，成为异异倍体。适宜于倍体。适宜于许
27、多多动物病毒的生物病毒的生长，易于培养，可以建立，易于培养，可以建立种子种子库，质量易控制。但存在潜在的致瘤性，要求背景情量易控制。但存在潜在的致瘤性，要求背景情况况应详细，并作系，并作系统鉴定合格后，方可用于繁殖病毒生定合格后，方可用于繁殖病毒生产灭活疫苗。活疫苗。各种各种各种各种传传代水平代水平代水平代水平细细胞系胞系胞系胞系检查检查检验项目检验项目主细胞库主细胞库工作工作细胞库细胞库最高限制最高限制代次细胞代次细胞高于最高代次高于最高代次1010代的细胞代的细胞显微镜检查显微镜检查细菌和霉菌细菌和霉菌支原体支原体病毒病毒细胞鉴别细胞鉴别胞核学检查胞核学检查致瘤和致癌性致瘤和致癌性传代代细
28、胞的保存胞的保存1)1)细胞保存胞保存收集新收集新鲜细胞，用胞，用细胞冷胞冷冻保保护液液(含含2020犊牛血牛血清、清、5 51010二甲基二甲基亚砜的的营养液养液)调整整细胞胞浓度达度达100100万一万一200200万万个个细胞胞m1m1，分装于安瓿中，封口，分装于安瓿中，封口，44预冷冷30min30min，封口，封口严密的密的安瓿移至安瓿移至-50-507070 C C冰箱中冰箱中预冷，然后移至液氮罐内冷，然后移至液氮罐内贮存，可保存，可保存数年。存数年。2)2)细胞复胞复苏将安瓶自液氮罐取出后立即放入将安瓶自液氮罐取出后立即放入37374040温水中，温水中，在在lminlmin之内
29、使之内使细胞融化，胞融化，换液培养至形成液培养至形成细胞胞单层。3)3)细胞运胞运输单层细胞培养瓶装胞培养瓶装满生生长液，以防液体振液，以防液体振荡冲脱冲脱细胞，或只留少量生胞，或只留少量生长液能覆盖液能覆盖单层，以防，以防细胞干燥。胞干燥。细胞胞悬液装于液装于冰盒保持温度在冰盒保持温度在15152525左右。左右。细胞培养方法胞培养方法1 1）静止培养）静止培养静止培养是指将制静止培养是指将制备好的好的细胞胞悬液分装在液分装在适宜的培养瓶中，密适宜的培养瓶中，密闭瓶口，置恒温培养箱内静止培养或瓶口，置恒温培养箱内静止培养或以松口的容器通入二氧化碳或在含二氧化碳的培养箱中静以松口的容器通入二氧
30、化碳或在含二氧化碳的培养箱中静止培养，形成止培养，形成细胞胞单层后，接种病毒后，接种病毒悬液，液，37373838 C C左左右右继续培养。培养。2 2）转动培养培养将制将制备好的好的细胞胞悬液分装在玻璃或塑料液分装在玻璃或塑料转瓶中，密瓶中，密闭瓶口，置瓶口，置转瓶机上，以每小瓶机上，以每小时5 51010转转动培培养，养，细胞在胞在转动培养培养时，贴附于瓶壁四周，附于瓶壁四周，长成成细胞胞单层后，接种病毒后，接种病毒悬液，液，37373838 C C左右左右继续转动培养。培养。细胞培养方法胞培养方法3 3）悬浮培养浮培养在在悬浮培养罐中通浮培养罐中通过不断不断搅拌，并随拌，并随时补充充营养
31、液和校正养液和校正pHpH值，使，使细胞在胞在悬浮的条件下培养生浮的条件下培养生长。由于由于悬浮培养浮培养细胞能及胞能及时得到充足的得到充足的营养和养气，养和养气，细胞生胞生长速度快，速度快，产量高，可以得到大量的量高，可以得到大量的细胞。胞。4 4）微）微载体培养体培养通通过搅拌使微拌使微载体体悬浮在培养液中，浮在培养液中，细胞通胞通过贴附在微附在微载体固体体固体颗粒表面上生粒表面上生长形成形成细胞胞单层，细胞的胞的浓度度较大、生大、生长快。微快。微载体培养可采用通气体培养可采用通气搅拌法，拌法，也可采用也可采用转瓶培养法瓶培养法进行。行。1.2.31.2.3鸡胚接种技胚接种技术鸡胚的胚的选
32、择必必须是来源于健康易感的种是来源于健康易感的种鸡群，其种蛋必群，其种蛋必须新新鲜，清，清洁。种。种鸡群必群必须定期定期监测，不得含有繁殖病毒，不得含有繁殖病毒的相的相应抗体。抗体。鸡胚接种途径和接种方法胚接种途径和接种方法1 1）尿囊腔途径）尿囊腔途径取取9 91111日日龄的的鸡胚，在灯光照射下，在胚，在灯光照射下，在离气室离气室约0.30.30.5cm0.5cm处无大血管的位置作一无大血管的位置作一标记，作，作为接接种部位，在气室和待接种部位各打一小孔，将受精卵横放种部位，在气室和待接种部位各打一小孔，将受精卵横放在蛋在蛋盘上，在待接种上，在待接种处垂直刺入垂直刺入针头约0.5cm0.5
33、cm，接种，接种0.050.050.2ml0.2ml病毒溶液，用石蜡封口，病毒溶液，用石蜡封口，继续孵化。也可将气室孵化。也可将气室向上放于蛋向上放于蛋盘中，在气室距中，在气室距边缘约0.5cm0.5cm处打一小孔。沿打一小孔。沿受精卵受精卵长径平行方向刺入径平行方向刺入针头约1cm1cm，注入接种物，注入接种物0.050.050.2ml0.2ml，用石蜡封孔，用石蜡封孔，继续孵化。孵化。鸡鸡胚接种途径和接种方法胚接种途径和接种方法胚接种途径和接种方法胚接种途径和接种方法2 2）绒毛尿囊膜途径毛尿囊膜途径在气室中心在气室中心钻一小孔，直接从气室一小孔，直接从气室处刺入刺入针头约0.5cm0.5
34、cm，滴入，滴入0.10.10.2ml0.2ml病毒溶液，病毒溶液，继续垂垂直刺入直刺入针头，穿，穿过卵膜和卵膜和绒毛尿囊膜，拔出毛尿囊膜，拔出针头。也可用。也可用人工气室法人工气室法进行，在胚胎附近行，在胚胎附近处和气室和气室处各打一小孔，然各打一小孔，然后用吸球后用吸球紧贴气室小孔气室小孔处轻轻吸气，造成吸气，造成负压，形成人工，形成人工气室，接种气室，接种0.10.10.2ml0.2ml病毒溶液，用石蜡封孔。病毒溶液，用石蜡封孔。3 3）卵黄囊途径）卵黄囊途径在气室中心在气室中心钻一小孔，垂直刺入一小孔，垂直刺入针头约3cm3cm，注入接种物，注入接种物0.20.20.5ml0.5ml，
35、用石蜡封口，用石蜡封口，继续孵化。孵化。也可在气室外和卵也可在气室外和卵长径的径的1/21/2处各打一小孔，并在中各打一小孔，并在中间孔孔处刺入刺入针头约1.5cm1.5cm，接种，接种0.10.10.5ml0.5ml病毒溶液，用石蜡病毒溶液，用石蜡封孔。封孔。鸡胚接种途径和接种方法胚接种途径和接种方法4 4）羊膜腔途径）羊膜腔途径将气室端靠近胚胎将气室端靠近胚胎侧的卵壳的卵壳锯穿，在卵穿，在卵膜上滴入一滴无菌液体石蜡或生理膜上滴入一滴无菌液体石蜡或生理盐水，避开血管，在气水，避开血管，在气室室处刺入刺入针头约0.5cm0.5cm，在气室内的卵膜上滴入，在气室内的卵膜上滴入0.10.10.2m
36、l0.2ml病毒溶液，病毒溶液，继续垂直刺入垂直刺入针头，穿，穿过卵膜和卵膜和绒毛尿毛尿囊膜，拔出囊膜，拔出针头。或在人工气室孔。或在人工气室孔处呈呈3030 角刺入角刺入针头约0.5cm0.5cm，接种，接种0.10.10.2ml0.2ml病毒溶液，用石蜡封孔。病毒溶液，用石蜡封孔。5 5）静脉途径）静脉途径画出直而粗的静脉画出直而粗的静脉处位置，卵壳，加一滴位置，卵壳，加一滴液体石蜡，使卵膜透明。用液体石蜡，使卵膜透明。用长约1.5cm1.5cm的的4 4号号针头插入血管插入血管内注射接种物。内注射接种物。接种后的接种后的接种后的接种后的检查检查及病毒的收及病毒的收及病毒的收及病毒的收获获
37、接种后一般在接种后一般在3737 C C左右左右继续孵化孵化2 27 7天，不必翻天，不必翻蛋。每日照蛋蛋。每日照蛋1 12 2次，弃去接种后次，弃去接种后2424小小时内非特内非特异死亡的异死亡的鸡胚，胚，2424小小时后死亡的后死亡的鸡胚随胚随时捡出，出，置置4 48 8 C C冷却冷却4 42424小小时。观察期察期结束，所有活胚同束，所有活胚同样冷却冷却处理。分理。分别收收获收收获胚体、卵黄囊、尿囊液、胚体、卵黄囊、尿囊液、绒毛尿囊膜等。收毛尿囊膜等。收获期期间注意注意检查胚胎、胚胎、绒毛尿囊膜的病毛尿囊膜的病变情况、情况、尿囊液是否尿囊液是否浑浊等。等。几种病毒接种途径及收几种病毒接
38、种途径及收几种病毒接种途径及收几种病毒接种途径及收获获材料材料材料材料病毒病毒胚龄胚龄接种接种途径途径培养培养温度温度培养培养时间时间鸡胚鸡胚变化变化收获收获材料材料鸡新城疫鸡新城疫9 91111尿囊腔尿囊腔3737左右左右3 35 5天天出血、死出血、死亡、血凝亡、血凝尿囊液尿囊液鸡痘鸡痘10101111CAMCAM3737左右左右5 5天天膜上痘疱膜上痘疱CAMCAM鸡传染性鸡传染性喉气管炎喉气管炎10101111CAMCAM3737左右左右5 5天天膜上痘疱膜上痘疱CAMCAM狂犬狂犬6 67 7卵黄囊卵黄囊3737左右左右8 81010天天卵黄囊卵黄囊乙脑乙脑6 68 8卵黄囊卵黄囊3
39、737左右左右3 3天天死亡死亡鸡胚鸡胚1.2.41.2.41.2.41.2.4动动物接种技物接种技物接种技物接种技术术 2.4.12.4.1动物接种途径和接种方法物接种途径和接种方法1 1）脑内接种内接种给小鼠和地鼠小鼠和地鼠脑内接种内接种时，用左手大拇指和食指固定，用左手大拇指和食指固定头部，消毒左部，消毒左侧眼与耳之眼与耳之间上部注射部位，并于眼后角、耳前上部注射部位，并于眼后角、耳前缘及及颅前后中前后中线所构成之位置中所构成之位置中间刺入刺入针头2 23mm3mm，乳鼠接种，成年鼠和地，乳鼠接种，成年鼠和地鼠鼠为。给豚鼠和家兔豚鼠和家兔进行行脑内接种内接种时，先作麻醉或人工固定，在，先
40、作麻醉或人工固定，在颅前前后中后中线旁旁边5mm5mm平行平行线与与动物瞳孔横物瞳孔横线交叉交叉处消毒，用消毒，用锥刺穿刺穿颅骨，骨，然后用然后用针头刺入刺入4 410mm10mm，接种。，接种。绵羊羊脑内接种内接种时，先固定在接种台，先固定在接种台上，剪去上，剪去头顶部的毛，并用硫化部的毛，并用硫化钡脱毛，碘酊消毒后，在脱毛，碘酊消毒后，在颅顶部中部中线左或右左或右侧，用，用锥钻一小孔，硬一小孔，硬脑膜下或膜下或脑内接种内接种1ml1ml，立即用火棉胶，立即用火棉胶封封闭接种孔。接种孔。动动物接种途径和接种方法物接种途径和接种方法物接种途径和接种方法物接种途径和接种方法2 2）皮内接种）皮内
41、接种常用于大常用于大动物。在背部、物。在背部、颈部、腹部、耳部及尾根部部、腹部、耳部及尾根部先剪毛，碘酊消毒，以左手拇指和食指提起注射部位皮肤，用先剪毛，碘酊消毒，以左手拇指和食指提起注射部位皮肤，用针头斜斜面向外，与皮肤面平行刺入面向外，与皮肤面平行刺入2 23mm3mm，接种。注射，接种。注射剂量量较大大时，可分点，可分点注射。牛、羊舌面皮内注射注射。牛、羊舌面皮内注射时，先固定，先固定动物，抓住物，抓住动物舌物舌头并固定，并固定，然后接种。然后接种。3 3）皮下注射）皮下注射豚鼠和家兔可豚鼠和家兔可选择腹部及大腿内腹部及大腿内侧皮肤松弛皮肤松弛处，小鼠，小鼠可可选择尾根部或背部，碘酊消毒
42、皮肤尾根部或背部，碘酊消毒皮肤处，用，用针头水平方向挑起皮肤，水平方向挑起皮肤，刺入刺入1.5-2cm1.5-2cm，缓慢注入接种物慢注入接种物0.2-1ml0.2-1ml。动动物接种途径和接种方法物接种途径和接种方法物接种途径和接种方法物接种途径和接种方法4 4）静脉接种）静脉接种小鼠尾静脉注射小鼠尾静脉注射时，先将小鼠尾巴在，先将小鼠尾巴在50505555 C C水中浸泡水中浸泡1 1分分钟，使尾静脉，使尾静脉扩张，用鼠缸扣住鼠体，用鼠缸扣住鼠体，露出尾部，用左手拇指和中指将鼠尾拉直，以食指托住尾露出尾部，用左手拇指和中指将鼠尾拉直，以食指托住尾部，消毒注射部位后由靠近尾尖端部，消毒注射部
43、位后由靠近尾尖端处平行刺入平行刺入针头，再向，再向下刺入静脉，慢慢注入下刺入静脉，慢慢注入0.1-1ml0.1-1ml接种物。家兔耳静脉注射接种物。家兔耳静脉注射时，先固定在特制固定器上或人工固定，剃耳毛，用酒精，先固定在特制固定器上或人工固定，剃耳毛，用酒精棉球涂擦注射部位静脉棉球涂擦注射部位静脉1 1分分钟，使静脉，使静脉扩张，再用左手拇，再用左手拇指及中食指抓住耳尖部，刺入指及中食指抓住耳尖部，刺入针头缓慢注射慢注射1 15ml5ml接种物。接种物。鸡翅下肱静脉注射翅下肱静脉注射时，侧卧固定，卧固定，张开翅膀，拔去注射部开翅膀，拔去注射部位的羽毛，碘酊消毒，用位的羽毛，碘酊消毒，用针头斜
44、面朝上刺入静脉注射斜面朝上刺入静脉注射1 15ml5ml接种物。接种物。动物接种途径和接种方法物接种途径和接种方法5 5）腹腔接种）腹腔接种家兔和豚鼠先在腹股沟家兔和豚鼠先在腹股沟处刺入皮下，刺入皮下，进针少少许后再刺入腹腔注射后再刺入腹腔注射0.5-5ml0.5-5ml。小鼠腹腔接。小鼠腹腔接种种时，用右手提起鼠尾，左手拇指和食指捏其，用右手提起鼠尾，左手拇指和食指捏其头背部，翻背部，翻转鼠体使腹部向上，把鼠尾和右后脚鼠体使腹部向上，把鼠尾和右后脚夹于小指和无名指之于小指和无名指之间，右手将，右手将针头平行刺入腿根平行刺入腿根处腹部皮下，向下斜行刺入腹腔，注射腹部皮下，向下斜行刺入腹腔，注射
45、0.5-1ml0.5-1ml。动动物接种后的物接种后的物接种后的物接种后的观观察及含毒察及含毒察及含毒察及含毒组织组织的收的收的收的收获获动物接种后物接种后应每天每天观察，注意察，注意动物的活物的活动、饮食、食、粪便与便与尿液及皮毛体表等情况，尿液及皮毛体表等情况，还应根据接种微生物的特性及根据接种微生物的特性及动物性物性别、年、年龄等的不同而有所等的不同而有所侧重，如体温曲重，如体温曲线、特征性、特征性临床症状的出床症状的出现及注射部位的特征性及注射部位的特征性变化等。根据化等。根据观察察结果，果，选出接种后符合要求的反出接种后符合要求的反应特征的特征的动物，按照物，按照规定方定方法剖法剖杀
46、动物，收集含毒血液或采集含毒物，收集含毒血液或采集含毒组织、器官等。、器官等。1.31.3、工、工业化大化大规模繁殖病原的方法模繁殖病原的方法大量培养大量培养细菌的方法菌的方法（1 1）固体培养基表面培养法固体培养基表面培养法此法是将溶此法是将溶化的肉化的肉汤琼脂培养基，分装于大扁瓶脂培养基，分装于大扁瓶(大型克氏瓶大型克氏瓶)，灭菌后平放使凝固，菌后平放使凝固，经培养培养观察无察无污染，在无染，在无菌室接入种子液，使均匀分布于表面，平放温室菌室接入种子液，使均匀分布于表面，平放温室静置培养，然后静置培养，然后倾去凝集水，收集菌苔制成菌去凝集水，收集菌苔制成菌悬浮液。浮液。大量培养大量培养细菌
47、的方法菌的方法（2 2）液体静置培养法液体静置培养法此法适于一般菌苗的生此法适于一般菌苗的生产，培养，培养容器可用大玻瓶也可用培养罐容器可用大玻瓶也可用培养罐(或称或称发酵罐酵罐)，按容器的深，按容器的深度，装入适量培养基，一般是容器深度的度，装入适量培养基，一般是容器深度的1 12 22 23 3为宜，宜，经高高压蒸汽蒸汽灭菌之后，冷至室温接入菌之后，冷至室温接入细菌种子，保持适宜菌种子，保持适宜温度静置培养。温度静置培养。（3 3）液体深）液体深层通气培养法通气培养法使用培养罐（反使用培养罐（反应缸），缸），带有有搅拌器和通气系拌器和通气系统，或自，或自动控制装置，用人工控制培控制装置，用
48、人工控制培养温度和通气量。培养基与佐养温度和通气量。培养基与佐剂（氢氧化氧化铝胶、油佐胶、油佐剂等）等）均可在缸内消毒，在缸内均可在缸内消毒，在缸内进行行细菌的培养及菌的培养及灭活、加佐活、加佐剂配苗与分装等，可大量生配苗与分装等，可大量生产出出质量量较好的菌苗。好的菌苗。工工工工业业化大化大化大化大规规模培养病毒的方法模培养病毒的方法模培养病毒的方法模培养病毒的方法（1 1）单层转瓶培养瓶培养是在是在转鼓条件下鼓条件下发展起来的，展起来的，专用于大量生用于大量生产细胞的一种胞的一种设备，能自，能自动调温、温、调速和速和报警，靠一台警，靠一台马达达驱动，转瓶架分上、中、下瓶架分上、中、下几几层
49、，每，每层可放一排可放一排1 1万万1.51.5万万m1m1的的转瓶，瓶，转瓶是瓶是搁置在置在滚轴上，以每小上，以每小时9 91515转的的转速速转动。国。国际上上普遍使用无毒塑料普遍使用无毒塑料转瓶，直径瓶，直径为151520cm20cm，长度度为303080cm80cm，多，多为一次性使用。一次性使用。工工业化大化大规模培养病毒的方法模培养病毒的方法（2 2）培养罐培养培养罐培养培养罐罐体培养罐罐体结构均构均为不不锈钢质，可以自，可以自动调温、温、调pHpH值，用无，用无级马达、磁达、磁搅拌、消泡、控制氧拌、消泡、控制氧压、自、自动补液、液、换液、自液、自动高高压灭菌、自菌、自动计算呼吸商
50、等。深算呼吸商等。深层悬浮培养法能浮培养法能控制一致的控制一致的细胞培养条件，可大胞培养条件，可大规模生模生产，细胞胞培养物可通培养物可通过高速离心弃去培养液，使病毒更加高速离心弃去培养液，使病毒更加纯净，可减少异性蛋白，可减少异性蛋白质的含量。的含量。工工业化大化大规模培养病毒的方法模培养病毒的方法（3 3）微）微载体体细胞培养系胞培养系统 微微载体的直径在体的直径在6060250m250m，由天然葡聚糖、凝胶或各种合成的聚，由天然葡聚糖、凝胶或各种合成的聚合物合物组成，如聚苯乙成，如聚苯乙烯、聚丙、聚丙烯酰胺等。此法兼胺等。此法兼有有悬浮培养法和浮培养法和单层培养法的培养法的优点，容易大量