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1、茶树纯露的化学成分及抑菌活性研究茶树纯露(tea tree hydrosol,TTH)是桃金娘科(Myrtaceae)白千层属(Melaleuca L.)植物互叶白千层(Melaleuca alternifolia)的枝叶在水蒸气蒸馏生产精油时分离出来的水相,为无色的澄清水溶液,具有清新、肉豆蔻芳香气味。白千层属植物大多数为多年生木本植物,全世界有290种,主要分布在澳大利亚和东南亚。在我国主要分布于广西、广东、云南、海南、福建等地。目前已开展化学成分或药理活性研究的本属植物有12种,包括白千层M.leucadendron、互叶白千层M.alternifolia、千层金M.bracteata、
2、石南叶白千层M.ericifolia、绿花白千层M.viridiflora、下垂白千层M.armillaris、M.styphelioides、M.linarrifolia、M.fulgens、五脉白千层M.quinquenervia、M.squarrosa和M.linarrifolia。中华本草、中药大辞典和新华本草纲要等经典著作对白千层均有收录,其叶味辛性凉,具有祛风解表、利湿止痒之功效,主治感冒发热、风湿骨痛、腹痛泄泻、风疹、湿疹;其皮味淡性平,具有安神解毒之功效,主治失眠、多梦、神志不安、创伤化脓。新华本草纲要还收录了白树(M.viridiflora),即绿花白千层,其种子油主治烧伤。
3、白千层属植物最具代表性产品是其枝叶经水蒸气蒸馏得到的精油,商品名为茶树油(tea tree oil,TTO),被广泛应用于治疗由细菌和真菌引起的皮肤粘膜感染、口腔黏膜溃疡、牙龈炎和手足癣等疾病。TTH作为TTO生产过程中的副产物,通常被作为废物排掉,既污染环境,又浪费资源。本文为国内外首次对TTH中的化学成分进行分离鉴定和抑菌活性评价,筛选出TTH中具有抑菌活性的成分,以期为TTH的研究与开发利用提供科学依据。本文预实验采用水蒸气蒸馏法对TTH中的挥发性成分进行提取,采用GCMS分析和质谱库检索(NIST和AMDIS)及文献对比,鉴定了76种化学成分,包括45种单萜、18种半萜、5种倍半萜及烃
4、类成分。这些成分均主要存在于茶树油中,属于TTH与TTO相交叉的弱极性成分而非主要成分。TTH中化学成分的富集采用A和B大孔吸附树脂进行二级富集分离操作。采用50%乙醇和95%乙醇作为洗脱剂,依次分别对A和B大孔吸附树脂柱进行洗脱,分别得到4个部分,M1-50%,M1-95%,M2-50%和M2-95%。采用常规正相硅胶柱色谱、中压制备液相色谱、制备薄层色谱、制备HPLC及Sephadex LH-20等方法对各部分所含化学成分进行了系统的分离和纯化。从第1部分分离得到5个化合物,分别为MA-1、MA-3、MA-4、MA-5和MA-6。从第2部分分离得到13个化合物,分别为MA-9、MA-10、
5、MA-11、MA-12、MA-13、MA-14、MA-15、MA-16、MA-17、MA-18、MA-19、MA-20和MA-22。从第3部分分离得到4个化合物,分别为MA-21、MA-23、MA-24和MA-25。通过理化性质和MS、NMR波谱数据分析及文献对比,从中鉴定了15个化合物,包括10个单萜,trans-1,4-terpin(MA-1),cis-1,8-terpin(MA-3),1S,2S,4S-trihydroxy-p-menthane(MA-4),trans-1,8-terpin(MA-5),2-endohydroxy-1,8-cineole(MA-12),2-endo-hyd
6、roxy-1,4-cineole(MA-14),7-hydroxy menthol(MA-16),p-menth-1-ene-4,8-diol(MA-18),(+)-terpinen-4-ol(MA-21)和p-menth-3-ene-1,2-diol(MA-22);2个倍半萜,aromadendrane-4,10-diol(MA-20)和3,4-dehydroglobulol(MA-24);1个苯酚,carvacrol(MA-9);1个苯甲酸,3,4,5-三甲氧基苯甲酸甲酯(MA-11)和1个链烷烃,nhexadecane(MA-13)。该15个化合物均为首次从白千层属植物中分离得到,所有单
7、萜均为单环单萜,所有倍半萜均为双环倍半萜。单萜中p-menth-1-ene-4,8-diol,(+)-terpinen-4-ol和p-menth-3-ene-1,2-diol含有一个双键;trans-1,4-terpin,cis-1,8-terpin,trans-1,8-terpin,7-hydroxy menthol,p-menth-1-ene-4,8-diol和pmenth-3-ene-1,2-diol均含有两个羟基;倍半萜中3,4-dehydroglobulol含有一个双键,aromadendrane-4,10-diol含有两个羟基。采用纸片琼脂扩散法对从茶树纯露中分离出来的4个部分进行
8、抑菌活性研究。测试菌株有12种,分别为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、白色念珠菌(Candida albicans)、大肠杆菌(Escherichia coli)、副伤寒乙沙门菌(Salmonella paratyphi B)、化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella
9、pneumoniae)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。P1对藤黄微球菌、白色念珠菌和枯草芽孢杆菌具有较强抑制活性。其中,P1(v:100%,50%,25%)对藤黄微球菌的抑菌圈直径分别为34.6、29.6和22.7 mm;P1(v:100%,50%,25%)对白色念珠菌的抑菌圈直径分别为33.2、32.6和33.3 mm;P1(v:100%,50%,25%)对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径分别为26.8、22.6和20.6 mm。P1对大肠杆菌、副伤寒乙沙门菌、化脓链球菌、金黄葡萄球菌、腐生葡萄球菌、表皮葡萄球菌和肺
10、炎克雷伯菌具有中等抑制活性。P1(v:100%,50%,25%)对大肠杆菌的抑菌圈直径分别为21.1、22.7和16.3mm;P1(v:100%,50%,25%)对副伤寒乙沙门菌的抑菌圈直径分别为20.2、18.4和14.3 mm;P1(v:100%,50%,25%)对化脓链球菌的抑菌圈直径分别为14.3、12.3和11.0 mm;P1(v:100%,50%,25%)对金黄葡萄球菌的抑菌圈直径分别为16.9、15.8和11.0 mm;P1(v:100%,50%,25%)对腐生葡萄球菌的抑菌圈直径分别为16.6、16.9和10.3 mm;P1(v:100%,50%,25%)对表皮葡萄球菌的抑菌圈
11、直径分别为15.4、12.6和6.8 mm;P1(v:100%,50%,25%)对肺炎克雷伯菌的抑菌圈直径分别为19.0、16.9和14.2 mm。P2对白色念珠菌、枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌和肺炎克雷伯菌具有中等抑制活性。P2(c:600、300 mg/m L)对白色念珠菌的抑菌圈直径分别为12.6和6.2 mm;P2(c:600、300 mg/m L)对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径分别为12.9和10.4 mm;P2(c:600、300 mg/m L)对藤黄微球菌的抑菌圈直径分别为13.5和9.8 mm;P2(c:600、300 mg/m L)对肺炎克雷伯菌的抑菌圈直径分别为10.8和7.0 m
12、m。P4在所筛选菌株范围内抑菌活性较弱。P4(c:600 mg/m L)对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径为7.4 mm;P4(c:600 mg/m L)对化脓链球菌的抑菌圈直径为6.4mm;P4(c:600 mg/m L)对藤黄微球菌的抑菌圈直径为6.1 mm;P4(c:600mg/m L)对肺炎克雷伯菌的抑菌圈直径为6.1 mm。P3在所筛选菌株范围内没有抑菌活性。采用肉汤稀释法(96孔板法)测定化合物的体外抑菌活性。测试菌株有8种,分别为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、白色念珠菌(C.albicans)、大肠杆菌(E.coli)、副伤寒乙沙门菌(S.paratyphi B)、金黄葡萄球菌(
13、S.aureus)、腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)、藤黄微球菌(M.luteus)和肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)。化合物C-11对金黄葡萄球菌、大肠埃希菌、藤黄微球菌和肺炎克雷伯菌的MIC分别为0.312、0.625、0.625和10 mg/m L;化合物C-12对金黄葡萄球菌、大肠埃希菌、藤黄微球菌和肺炎克雷伯菌的MIC分别为0.625、2.5、2.5和2.5 mg/m L;化合物C-7对金黄葡萄球菌、大肠埃希菌、藤黄微球菌和肺炎克雷伯菌的MIC分别为1.25、1.25、1.25和2.5 mg/m L;化合物C-14对金黄葡萄球菌、藤黄微球菌和肺炎克雷伯菌的MIC
14、分别为2.5、2.5和2.5 mg/m L;化合物C-8对藤黄微球菌和肺炎克雷伯菌的MIC分别为2.5和1.25 mg/m L;化合物C-5对金黄葡萄球菌、大肠埃希菌、藤黄微球菌和肺炎克雷伯菌的MIC分别为2.5、5、5和2.5 mg/m L;化合物C-4对金黄葡萄球菌、大肠埃希菌、藤黄微球菌和肺炎克雷伯菌的MIC分别为2.5、5、5和2.5 mg/m L;化合物C-3对金黄葡萄球菌、大肠埃希菌、藤黄微球菌和肺炎克雷伯菌的MIC分别是5、5、5和2.5mg/m L。研究结果表明,化合物C-7、C-11和C-12为茶树纯露的主要抑菌活性成分。综合实验数据表明,P1对白色念珠菌、枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌具有较强抑制活性。P2对白色念珠菌、枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌和肺炎克雷伯菌具有中等抑制活性。P4对枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、大肠杆菌、副伤寒乙沙门菌、化脓链球菌、金黄葡萄球菌、腐生葡萄球菌、表皮葡萄球菌、藤黄微球菌、肺炎克雷伯菌、福氏志贺氏菌和铜绿假单胞菌的抑制活性较弱。P3对枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、大肠杆菌、副伤寒乙沙门菌、化脓链球菌、金黄葡萄球菌、腐生葡萄球菌、表皮葡萄球菌、藤黄微球菌、肺炎克雷伯菌、福氏志贺氏菌和铜绿假单胞菌没有抑制活性。化合物C-7、C-11和C-12为茶树纯露的主要抑菌活性成分。