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1、第十一章动物细胞大规模培养第十一章动物细胞大规模培养 教教 学学 内内 容容1、动物细胞培养基2、动物细胞培养方法3、动物细胞培养生物反应器4、动物细胞培养技术5、动物细胞大规模培养工艺第十一章第十一章 动物细胞的大规模培养动物细胞的大规模培养本章内容提要在生物技术中，人们已广泛地围绕着在生物技术中，人们已广泛地围绕着细菌、酵母、丝状真菌等细菌、酵母、丝状真菌等微生物的微生物的大量培养来生产各种大量培养来生产各种酶、抗生素、蛋白质等产物酶、抗生素、蛋白质等产物。然而，许多有重要价值的。然而，许多有重要价值的蛋白质等生物物质，必须借助于动物细胞的培养来获得，例如蛋白质等生物物质，必须借助于动物细
2、胞的培养来获得，例如病毒疫苗、干扰病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体素、单克隆抗体等，如表等，如表11-1所示的是一些已实现工业化和正在研究开发的产所示的是一些已实现工业化和正在研究开发的产品。品。大规模的动物细胞培养开始于本世纪大规模的动物细胞培养开始于本世纪50年代，经过多年来的研究，人类对动年代，经过多年来的研究，人类对动物细胞培养技术进行了大量的研究开发，取得了很大的进展。尽管如此，目前的物细胞培养技术进行了大量的研究开发，取得了很大的进展。尽管如此，目前的技术水平还远不能满足细胞生物产品研究和生产的要求，随着动物细胞培养技术技术水平还远不能满足细胞生物产品研究和生产的要求，随着动物细胞培养
3、技术的应用日趋广泛，已显示出很广阔的发展前景。的应用日趋广泛，已显示出很广阔的发展前景。目前由动物细胞培养的产物包括哪几类？请分别列举出目前由动物细胞培养的产物包括哪几类？请分别列举出2-3个产物。个产物。问题问题表表11-1 动物细胞培养的产物动物细胞培养的产物 疫苗人小儿麻痹症疫苗、狂犬疫苗、风疹疫苗、脑炎疫苗、疱疹疫苗等动物牛病毒性腹泻疫苗、牛痢疾疫苗、犬传染性肝炎疫苗、鸡痘病疫苗、猪霍乱疫苗、牛疫狂犬疫苗、草鱼出血热疫苗单克隆抗体IgG、IgM、IgA等免疫调节剂-细胞生长因子、干扰素、白细胞活化因子、血清胸腺因子、白细胞介素、胸腺素、巨噬细胞毒力因子等酶尿激酶、天门冬氨酰胺酶、胶原酶
4、、细胞色素P、450、纤维蛋白溶酶原激活剂、胃蛋白酶、胰蛋白酶、酷氨酸脱羟酶等激素绒膜促性腺激素、促红细胞生成素、促滤泡激素、生长激素、促间质细胞激素、促黄体激素等补充内容（一）补充内容（一）单克隆抗体单克隆抗体哺乳动物细胞中有一套复杂的防御系统防御系统保护自己不受有毒物质和病原物的侵害，其中一部分防御反应就是淋巴细胞经诱导产生特异的蛋白，这些蛋白可以在其他免疫系统蛋白的帮助下与外来物质结合，并抵消其生物学功能。这些特异的蛋白，就是抗体；相对于抗体，诱发产生抗体的外来物质即称为抗原。抗体最早是由德国微生物学家贝林发现的，它们存在于人和脊椎动物的血清之中，是这些生物体内免疫系统的重要组成成分。由
5、于抗体分子具有极其精确的结合特异性，可以识别各种不同的抗原，还可以激活细胞的其他防卫系统以消灭抗原，因此抗体在基础研究和临床诊断中获得了广泛的重视和应用。随着杂交瘤技术、蛋白质工程和转基因技术等技术的发展，抗体已逐步在疾病治疗等应用领域显示出越来越广阔的应用前景。抗体抗体由B细胞产生的免疫球蛋白，它能识别抗原的某一特定位点。抗体分子由两个完全相同的重链分子以及两个完全相同的轻链分子组成。存在于人或哺乳动物的血清之中。抗原抗原指诱导产生抗体的物质。如前所述，抗体分子是免疫系统反应的一个重要组分，因为抗体分子可以识别各种不同的外来抗原，同时可激活宿主的防卫系统。对于一个免疫刺激（有毒物质或病原物侵
6、入，即抗原），每一个淋巴细胞都会合成并分泌一种单个的抗体，这些抗体可以高度特异地识别免疫抗原的特定区域，也就是抗原决定簇。由于一个抗原通常都有几个不同的抗原决定簇，因此每个免疫淋巴细胞都可能产生一种针对某一个抗原决定簇的抗体，这些由同一抗原而产生的不同的抗体统称为多克隆抗体。有毒物质或病原物侵入，即抗原侵入抗体2抗体1于是，人们认识到要把抗体应用于临床诊断或是治疗，必须要制备单一类型的只对某一特定抗原决定簇的抗体分子，也就是单克隆抗体。多克隆抗体多克隆抗体在一个血清样品中包含了对同一抗原分子上不同抗原决定簇的多种抗体。单克隆抗体单克隆抗体由杂交瘤细胞系产生的针对某一特定抗原决定簇的单一类型的抗
7、体。补充内容（二）补充内容（二）动物细胞培养步骤动物细胞培养步骤 培养动物细胞一般可按以下步骤进行：无菌取出目的细胞所在组织，用培养液漂洗干净以锋利无菌刀具割舍多余部分，切成小组织块将小组织块置解离液离散细胞。解离液含蛋白酶类，无钙、镁离子低速离心洗涤细胞后，将目的细胞吸移培养瓶培养一、动物细胞培养基1、动物细胞培养的环境、动物细胞培养的环境 动物细胞的生长、繁殖和代谢等生理性质在很大程度上受到各种环境因素的影响。为了使动物细胞的培养处于最佳状态，了解环境因素对其影响无疑是很重要的，影响动物细胞生长、繁殖的环境因素很多，主要有温度、PH值、营养成分、溶氧、气体环境、渗透压以及其他因素。温温 度
8、度细胞在体外生存的基本条件之一，来源不同的动物细胞，其最适的生长温度是不尽相同的，例如昆虫细胞的最适温度是25-28，人和哺乳动物的细胞的最适温度是37.细胞代谢强度与温度成正比，高于最适温度范围，细胞的正常代谢和生长将会受到影响，甚至导致死亡。总的来说，动物细胞对低温的耐受力比对高温的耐受力强，如温度升至45时，1h内人和哺乳动物细胞将被杀死；相反，降低细胞置于25-35时，细胞仍能生长，但速度减慢，并维持长时间不死，甚至于放在4，数小时后再置于37培养，细胞仍能继续生长。PH 值值合合适适的的PH值值是是细细胞胞生生存存的的必必要要的的条条件件之之一一。动动物物细细胞胞合合适适的的PH值值
9、一一般般在在，低低于于6.8或或高高于于7.6时时都都对对细细胞胞产产生生不不利利的的影影响响，严严重重时时可可导导致致细细胞胞退退变变或或死死亡亡。不不同同的的细细胞胞对对PH值值也也有有不不同同的的要要求求，原原代代培培养养细细胞胞对对PH值值的的变变化化耐耐受受性性差差，传传代代细细胞胞对对PH值值变变化化的的耐耐受受性性较较强强。而而对对于于同同一一种种细细胞胞，增增长长期期和和维维持持期期的的最最适适PH也也不不尽尽相相同同，对于大多数细胞来说，偏碱性环境比酸性环境更有利于细胞的生长。对于大多数细胞来说，偏碱性环境比酸性环境更有利于细胞的生长。营养成分营养成分细细胞胞的的生生长长、繁
10、繁殖殖以以及及产产物物的的合合成成都都必必须须从从环环境境中中摄摄取取各各种种营营养养物物质质，以以合合成成细细胞胞物物质质及及在在新新陈陈代代谢谢中中起起调调节节作作用用。这这些些营营养养物物质质包包括括碳碳源源、氮氮源源、氨氨基基酸酸、无无机盐、微量元素、生长因子等。机盐、微量元素、生长因子等。溶氧及气体环境溶氧及气体环境（P205）渗透压等其它因素渗透压等其它因素（P205）1、影响动物细胞生长、繁殖的环境因素有哪些？、影响动物细胞生长、繁殖的环境因素有哪些？问题问题2、动物细胞培养合适的、动物细胞培养合适的PH值为多少？值为多少？2、培养基的组成、培养基的组成 培养基是维持体外细胞生存
11、和生长的基本溶液，是组织细胞培养最重要的条件。培养基是维持体外细胞生存和生长的基本溶液，是组织细胞培养最重要的条件。用于动物细胞的培养基可以分为天然培养基和合成培养基两用于动物细胞的培养基可以分为天然培养基和合成培养基两 大类。大类。天天然然培培养养基基是是使使用用最最早早、最最为为有有效效的的动动物物细细胞胞培培养养基基，它它主主要要取取自自于于动动物物体体液液或或从从动动物物组组织织分分离离提提取取而而得得，其其优优点点是是营营养养成成分分丰丰富富、培培养养效效果果良良好好；缺缺点点是是成成分分复杂、个体差异大、来源有限。复杂、个体差异大、来源有限。天天然然培培养养基基的的种种类类有有很很
12、多多，包包括括生生物物性性液液体体（如如血血清清）、组组织织浸浸出出液液（如如胚胚胎胎浸出液）、凝固剂（如血浆）等。浸出液）、凝固剂（如血浆）等。3、溶氧浓度过高过低对细胞生长有何影响？、溶氧浓度过高过低对细胞生长有何影响？4、细胞代谢产物、细胞代谢产物CO2对细胞生长有何作用？对细胞生长有何作用？1、天然培养基有哪些？它有何优缺点？、天然培养基有哪些？它有何优缺点？问题问题2、血清和血浆分别如何取得？、血清和血浆分别如何取得？血液组成：红细胞、白细胞、血小板和血浆。高速离心，分三层：上层为血浆血液组成：红细胞、白细胞、血小板和血浆。高速离心，分三层：上层为血浆40%多。多。血血浆浆冷冷冻冻到
13、到-30度度，离离心心，分分层层：上上层层为为血血清清，下层为杂蛋白（少）。下层为杂蛋白（少）。3、最广泛使用的血清是什么动物血清？它有何营养成分？、最广泛使用的血清是什么动物血清？它有何营养成分？血浆血浆 组织浸出液组织浸出液血清血清 组组织织细细胞胞培培养养中中最最常常用用的的天天然然培培养养基基是是血血清清，这这是是因因为为血血清清中中含含有有包包括括大大分分子子的的蛋蛋白白质质和和核核酸酸等等丰丰富富的的营营养养物物质质，对对促促进进细细胞胞生生长长繁繁殖殖、粘粘附附及及中中和和某某些些物物质质的的毒毒性性起起着着一一定定的的作作用用。用用于于组组织织细细胞胞培培养养的的血血清清的的种
14、种类类很很多多，其其来来源源主主要要动动物物，有有小小牛牛血血清清、胎胎牛牛血血清清、马马血血清清、兔兔血血清清以以及及人人血血清清等等，最最广广泛泛使使用用的的是是小小牛牛血血清清和和胎胎牛牛血血清清。优质的血清外观应为透明、无溶血、淡黄色、无沉淀物。优质的血清外观应为透明、无溶血、淡黄色、无沉淀物。血血浆浆不不仅仅可可用用来来支支持持培培养养组组织织块块，而而且且还还供供给给细细胞胞生生物物匠匠营营养养物物质质，但但由由于于血血浆很容易发生液人经，目前已很少单独使用。一般使用的是禽类血浆。浆很容易发生液人经，目前已很少单独使用。一般使用的是禽类血浆。组组织织浸浸出出液液常常用用的的是是胚胚
15、胎胎浸浸出出液液（如如鸡鸡胚胚浸浸出出液液），它它的的主主要要成成分分含含有有大大分分子子核核蛋白和小分子的氨基酸，有促进细胞生长的作用。蛋白和小分子的氨基酸，有促进细胞生长的作用。水解乳蛋白水解乳蛋白 水解乳蛋白是常用的一种天然培养基，是由乳白蛋白经水解而水解乳蛋白是常用的一种天然培养基，是由乳白蛋白经水解而制得，氨基酸的含量较高。一般配制成制得，氨基酸的含量较高。一般配制成0.5%的溶液，或与合成培养的溶液，或与合成培养基以基以1：1共同使用。共同使用。合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物质对细胞体内生存环境中各种已知物质在体外人工条件的模拟，经过反复实验筛选、强化和重新组合后形成的
16、培养基。这种培养基在很多方面有天然培养基所无法比拟的优点，它既能经细胞提供一个近似于体内的生存环境，又便于控制和提供标准化体外生存环境。目目前前所所有有的的细细胞胞培培养养都都已已采采用用经经标标准准化化生生产产、组组成成和和含含量量都都相相对对固固定定的的各各种种合合成成培培养养基基，并并已已有有配配制制好好的的干干粉粉型型商商品品。尽尽管管现现在在的的合合成成培培养养基基成成分分和和含含量量已已经经较较为为复复杂杂，但但仍仍然然不不能能完完全全满满足足体体外外培培养养细细胞胞生生长长的的需需要要，合合成成培培养养基基中中还还是是需需要要加加入入一定量的天然培养基予以补充。一定量的天然培养基
17、予以补充。合成培养基中一般都有哪些营养成分？合成培养基中一般都有哪些营养成分？问题问题3、常用的合成培养基、常用的合成培养基 目前合成培养基的种类已有数十种，大多数培养基都是为适应某种组织细胞的目前合成培养基的种类已有数十种，大多数培养基都是为适应某种组织细胞的生长而在某种合成培养基的基础上改良而来的。目前较为常用的有生长而在某种合成培养基的基础上改良而来的。目前较为常用的有199培养液、培养液、Eagle(MEM、DMEM)培养液培养液、RPMI1640培养液、培养液、HAM培养液培养液等。表等。表11-2为常用为常用的培养基的成分和配方。的培养基的成分和配方。1、目前较常用的合成培养基有哪
18、些？、目前较常用的合成培养基有哪些？问题问题2、为什么在要求较高的基础性研究中要用无血清培养液？、为什么在要求较高的基础性研究中要用无血清培养液？3、无血清培养液由哪两部分组成？、无血清培养液由哪两部分组成？P208表表11-4 微生物细胞和动物细胞性质的比较微生物细胞和动物细胞性质的比较性质性质 微生物细胞微生物细胞动物细胞动物细胞大小1-10m10-100m代谢调节方式内部内部和激素营养要求宽松，可利用多种底物苛刻生长速率倍增时间一般为0.5-2h倍增时间一般为12-60h机械强度较好很差，缺乏保护性细胞壁环境适应好 差二、动物细胞培养方法二、动物细胞培养方法所谓所谓动物细胞培养动物细胞培
19、养是将动物组织或细胞从机体取出，分散成是将动物组织或细胞从机体取出，分散成单个细胞，给予必要的生长条件，模拟体内生长环境，使其在体单个细胞，给予必要的生长条件，模拟体内生长环境，使其在体外继续生长和繁殖。外继续生长和繁殖。表表11-4，表，表11-5是微生物细胞与动物细胞性质是微生物细胞与动物细胞性质和培养方法的比较。和培养方法的比较。表11-5 微生物和动物细胞培养方法的比较微生物细胞微生物细胞动物细胞动物细胞PH控制添加酸、碱CO2-HCO3缓冲液搅拌速度速度快、范围广较慢溶氧控制改变搅拌速度、通气量、进气氧浓度改变进入气体的氧浓度培养基灭菌方法高温蒸煮过滤培养时间几小时几天几天3、4周对
20、水纯度的要求较低很高与与微生物细胞培养类似，动物细胞的体外培养有两种类型：微生物细胞培养类似，动物细胞的体外培养有两种类型：一类是非贴壁一类是非贴壁依赖性细胞，这类细胞可以采用与微生物培养类似的方法进行悬浮培养；另一类是依赖性细胞，这类细胞可以采用与微生物培养类似的方法进行悬浮培养；另一类是贴壁依赖性细胞，它们需要附着于带适量电荷的固体或半固体表面上生长。贴壁依赖性细胞，它们需要附着于带适量电荷的固体或半固体表面上生长。1、悬浮培养、悬浮培养 P209 1、动物细胞培养有哪三种类型？、动物细胞培养有哪三种类型？提问提问1、悬浮培养是用培养哪一类细胞的？问题问题2、悬浮培养有何优缺点？2、贴壁培
21、养、贴壁培养 贴贴壁壁指指必必须须贴贴附附在在固固体体介介质质表表面面上上生生长长的的细细胞胞培培养养培培养养，主主要要用用于于非非淋淋巴巴组组织织和和许许多多单单倍倍体体等等贴贴壁壁依依赖赖性性细细胞胞的的培培养养。由由于于大大多多数数动动物物细细胞胞属属于于贴贴壁壁依依赖赖性细胞，贴壁培养是动物细胞培养的一种重要方法。性细胞，贴壁培养是动物细胞培养的一种重要方法。在贴壁培养过程中，贴壁依赖性细胞需要附着在带适量正电荷或半固体的在带适量正电荷或半固体的表面上表面上，原来是圆形的细胞一经贴壁就迅速铺展开来，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般可在数天后铺满生长表面，形成致密的细胞单层。
22、在贴壁培养依赖性细胞中，请比较滚瓶培养系统和微载体培养系统？问题问题细胞贴壁一般分为贴壁因子吸附于培养表面、细胞与表面接触、细胞贴壁于培养表面和贴壁细胞在培养表面上扩展等几个步骤。图11-1为细胞在培养表面贴壁过程示意图。3、固定化培养、固定化培养 固定化培养是既适用于贴壁依赖性细胞，又适用于非贴壁依赖性细胞的包埋培养方式，具有细胞生长密度高、抗剪切力和抗污染能力强等优点优点。由于所培养的细胞的不同，固定化培培养养的的方方式式也有不同，一般对于贴壁依赖性细胞通常采用胶原包埋，而对于非贴壁依赖性细胞则常用海藻酸钙包埋。常用的细细胞胞固固定定化化的的方方法法主主要要有有吸附、共价贴附、离子/共价交
23、联、包埋和微囊化等。三、动物细胞培养生物反应器自70年代以来，用于动物细胞培养的生长反应器有了很大的发展，种类越来越多，规模也越来越大。根据生生物物反反应应器器的的不不同同用用途途，有悬浮培养用、贴壁培养用、包埋培养用生物反应器等，其种种类类大大致致上上有有塑料增殖器、填充床增殖器、多层板增殖器、螺旋增殖器、管式螺旋增殖器、陶质矩形通道蜂窝状增殖器、流化床反应器、中空纤维及其他膜式反应器、桨式搅拌反应器、棒式搅拌反应器、船舶推进桨反应器、倾斜桨叶搅拌反应器、般帆形搅拌反应器、往复振动锥孔筛板搅拌反应器、笼式通气搅拌反应器、双层笼式通气搅拌反应器、空气提升式反应器等。1、气升式细胞培养生物反应器
24、、气升式细胞培养生物反应器 气升式反应器的基本原理如图11-2所示。气体混合物从底部的喷射管进入反应器的中央导流管使得中央导流管侧的液体密度低于外部区域从而形成循环。气升式生物反应器主要采用内循环式，但也有采用外循环式。与搅拌式生长反应器相比，气升式生物反应器产生的湍流温和而均匀，剪切力相当小，反应器内没有机械运动部件，因而细胞损伤率比较低；同时由于采用直接喷射空气供氧，氧传递速率高；液体循环量大，能使细胞和营养成分均匀地分布于培养基中。表11-9列出了八种细胞的有关培养数据，可以看出同传统的方法（培培养养瓶瓶和和滚滚瓶瓶）相比，气升反应器的抗体产量平均提高平均提高4.6倍倍。在气升式生物反应
25、器中，溶溶氧氧的的控控制制可以通过自动调节进入空气的速率来实现；PH值值可通过在进气中加入二氧化碳或加入氢氧化钠来控制。优点优点请画出气升式反应器的简图，并说说溶氧浓度和PH值是如何控制的？问题问题表表11-9 气升式反应器和传统培养方法的抗体产率比较气升式反应器和传统培养方法的抗体产率比较 细胞系细胞系抗体类型抗体类型抗体产量，抗体产量，mm/l气升式气升式/传统传统培养瓶滚瓶气升式气升式1IgG1420865.12IgM701272953.03IgG910737.74IgG28301003.45IgG60762603.86IgM20251125.07IgG30382005.98IgG120
26、1003503.2图图11-3 中空纤维反应器示意图中空纤维反应器示意图细胞细胞培养基入口培养基入口培养基出口培养基出口2、中空纤维管生物反应器、中空纤维管生物反应器中空纤维管生物反应器如图11-3所示，它的用途较广，既可培养悬浮生长的细胞，又可培养贴壁依赖性细胞，细胞的密度最高可达109/ml数量级。如果控制系统不受污染，能长期运转。已用这种反应器培养过的细胞型和生产的分泌产物如表11-10所示。生长的细胞型生长的细胞型杂交瘤细胞、淋巴细胞、肝癌细胞、结肠癌细胞、胚胎细胞、乳腺组织细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、成纤维细胞、垂体肿瘤细胞、CHO细胞、BHK-2细胞、肺细胞等分泌的产物分泌的产物Ig
27、G、IgM、IgA、干扰素、激素、尿激酶、蛋白质C、病毒蛋白、乙型肝炎表面抗原、T抑制因子、促细胞生长素、白细胞介素等空气与空气与CO2出口出口空气与空气与CO2入口入口中中空空纤纤维维管管生生物物反反应应器器已已进进入入工工业业生生产产，主主要要用用于于培培养养杂杂交交瘤瘤细细胞胞生生产产单单克克隆隆抗体。（抗体。（重点掌握重点掌握）3、通气搅拌反应器、通气搅拌反应器通气搅拌反应器有哪些型式？问题问题4、流化床生物反应器、流化床生物反应器 流化床生物反应器的基本原理类似于流态床化学反应器，不同的是，流态化的固体是带有细细胞胞的微粒。培养液通过反应器垂直向上循环流动不断提供给细胞必要的营养成分
28、，使细胞得以在微粒中生长；同时，不断地加入新鲜的培养液，并不断地排除培养产物或代谢产物。图11-7为生产用CF-IMMOTM流化床生物反应器的示意图，这种反应器的传质性能很好，并在循环系统中采用膜膜气气体体交交换换器器，能快速提供给高密度细胞所需的氧，同时排除代谢产物；反应器中的液体流速足以使细胞微粒悬浮却不会损坏脆弱的细胞。由于流化床生物反应器满足了高密度细胞培养、使高产量细胞长时间停留在所应器中、优化细胞生长与产物合成的环境等细胞培养的要求，流化床生物反应器既可用于贴壁依赖性细胞的培养，又可用于非贴壁依赖性细胞的培养。表11-11为流化床生物反应器达到的细胞密度。气体交换气体交换氧气氧气回
29、流回流收获收获营养液营养液泵泵反应塔反应塔加热器加热器PH传感器传感器TDOCO2图图11-7 生产用生产用CF-IMMOTM流化床生流化床生物反应器示意图物反应器示意图5、无泡沫搅拌生物反应器（、无泡沫搅拌生物反应器（了解了解）表表11-11流化床生物反应器与其它方法培养达到的细胞比较流化床生物反应器与其它方法培养达到的细胞比较培养类型培养类型细胞类型细胞类型细胞密度（个细胞密度（个/ml）流化床杂交瘤0.3*108贴壁依赖性细胞1.3*108恒化器杂交瘤2*106微载体搅拌釜贴壁依赖性细胞0.2*107-2*107四、动物细胞培养技术动动物物细细胞胞无无论论是是贴贴壁壁培培养养或或是是悬悬
30、浮浮培培养养，均均可可分分为为分分批批式式、流流加加式式、半半连连续续式式、连续式连续式等多种培养方式。等多种培养方式。1、分批式培养、分批式培养定义分分批批式式培培养养是是指指先先将将细细胞胞和和培培养养液液一一次次性性装装入入反反应应器器内内进进行行培培养养，细细胞胞不不断断生生长长，同同时时产产物物也也不不断断形形成成，经经过过一一段段时时间间的的培培养养后，终止培养。后，终止培养。在在细细胞胞分分批批培培养养过过程程中中，不不向向培培养养系系统统补补加加营营养养物物质质，而而只只向向培培养养基基通通入入氧氧，能能够够控控制制的的参参数数只只有有PH、温温度度和和通通气气量量，因因此此细
31、细胞胞所所处处的的生生长长环环境境随随着着营营养养物物的的消消耗耗和和产产物物、副副产产物物的的积积累累时时刻刻都都在在发发生生变变化化，不不能能使使细细胞胞自自始始至至终终处处于于最最优优的的条条件件下下，因因而而分分批批培培养养并并不不是是一一种种很很好好的的培培养养方方式式。分分批批培培养过程的持征如图养过程的持征如图11-8所示。所示。0时间分批图11-8分批式培养过程的特征营养物营养物废产物废产物PH、温度、温度、DO0培养时间（d）细胞密度图11-9分批式培养的生长曲线对数生长期对数生长期减速期减速期平稳期平稳期衰退期衰退期延滞期延滞期为什么说采用分批式培养细胞效果不佳？问题问题细
32、胞分批式培养的生长曲线如图11-9所示。在分批式培养过程中，细胞的生长可分为延滞期、对数生长期、减速期、平稳期和衰退期等五个阶段。2、流加式培养（、流加式培养（补料分批式）定义流流加加式式培培养养是是指指先先将将一一定定量量的的培培养养液液装装入入反反应应器器，在在适适宜宜的的条条件件下下接接种种细细胞胞，进进行行培培养养，使使细细胞胞不不断断生生长长，产产物物不不断断形形成成，而而在在此此过过程程中中随随着着营营养养物物质质的的不不断断消消耗耗，不不断断地地向向系系统统中中补补充充新新的的营营养养成分，使细胞进一步生长代谢，直到整个培养结束后取出产物。成分，使细胞进一步生长代谢，直到整个培养
33、结束后取出产物。流流加加式式培培养养只只是是向向培培养养系系统统补补加加必必要要的的营营养养成成分分，以以维维持持营营养养物物质质的的浓浓度度不不变变。由由于于流流加加式式培培养养能能控控制制更更多多的的环环境境参参数数（），使使得得细细胞胞生生长长和和产产物物生生成成容易维持在优化状态。容易维持在优化状态。流加式培养有何特点？流加式培养有何特点？（P219）问题问题0时间流加图图11-11 流加式培养过程的特征流加式培养过程的特征PH、温度、温度、DO废产物废产物营养物营养物根根据据流流加加控控制制方方式式不不同同，有有两两种种流流加加式式培培养养方方式式：无无反反馈馈控控制制流流加加和和有
34、有反反馈馈控控制制流流加加。无无反反馈馈控控制制流流加加包包括括定定流流量量加加和和间间断断流流加加等等；有有反反馈馈控控制制流流加加一一般般是是连连续续或或间间断断地地测测定定系系统统中中限限制制性性营营养养物物质质的的浓浓度度，并并以以此此为为控控制制指指标标来来调调节节流流加加速速率或流加液中营养物质的浓度等。率或流加液中营养物质的浓度等。3、半连续式培养、半连续式培养 半半连连续续式式培培养养又又可可称称为为反反复复分分批批式式培培养养，是是指指在在分分批批式式培培养养的的基基础础上上，将将分分批批培培养养的的培培养养液液部部分分取取出出，并并重重新新补补充充加加入入等等量量的的新新鲜
35、鲜培培养养基，从而使反应器内培养液的总体积保持不变的培养方式。基，从而使反应器内培养液的总体积保持不变的培养方式。定义4、连续式培养、连续式培养 连连续续式式培培养养是是指指将将细细胞胞种种子子和和培培养养液液一一起起加加入入反反应应器器内内进进行行培培养养，一一方方面面新新鲜鲜的的培培养养液液不不断断加加入入反反应应器器内内，另另一一方方面面又又将将反反应应器器液液连连续续不断地取出，使反应条件处于一种恒定状态。不断地取出，使反应条件处于一种恒定状态。定义与与分分批批式式培培养养和和半半连连续续式式培培养养不不同同，连连续续式式培培养养可可以以保保持持细细胞胞所所处处的的环环境境条条件件长长
36、时时间间地地稳稳定定，可可以以使使细细胞胞维维持持在在优优化化的的状状态态下下，促促进进细细胞胞的的生生长长和和产产物物的的形形成成。由由于于连连续续式式培培养养过过程程中中连连续续不不断断地地收收获获产产物物，并并能能提提高高细细胞胞密密度度，在生产上已被应用于培养非贴壁依赖性细胞。在生产上已被应用于培养非贴壁依赖性细胞。请比较半连续式培养和连续式培养？请比较半连续式培养和连续式培养？问题问题图图11-14 细胞灌注培养系统细胞灌注培养系统实例实例液位控制液位控制细细胞胞悬悬液液细细胞胞新鲜培养基新鲜培养基收液收液过滤器过滤器细胞培养系统细胞培养系统动动物物细细胞胞的的连连续续培培养养一一般
37、般是是采采用用灌灌注注培培养养。灌灌注注培培养养是是把把细细胞胞接接种种后后进进行行培培养养，一一方方面面连连续续向向反反应应器器中中注注入入新新鲜鲜的的培培养养基基，同同时时又又连连续续不不断断地地取取出出等等量量的的培培养养液液，但但是是过过程程中中不不取取出出细细胞胞，细细胞胞仍仍留留在在反反应应器器内内，使使细细胞胞处处于于一一种种营营养养不不断断的的状状态态。当当高高密密度度培培养养动动物物细细胞胞时时，必必须须确确保保补补充充给给细细胞胞以以足足够够的的营营养养以以及及除除去去有有素素毒毒的的代代谢谢物物。灌灌注注培培养养时时用用新新鲜鲜的的培培养养液液进进行行灌灌注注，可可以以确
38、确保保上上述述目目的的的的实实现现。通通过过调调节节灌灌注注速速度度，可可以以把把培培养养过过程程保保持持在在稳稳定定的的、废废代代谢谢物物低低于于抑抑制制水水平平的的状态下。灌注培养过程的特征如图状态下。灌注培养过程的特征如图11-13所示。所示。0时间灌注图11-13灌注培养过程的特征PH、温度、温度、DO废产物废产物营养物营养物表表11-12不同培养方式对不同培养方式对CHO细胞细胞生产人组织血纤维溶酶原激活剂生产人组织血纤维溶酶原激活剂（tPA)产量和活性的影响产量和活性的影响细胞培养方式细胞培养方式分批培养分批培养半连续培养半连续培养灌注培养灌注培养纯化利率，%82165纯化物质的相
39、对产量11.337.74比活性，IU/mgtPA114.4391.3392.6采采用用灌灌注注培培养养的的优优越越性性不不仅仅在在于于大大大大提提高高了了细细胞胞生生长长密密度度，而而且且有有助助于于产产物物的的表表达达和和纯纯化化。如如表表11-12及及图图11-14所所示示，因因此此，灌灌注注培培养养已已经经应应用用于于许许多多不不同同的的培培养系统中，规模已达几百升。图养系统中，规模已达几百升。图11-14为常用的细胞灌注培养系统。为常用的细胞灌注培养系统。说说灌注培养的优越性说说灌注培养的优越性？问题问题5、动物细胞大规模培养工艺、动物细胞大规模培养工艺 大大规规模模动动物物细细胞胞培
40、培养养的的工工艺艺流流程程如如图图11-15所所示示。工工艺艺过过程程中中，先先将将组组织织切切成成碎碎片片，然然后后用用溶溶解解蛋蛋白白质质的的酶酶处处理理而而得得到到单单个个细细胞胞，再再用用离离心心法法收收集集细细胞胞。将将细细胞胞植植入入营营养养培培养养基基，使使细细胞胞在在培培养养基基中中增增殖殖到到覆覆盖盖瓶瓶壁壁表表面面，用用酶酶把把细细胞胞从从瓶瓶壁壁上上消消化化下下来来，再再接接种种到到若若干干培培养养瓶瓶中中进进行行扩扩大大培培养养，将将培培养养所所得得的的细细胞胞“种种子子”冷冷藏藏于于液液氮氮中中，从从液液氮氮中中取取出出一一部部分分细细胞胞“种种子子”进进行行解解冻冻
41、、复复活活培培养养，进进行行扩扩大大培培养养以以获获得得足足够够的的细细胞胞量量，将将细细胞胞接接种种于于大大规规模模生生物物反反应应器器中中进进行行大大规规模模培培养养，按按照照产产物物的的不不同同形形式式进进行行产产物物分分离离纯纯化化。对对于于积积累累在在细细胞胞内内的的产产物物，可可通通过过收收集集细细胞胞后后进进行行破破胞胞，再再经经过过分分离离纯纯化化获获得得产产物物；对对于于由由细细胞胞分分泌泌到到培培养养液液中中产产物物，可可以以通通过过浓浓缩缩、纯纯化化培培养养液液来来获获得得产产品品；而而对对于于那那些些必必须须加加入入诱诱导导剂剂进进行行培培养养或或病病毒毒感感染染培培养养才才能能得得到到的的产产物物的的细细胞胞，可可加加入入上上述述诱诱导导剂剂诱诱导导或或病病毒毒感感染染后后，收收集细胞，再经分离纯化得到产物。集细胞，再经分离纯化得到产物。图图11-15 大大规规模模动动物物细细胞胞培培养养工工艺艺流流程程图图细胞培养反应器细胞培养反应器提取提取细胞细胞诱生剂诱生剂细胞细胞产品（肿瘤抗原）产品（肿瘤抗原）纯化纯化产品（干扰素）产品（干扰素）纯化纯化提取提取产品（单克隆抗体）产品（单克隆抗体）浓缩纯化浓缩纯化79865432110Thank youThank you！ENDEND