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1、DNADNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定 讨讨论论2 2：如如何何证证明明他们是遗传物质？他们是遗传物质？讨论3：怎样才能将细胞内的这些物质分离出来？讨论1：构成生物体的遗传物质是什么？1 1、提取生物大分子的基本思路、提取生物大分子的基本思路选用一定的物理或化学方法分离具有选用一定的物理或化学方法分离具有选用一定的物理或化学方法分离具有选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子不同物理或化学性质的生物大分子不同物理或化学性质的生物大分子不同物理或化学性质的生物大分子2 2、生物大分子、生物大分子主主主主要要要要指指指指蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质、酶和核酸酶和核酸酶和核酸酶和
2、核酸3 3、提取、提取DNADNA的基本思路的基本思路利用利用利用利用DNADNADNADNA与与与与RNARNARNARNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取差异，提取差异，提取差异，提取DNADNADNADNA，去除其他成分，去除其他成分，去除其他成分，去除其他成分（一）提取（一）提取（一）提取（一）提取DNADNADNADNA的方法的方法的方法的方法实验原理实验原理1.DNA1.DNA在在NaClNaCl溶液中的溶解度，是随着溶液中的溶解度，是随着NaClNaC
3、l的浓度的变化而改变的。当的浓度的变化而改变的。当NaClNaCl的物的物质的量浓度为质的量浓度为0.14 mol0.14 molL L时时,DNA,DNA的溶解的溶解度最低。度最低。利用这一原理，可以使溶解在利用这一原理，可以使溶解在NaClNaCl溶液中的溶液中的DNADNA析出。析出。2.DNA2.DNA不溶于酒精溶液不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的可以进一步提取出含杂质较少的DNADNA。3.DNA3.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，
4、因，因此，二苯胺可以作为鉴定此，二苯胺可以作为鉴定DNADNA的试剂。的试剂。1 1 1 1、在沸水浴中，在沸水浴中，在沸水浴中，在沸水浴中，DNADNADNADNA遇遇遇遇二苯胺会染成蓝色，因此，二苯胺会染成蓝色，因此，二苯胺会染成蓝色，因此，二苯胺会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定二苯胺可以作为鉴定二苯胺可以作为鉴定二苯胺可以作为鉴定DNADNADNADNA的试剂的试剂的试剂的试剂 （二）（二）DNADNA的鉴定的鉴定2 2 2 2、甲基绿、甲基绿、甲基绿、甲基绿 （绿色）（绿色）（绿色）（绿色）（一）实验材料的选取（一）实验材料的选取 1 1、材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、材料：
5、鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取2 23 3种实验材料）种实验材料）2 2、原则：、原则：选用选用DNADNA含量相对较高、容易提取含量相对较高、容易提取的生物组织。的生物组织。鸡血鸡血3 3、合适的材料：、合适的材料：动物细胞的破碎较易，例如，在鸡血细胞动物细胞的破碎较易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水液中加入一定量的蒸馏水 ，同时用玻璃，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可棒搅拌，过滤后收集滤液即可（二）破碎细胞，获取
6、含（二）破碎细胞，获取含DNADNA的滤液的滤液1 1、动物细胞、动物细胞答：答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗溶液，蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗溶液，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，从而释放出从而释放出DNADNA。讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？2 2、植物细胞、植物细胞植植物物细细胞胞需需要要先先用用一一定定的的洗洗涤涤剂剂和和食盐溶解细胞膜食盐溶解细胞膜实实 例例：提提 取取 洋洋 葱葱DNADNA时时，在在切切碎碎的的洋洋葱葱中中加加入入一一定定的的洗洗涤涤剂剂和和食食盐盐，进进行行
7、充充分分的的搅搅拌拌和和研研磨磨，过过滤滤后收集研磨液后收集研磨液讨论：加入洗涤剂和食讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？盐的作用分别是什么？答：洗涤剂是一些离子去答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有污剂，能溶解细胞膜，有利于利于DNADNA的释放；食盐的的释放；食盐的主要成分是主要成分是NaClNaCl，有利于有利于DNADNA的溶解的溶解讨讨论论：如如果果研研磨磨不不充充分分，会会对对实验结果产生怎样的影响？实验结果产生怎样的影响？具体做法。具体做法。10mL鸡血鸡血20mL蒸馏水蒸馏水同同方向搅拌方向搅拌3层尼龙布过滤层尼龙布过滤滤液滤液答：研磨不充分会使细胞核内的答：研磨不
8、充分会使细胞核内的答：研磨不充分会使细胞核内的答：研磨不充分会使细胞核内的DNADNADNADNA释放不完全，释放不完全，释放不完全，释放不完全，提取的提取的提取的提取的DNADNADNADNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝量变少，影响实验结果，导致看不到丝量变少，影响实验结果，导致看不到丝量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等为为什什么么反反复复地地溶溶解解与与析析出出DNADNA，能能够够去除杂质去除杂质（三）去除滤液中的杂质（三）去除滤液中的杂质答：用高
9、盐浓度的溶液溶解答：用高盐浓度的溶液溶解答：用高盐浓度的溶液溶解答：用高盐浓度的溶液溶解DNADNADNADNA，能除能除能除能除去在去在去在去在高盐溶液高盐溶液高盐溶液高盐溶液中不能溶解的杂质；用中不能溶解的杂质；用中不能溶解的杂质；用中不能溶解的杂质；用低低低低盐溶液盐溶液盐溶液盐溶液使使使使DNADNADNADNA析出，能除去溶解在低盐析出，能除去溶解在低盐析出，能除去溶解在低盐析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出析出析出析出DNADNADNADNA，就能够除去就
10、能够除去就能够除去就能够除去与与与与DNADNADNADNA溶解度不同溶解度不同溶解度不同溶解度不同的多种杂质的多种杂质的多种杂质的多种杂质方案一、在滤液中加入方案一、在滤液中加入NaClNaCl，使，使NaClNaCl溶液浓度溶液浓度为为2mol/L2mol/L，过滤除去，过滤除去不溶的杂质不溶的杂质，再加入蒸馏，再加入蒸馏水，调节水，调节NaClNaCl溶液浓度为溶液浓度为0.14mol/L0.14mol/L，析出，析出DNADNA，过滤除去，过滤除去溶液中的杂质溶液中的杂质，在用，在用2mol/L2mol/L的的NaClNaCl溶液溶解溶液溶解DNADNA。讨论：方案二与方案三的原理有什
11、么不同？讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的而使提取的而使提取的而使提取的DNADNADNADNA与蛋白质分开；方案三利用与蛋白质分开；方案三利用与蛋白质分开；方案三利用与蛋白质分开；方案三利用的是的是的是的是DNADNADNADNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从和蛋白质对高温耐受性的不同，从和蛋白质对高温耐受性的不同，从和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋
12、白质变性，与而使蛋白质变性，与而使蛋白质变性，与而使蛋白质变性，与DNADNADNADNA分离分离分离分离方案二、直接在滤液中加入嫩肉粉，反应方案二、直接在滤液中加入嫩肉粉，反应10101515分钟。分钟。方案三、将滤液放在方案三、将滤液放在606075750 0C C的恒温水浴箱中保温的恒温水浴箱中保温10101515分钟。分钟。为了纯化提取的为了纯化提取的DNADNA需要将滤液作进一步处理需要将滤液作进一步处理讨讨论论：此此步步骤骤获获得得的的滤滤液液中中可可能能含含有有哪些细胞成分？哪些细胞成分？答：可能含有核蛋白、多糖和答：可能含有核蛋白、多糖和答：可能含有核蛋白、多糖和答：可能含有核
13、蛋白、多糖和RNARNA等杂质等杂质等杂质等杂质具体做法具体做法:方案一：方案一：30mL滤液滤液35gNaCl同方向搅拌，同方向搅拌，DNA溶解溶解加入蒸馏水加入蒸馏水DNA析出析出过滤得到过过滤得到过滤物滤物放到放到2mol/LNaCl溶液中溶解溶液中溶解DNA-NaCl溶解液溶解液方案二：方案二：30mL滤液嫩肉粉（木瓜蛋白酶）滤液嫩肉粉（木瓜蛋白酶）静置静置1015分钟分钟DNA滤液滤液方案三：方案三：30滤液滤液6075处理处理过滤获得过滤获得DNA滤液滤液（四）（四）DNADNA的析出与鉴定的析出与鉴定DNADNADNADNA的析出用的是与滤液的析出用的是与滤液的析出用的是与滤液的
14、析出用的是与滤液体积相等的体积相等的体积相等的体积相等的冷却的酒精溶冷却的酒精溶冷却的酒精溶冷却的酒精溶液（体积分数为液（体积分数为液（体积分数为液（体积分数为95 95 95 95），静置，静置，静置，静置2 2 2 23min3min3min3min，溶液中溶液中溶液中溶液中会出现会出现会出现会出现白色丝状物，白色丝状物，白色丝状物，白色丝状物，这就这就这就这就是粗提取是粗提取是粗提取是粗提取DNADNADNADNA。用玻璃棒用玻璃棒用玻璃棒用玻璃棒沿沿沿沿一个方向一个方向一个方向一个方向搅拌，卷起丝搅拌，卷起丝搅拌，卷起丝搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面状物，并用滤纸吸取上面状物，并用
15、滤纸吸取上面状物，并用滤纸吸取上面的水。的水。的水。的水。1 1、DNADNA的析出的析出鉴定鉴定鉴定鉴定DNADNADNADNA时在试管中先加入物时在试管中先加入物时在试管中先加入物时在试管中先加入物质的量的浓度为质的量的浓度为质的量的浓度为质的量的浓度为2mol/L 2mol/L 2mol/L 2mol/L 的的的的NaClNaClNaClNaCl溶液溶液溶液溶液5ml5ml5ml5ml于两只试管中，于两只试管中，于两只试管中，于两只试管中，其中一只加入其中一只加入其中一只加入其中一只加入DNADNADNADNA丝状物，各丝状物，各丝状物，各丝状物，各加入加入加入加入二苯胺二苯胺二苯胺二苯
16、胺4ml 4ml 4ml 4ml 试剂。混合均试剂。混合均试剂。混合均试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热匀后，将试管置于沸水中加热匀后，将试管置于沸水中加热匀后，将试管置于沸水中加热5min,5min,5min,5min,待试管冷却后，比较两待试管冷却后，比较两待试管冷却后，比较两待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看只试管中溶液颜色的变化，看只试管中溶液颜色的变化，看只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有看溶解有看溶解有看溶解有DNADNADNADNA的溶液是否有的溶液是否有的溶液是否有的溶液是否有蓝蓝蓝蓝色色色色2 2、DNADNA的鉴定的鉴定1、以以血血液液为为实实验验材材料料时
17、时，每每100ml血血液液中中需需要要加加入入3g柠柠檬檬酸酸钠钠，防防止止血液凝固。血液凝固。2、加加入入洗洗涤涤剂剂后后，动动作作要要轻轻缓缓、柔柔和和，否否则则容容易易产产生生大大量量的的泡泡沫沫，不不利利于于后后续续步步骤骤的的操操作作。加加入入酒酒精精和和玻玻璃璃棒棒搅搅拌拌时时，动动作作要要轻轻缓缓，以以免免加加剧剧DNA分分子子的的断断裂裂，导导致致DNA分分子子不能形成絮状沉淀。不能形成絮状沉淀。3、二二苯苯胺胺试试剂剂要要现现配配现现用用，否否则则会会影响鉴定的效果。影响鉴定的效果。制备鸡血细胞液制备鸡血细胞液加柠檬酸钠，静置或离心加柠檬酸钠，静置或离心破碎细胞，释放破碎细胞，释放DNA 加蒸馏水，同一方向快速通方向搅拌加蒸馏水，同一方向快速通方向搅拌过滤，除去细胞壁、细胞膜等。过滤，除去细胞壁、细胞膜等。溶解核内溶解核内DNA 加入加入NaCl至至2mol/L，同一方向缓慢搅，同一方向缓慢搅拌拌DNA析出析出加蒸馏水至加蒸馏水至0.14mol/L，过滤，在溶解到，过滤，在溶解到2mol/L溶液中溶液中除去细胞质中的大部分物质。除去细胞质中的大部分物质。DNA初步纯化初步纯化与等体积与等体积95冷却酒精混合，析出白色冷却酒精混合，析出白色丝状物丝状物除去核蛋白、除去核蛋白、RNA、多糖等。、多糖等。DNA鉴定鉴定 二苯胺，沸水浴，呈现蓝色二苯胺，沸水浴，呈现蓝色