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1、第三章 分子发光分析法n n第一节第一节 荧光分析法荧光分析法n n第二节第二节 磷光分析法磷光分析法n n第三节第三节 化学发光分析法化学发光分析法第一节第一节荧光分析法（荧光分析法（Fluorescence）一一 概述概述(一一)、分子发射光谱与分子能级结构、分子发射光谱与分子能级结构吸光吸光无辐射跃迁系间跨越单重线态三重线态荧光磷光E0E1E2振动弛豫内部转换(二)、分子吸收光谱与分子荧光光谱分子吸收光谱与分子荧光光谱吸光荧光250300350400450蒽乙醇溶液吸收和荧光光谱相对强度300 400 500相对强度荧光光谱与吸收光谱镜像对称荧光光谱较吸收光谱简单硫酸奎宁在稀硫酸中的荧光
2、光谱与吸收光谱(三三)、荧光量子产率（荧光效率）、荧光量子产率（荧光效率）发荧光的两个必要条件发荧光的两个必要条件 分子能吸收光子而跃迁至激发态分子能吸收光子而跃迁至激发态 激发态分子能以光的形式释放能量激发态分子能以光的形式释放能量荧光效率（荧光效率（f）=发出光子数发出光子数吸收光子数吸收光子数如果一个分子将吸收的光子全部如果一个分子将吸收的光子全部释放，则其量子产率为释放，则其量子产率为100%。化合物化合物 荧光效率荧光效率溶剂溶剂荧光素荧光素0.92（0.1MNaOH）曙红曙红0.19（0.1MNaOH）罗丹明罗丹明B0.97（乙醇）（乙醇）蒽蒽0.31（己烷）（己烷）核黄素核黄素0
3、.26（水，（水，pH7）菲菲0.10（乙醇）（乙醇）萘萘0.12（乙醇）（乙醇）酚酚0.22（水）（水）叶绿素叶绿素0.32（苯）（苯）某些化合物的荧光效率某些化合物的荧光效率(四四)、量子产率与分子结构、量子产率与分子结构荧光通常发生在具有刚性结构和平面结构的荧光通常发生在具有刚性结构和平面结构的-电子共轭体系分子中，任何有利于提高电子共轭体系分子中，任何有利于提高-电子共电子共轭度的结构改变，都将提高荧光轭度的结构改变，都将提高荧光量子产率，或使荧量子产率，或使荧光波长向长波长方向移动。光波长向长波长方向移动。化合物化合物荧光效率荧光效率平均波长平均波长苯苯0.07283联苯联苯0.18
4、316对联三苯对联三苯0.93342化合物化合物荧光效率荧光效率平均波长平均波长苯苯0.07283萘萘0.23334蒽蒽0.36402苯苯0.07283甲苯甲苯0.17285乙苯乙苯0.18286(五五)、荧光分析的特点、荧光分析的特点1、灵敏度高、灵敏度高2、选择性好、选择性好3、仪器简单、仪器简单4、应用范围广、应用范围广二二荧光定量分析基础荧光定量分析基础If=fIa=f(Io-I)If:荧光强度 Io:所吸收的辐射强度；f：荧光效率(一一)、荧光强度与浓度、荧光强度与浓度将指数展开：将指数展开：如果吸光度如果吸光度A 0.05,A 紫外紫外-可见吸收光谱光源可见吸收光谱光源激光诱导荧光
5、Laser Induced fluorescence低压汞灯：254 nm2、单色器、单色器滤光片滤光片棱镜棱镜光栅光栅400 500600nmRelative FL IntensityEXEMWavelength/Stocks位移标准1样品2Wavelength/If荧光光谱If1 1A1 If2 2A2=量子产率的测定量子产率的测定1A1 If1 2A2 If2=奎宁在0.1M的硫酸中荧光量子产率的绝对值为0.55。荧光分析的缺点散射光影响磷光分析的仪器磷光分析的仪器光源检测器贝克勒耳圆盘低温磷光分析低温磷光分析固体基质室温磷光分析固体基质室温磷光分析保护流体室温磷光分析保护流体室温磷光分
6、析无保护流体室温磷光分析无保护流体室温磷光分析磷光分析的缺点仪器复杂，需要固体基质或保护化学发光分析的仪器化学发光分析的仪器记录器四四荧光、磷光和化学发光分析法荧光、磷光和化学发光分析法（Fluorescence，phosphorescence and chemiluminescence analysis）(一一)、理论基础、理论基础1、分子发射光谱与分子能级结构、分子发射光谱与分子能级结构吸光吸光无辐射跃迁系间跨越单重线态三重线态荧光磷光E0E1E2振动弛豫（1）分子吸收光谱与分子荧光光谱）分子吸收光谱与分子荧光光谱吸光荧光250300350400450蒽乙醇溶液吸收和荧光光谱相对强度300
7、 400 500相对强度荧光光谱与吸收光谱镜像对称荧光光谱较吸收光谱简单硫酸奎宁在稀硫酸中的荧光光谱与吸收光谱（2）荧光量子产率（荧光效率）荧光量子产率（荧光效率）发荧光的两个必要条件发荧光的两个必要条件 分子能吸收光子而跃迁至激发态分子能吸收光子而跃迁至激发态 激发态分子能以光的形式释放能量激发态分子能以光的形式释放能量荧光效率（荧光效率（f）=发出光子数发出光子数吸收光子数吸收光子数如果一个分子将吸收的光子全部如果一个分子将吸收的光子全部释放，则其量子产率为释放，则其量子产率为100%。化合物化合物 荧光效率荧光效率溶剂溶剂荧光素荧光素0.92（0.1MNaOH）曙红曙红0.19（0.1M
8、NaOH）罗丹明罗丹明B0.97（乙醇）（乙醇）蒽蒽0.31（己烷）（己烷）核黄素核黄素0.26（水，（水，pH7）菲菲0.10（乙醇）（乙醇）萘萘0.12（乙醇）（乙醇）酚酚0.22（水）（水）叶绿素叶绿素0.32（苯）（苯）某些化合物的荧光效率某些化合物的荧光效率（3）量子产率与分子结构）量子产率与分子结构荧光通常发生在具有荧光通常发生在具有刚性刚性结构和结构和平面平面结构的结构的-电子共轭体系分子中，任何有利于提高电子共轭体系分子中，任何有利于提高-电子共电子共轭度的结构改变，都将提高荧光轭度的结构改变，都将提高荧光量子产率，或使荧量子产率，或使荧光波长向长波长方向移动。光波长向长波长方
9、向移动。化合物化合物荧光效率荧光效率平均波长平均波长苯苯0.07283联苯联苯0.18316对联三苯对联三苯0.93342化合物化合物荧光效率荧光效率平均波长平均波长苯苯0.07283萘萘0.23334蒽蒽0.36402苯苯0.07283甲苯甲苯0.17285乙苯乙苯0.182862、荧光定量分析基础荧光定量分析基础If=fIa=f(Io-I)If:荧光强度 Io:所吸收的辐射强度；f：荧光效率（1）荧光强度与浓度）荧光强度与浓度将指数展开：将指数展开：如果吸光度如果吸光度A 0.05,A 紫外紫外-可见吸收光谱光源强度可见吸收光谱光源强度激光诱导荧光Laser Induced fluores
10、cence低压汞灯：254 nm2、单色器、单色器滤光片滤光片棱镜棱镜光栅光栅400 500600nmRelative FL IntensityEXEMWavelength/Stocks位移标准1样品2Wavelength/If荧光光谱If1 1A1 If2 2A2=量子产率的测定量子产率的测定1A1 If1 2A2 If2=奎宁在0.1M的硫酸中荧光量子产率的绝对值为0.55。荧光分析的缺点散射光影响（3）荧光分析的特点）荧光分析的特点p灵敏度高灵敏度高p选择性好选择性好p仪器简单仪器简单p应用范围广应用范围广第二节第二节 磷光分析法磷光分析法低温磷光分析低温磷光分析固体基质室温磷光分析固体
11、基质室温磷光分析保护流体室温磷光分析保护流体室温磷光分析无保护流体室温磷光分析无保护流体室温磷光分析一一 低温磷光分析法低温磷光分析法n n低温磷光分析是将试样溶于有机溶剂中，在低温磷光分析是将试样溶于有机溶剂中，在液氮（温度液氮（温度77K77K）条件下形成刚性玻璃状物后，）条件下形成刚性玻璃状物后，测量磷光测量磷光.这样，可减小分子间的碰撞，防止这样，可减小分子间的碰撞，防止磷光猝灭磷光猝灭.所用的溶剂应具备下列条件：所用的溶剂应具备下列条件：n n易于制备和提纯；易于制备和提纯；能很好的溶解被分析能很好的溶解被分析物质；物质；在在77K77K温度下应有足够的粘度并能形温度下应有足够的粘度
12、并能形成明净的刚性玻璃体；成明净的刚性玻璃体；在所研究的光谱区在所研究的光谱区背景要低，没有明显的光吸收和光发射现象背景要低，没有明显的光吸收和光发射现象.表表3.23.2列出了部分低温磷光分析常用试剂列出了部分低温磷光分析常用试剂.低温磷光分析常用试剂低温磷光分析常用试剂溶剂及组成溶剂及组成溶剂及组成溶剂及组成混合比例（混合比例（混合比例（混合比例（V/VV/V）使用温度使用温度使用温度使用温度乙醇异戊醇乙醚乙醇异戊醇乙醚乙醇异戊醇乙醚乙醇异戊醇乙醚（EPAEPA）2 25 55 577K77K异丙醇异戊醇乙醚异丙醇异戊醇乙醚异丙醇异戊醇乙醚异丙醇异戊醇乙醚2 25+55+577K77K乙醇
13、甲醇碘乙（丙）乙醇甲醇碘乙（丙）乙醇甲醇碘乙（丙）乙醇甲醇碘乙（丙）烷烷烷烷16164 41 177K77K水乙二醇水乙二醇水乙二醇水乙二醇1 12 2123K123K150K150KEPAEPA氯仿氯仿氯仿氯仿12121 177K77KEPA+EPA+碘甲烷（碘甲烷（碘甲烷（碘甲烷（IEPAIEPA）10+110+177K77K三乙醇胺三乙醇胺三乙醇胺三乙醇胺纯溶剂纯溶剂纯溶剂纯溶剂193K193K213K213K 二二 室温磷光分析n n低温磷光需要适当的低温条件，限制了它的应用及发展.室温磷光分析避免了低温条件，将试样固定在滤纸、硅胶、氧化铝、玻璃纤维、淀粉、溴化钾等基体上，以增加其刚性
14、，减少三重态的碰撞猝灭，增强磷光相对强度.磷光分析的仪器磷光分析的仪器光源检测器贝克勒耳圆盘第三节 化学发光分析法n n化学反应中，产物分子吸收了反应过程中释放的化学能而被激发，在返回基态时发出光辐射称为化学发光，根据化学发光强度或化学反应产生的总发光强度来确定物质含量的方法称为化学发光分析法。一一 化学发光分析的基本理论化学发光分析的基本理论 n n(一一)化学发光反应的基本要求：化学发光反应的基本要求：n n(1).(1).化学反应必须提供足够的化学能，且被发光物质化学反应必须提供足够的化学能，且被发光物质吸收形成电子激发态吸收形成电子激发态.如果在如果在760nm760nm280nm28
15、0nm的可见的可见紫外光区产生化学发光，则要求化学反应提供紫外光区产生化学发光，则要求化学反应提供160160420KJ.mol-1420KJ.mol-1之间的能量，具有过氧化物中间产物的之间的能量，具有过氧化物中间产物的氧化还原反应一般能满足这种要求氧化还原反应一般能满足这种要求.因此，化学发光因此，化学发光反应大多数是有反应大多数是有H H2 2O O2 2、O O3 3等参加的高能氧化还原反等参加的高能氧化还原反应应.n n（2 2）.吸收化学能处于电子激发态的分子返回到基态吸收化学能处于电子激发态的分子返回到基态时，能以光的形式释放出能量，或把能量转移到一个时，能以光的形式释放出能量，
16、或把能量转移到一个合适的接受体上，该接受体能以光的形式释放能量，合适的接受体上，该接受体能以光的形式释放能量，产生敏化化学发光产生敏化化学发光(sensitzed chemiluminescence).(sensitzed chemiluminescence).化学发光效率CLn n化学发光效率等于激发态分子的产率化学发光效率等于激发态分子的产率CeCe和激发态和激发态分子的发光效率分子的发光效率emem之乘积之乘积.n n 化学发光的强度与反应物浓度间的关系 根据化学发光发生和消失时间的长短，通常分为快发光和慢发光两种.快发光在反应进行1秒之内即可达到发光峰值，在5秒之内峰值衰减90，慢发光
17、的发生和衰减时间相对要长一些.不论是快发光还是慢发光，化学发光的相对强度ICL决定于化学发光反应的转化速率，而后者常用单位时间内反应物或产物浓度的变化表示.灵敏度和检出限 n n化学发光分析法的灵敏度通常不是由仪器可检测化学发光分析法的灵敏度通常不是由仪器可检测的最低浓度决定的，因为许多化学发光法都是高的最低浓度决定的，因为许多化学发光法都是高灵敏的，仪器检测光的能量不是主要问题，而环灵敏的，仪器检测光的能量不是主要问题，而环境污染和其它低浓度的干扰因素及排除显得特别境污染和其它低浓度的干扰因素及排除显得特别重要，它们往往决定方法的灵敏度重要，它们往往决定方法的灵敏度.n n一般把所产生的化学
18、发光相对强度等于空白信号一般把所产生的化学发光相对强度等于空白信号标准偏差标准偏差S S0 0三倍时的被测物浓度作为它的检测下三倍时的被测物浓度作为它的检测下限，简称检出限（限，简称检出限（detection limit,DLdetection limit,DL）.二 化学发光分析的主要类型 (一)液相化学发光 n n1.鲁米诺(Luminol)体系n n2.光泽精（lucigenin）体系n n3.过氧草酰（peroxyoxalate）体系(二)气相化学发光分立取样式液相化发光仪 75618910RecAMPPMT负高压234化学发光分析的仪器化学发光分析的仪器记录器Chemilumines
19、cence Sensors based on Enhanced emission on Rare-earth doped nanoparticlesZhenyu Zhang,et al,submitted to Anal.Chem.Zhenyu Zhang,et al,submitted to Anal.Chem.CL Spectrum of Tb-doped and CL Spectrum of Tb-doped and pure Zrpure ZrO2 dopeddopedpurepureFluorescence Spectrum of TbFluorescence Spectrum of Tbnmnmnmnm