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1、第三章第三章核酸的分离与检测核酸的分离与检测本讲稿第一页，共九十七页从哪儿提取（从哪儿提取（Where）？）？怎么提取（怎么提取（How）？）？提到什么程度（提到什么程度（What）？）？会出现什么问题（会出现什么问题（Questions）？）？如何解决（如何解决（Solution）？）？本讲稿第二页，共九十七页主要内容主要内容本讲稿第三页，共九十七页核酸提取的原则和基本要求核酸提取的原则和基本要求本讲稿第四页，共九十七页Principleandsteps Principle Principle 1.1.保持核酸的完整性；保持核酸的完整性；2.2.提高核酸的质量（纯度和浓度）。提高核酸的质量（
2、纯度和浓度）。Requirements for purification Requirements for purification1.1.不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；子；2.2.其他事物大分子（其他事物大分子（PrPr、sugar and lipidsugar and lipid）3.3.其他核酸污染其他核酸污染本讲稿第五页，共九十七页核酸提取的一般过程核酸提取的一般过程本讲稿第六页，共九十七页Principleandsteps Steps Steps1.1.样品准备（取材）样品准备（取材）2.2.破细胞（物理法、化学法
3、、酶破细胞（物理法、化学法、酶法）；法）；3.3.除杂质（蛋白质、脂类、糖类除杂质（蛋白质、脂类、糖类和不需要的核酸）；和不需要的核酸）；4.4.沉淀提纯沉淀提纯I.I.材料准备材料准备II.II.破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放III.III.核酸分离、纯化核酸分离、纯化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中本讲稿第七页，共九十七页破碎细胞破碎细胞-方法方法1.1.机械方法机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；：超声波处理法、研磨法、匀浆法；2.2.化学试剂法化学试剂法：用：用SDSSDS
4、或或CTABCTAB处理细胞；处理细胞；3.3.酶解法酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。碎。本讲稿第八页，共九十七页破碎细胞破碎细胞-来源来源1.1.动物：动物：小牛胸腺小牛胸腺动物肝脏、血液和肌肉组织等动物肝脏、血液和肌肉组织等鱼类精子；鱼类精子；2.2.植物：植物：种子的胚中都含有丰富的种子的胚中都含有丰富的DNADNA。3.3.微生物：微生物：谷氨酸菌体含谷氨酸菌体含7%10%7%10%，面包酵母含，面包酵母含4%4%，啤，啤酒酵母含酒酵母含6%6%，大肠肝菌含，大肠肝菌含9%10%9%10%（培养过夜）。（培养过夜）。NoteNote：从
5、各种材料中提取从各种材料中提取DNADNA方法不同，分离提取的难易程度也不同。方法不同，分离提取的难易程度也不同。对于低等生物。如从病毒中提取对于低等生物。如从病毒中提取DNA DNA 比较容易，多数病毒比较容易，多数病毒DNA DNA 分子量较小，提取分子量较小，提取时易保持其结构完整性。时易保持其结构完整性。从高等动植物中提取从高等动植物中提取DNADNA难度大一些。因分子量较大，易被机械张力剪断。难度大一些。因分子量较大，易被机械张力剪断。本讲稿第九页，共九十七页破碎细胞破碎细胞（来源（来源-方法）方法）微生物：微生物：溶菌酶、溶菌酶、SDSSDS裂解。裂解。高等植物：高等植物：捣碎器破
6、碎、液氮研磨。捣碎器破碎、液氮研磨。酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。动物动物：液氮处理后用匀浆器破碎。：液氮处理后用匀浆器破碎。细胞器细胞器DNADNA：首先纯化细胞器。首先纯化细胞器。以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂本讲稿第十页，共九十七页抽提核酸除去杂质抽提核酸除去杂质 1 1首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它成分分离其它成分分离2 2使核酸与蛋白质分离使核酸与蛋白质分离3 3除去脂类除去脂类 4 4多糖的
7、除去多糖的除去Howtoremove？本讲稿第十一页，共九十七页核酸的纯化核酸的纯化根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染,并并除去提取过程中的系列试剂除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等）杂质，盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。最后得到均一的核酸样品。Howtodo？本讲稿第十二页，共九十七页核酸样品的保存核酸样品的保存核酸保存的主要条件是核酸保存的主要条件是温度温度和和介质介质温度：温度：4 4（55）最佳和最简单）最佳和最简单 -70 -70是长期保存的良好温度，为一次性保存是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20 -20保存保
8、存保存介质：保存介质：TE TE缓冲溶液缓冲溶液(最常用最常用)10mmol/L Tris-HCl pH8.0 10mmol/L Tris-HCl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0本讲稿第十三页，共九十七页关键试剂的作用关键试剂的作用本讲稿第十四页，共九十七页关键试剂的作用关键试剂的作用核酸酶的抑制和抑制剂核酸酶的抑制和抑制剂 降低温度，改变降低温度，改变pHpH及盐的浓度，都利于对及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。更有利，当然，几个条件并
9、用更好。对于对于DNADNA，抑制，抑制DNaseDNase活力很容易，但防止活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。机械张力拉断则更重要。对于对于RNARNA，因分子较小，不易被机械张力拉，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制断，但抑制RNaseRNase活力较难，故在活力较难，故在RNARNA提取中设提取中设法抑制法抑制RNaseRNase更重要。更重要。本讲稿第十五页，共九十七页关键试剂的作用关键试剂的作用核酸酶的抑制和抑制剂核酸酶的抑制和抑制剂 RNaseRNase抑制抑制 操作要带手套。操作要带手套。所有器皿要严格消毒，所有器皿要严格消毒，试剂处理试剂处理 低温操作低温操作 在分离
10、过程中要加入一定的在分离过程中要加入一定的RNaseRNase抑制剂。抑制剂。本讲稿第十六页，共九十七页关键试剂的作用关键试剂的作用核酸制备中常用的去垢剂核酸制备中常用的去垢剂 核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用：去垢剂的作用：1 1溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；2 2溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；放出来；3 3对对RNaseRNase、DNaseDNas
11、e有一定的抑制作用。有一定的抑制作用。本讲稿第十七页，共九十七页关键试剂的作用关键试剂的作用核酸制备中常用的蛋白质变性剂核酸制备中常用的蛋白质变性剂 蛋白蛋白质变性剂的作用：质变性剂的作用：1.1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。以防造成蛋白污染。2.2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。3.3.某些蛋白质变性剂也有抑制某些蛋白质变性剂也有抑制RNaseRNase活性和破裂细活性和破裂细胞的作用。胞的作用。如：苯酚、氯仿、盐酸胍、如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPCDEPC本
12、讲稿第十八页，共九十七页关键试剂的作用关键试剂的作用核酸制备中常用的酶核酸制备中常用的酶 DNase DNase RNase RNase 蛋白酶蛋白酶K K 溶菌酶溶菌酶 本讲稿第十九页，共九十七页核酸的部分特征核酸的部分特征本讲稿第二十页，共九十七页核酸的部分特征核酸的部分特征1.1.存在形式存在形式2.2.pHpH值影响值影响3.3.盐影响盐影响4.4.温度影响温度影响本讲稿第二十一页，共九十七页1.1.存在形式存在形式 RNA RNA和核苷酸的纯品都呈和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶白色粉末或结晶，DNADNA则为则为白色类白色类似石棉样似石棉样的纤维状物。的纤维状物。DNA DNA、R
13、NARNA和核苷酸都是和核苷酸都是极性化合物极性化合物，一般都溶于水，不，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNARNA钠盐在水中溶解度可达钠盐在水中溶解度可达40g/L40g/L。天然状态的天然状态的DNA DNA 是以脱氧核糖核蛋白是以脱氧核糖核蛋白(DNP)(DNP)形式存在于形式存在于细胞核中。要从细胞中提取细胞核中。要从细胞中提取DNA DNA 时，先把时，先把DNPDNP抽提出来，再把抽提出来，再把P P除去，再除去细胞中的糖，除去，再除去细胞中的糖，RNA RNA 及无机离子等，从中分离及无
14、机离子等，从中分离DNA DNA。removal of Pr removal of Pr本讲稿第二十二页，共九十七页2.pH2.pH值的影响值的影响DNADNA在水中为在水中为10g/L10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，中，DNADNA、RNARNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。定。在在pHpH值高达值高达12.612.6的碱性条件下，双螺旋结构解开而的碱性条件下，双螺旋结构解开而变性。质粒变性。质粒DNADNA两条互补链不会完全分离，当以两条互补链不会完全分离，当以pH pH 4.84.8的的NaAcNaAc高盐缓冲液
15、去调节其高盐缓冲液去调节其pHpH值至中性时，变性值至中性时，变性的质粒的质粒DNADNA完全复性，而染色体完全复性，而染色体DNADNA不能复性而形成缠不能复性而形成缠连的网状结构连的网状结构碱变性法（碱变性法（for plasmid DNAfor plasmid DNA）本讲稿第二十三页，共九十七页3.3.盐影响盐影响DNPDNP在在低浓度盐溶液低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在中，几乎不溶解，如在0.14 0.14 mol/Lmol/L的氯化钠溶解度最低的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的，仅为在水中溶解度的1%1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1m
16、ol/L1mol/L氯化氯化钠中的溶解度很大，比纯水高钠中的溶解度很大，比纯水高2 2倍。倍。RNPRNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在在0.14mol/L0.14mol/L氯化钠中溶解度较大氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时，。因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。盐溶液中的溶解度常用此法分离这两种核蛋白。盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。受盐浓度的影响而不同。浓盐法浓盐法本讲稿第二十四页，共九十七页4.4.温度影响温度影响高温变性高温变性低温复性低温复性沸水浴法（沸水浴法（for plasmid DNAfor plasmid DNA）
17、本讲稿第二十五页，共九十七页核酸的常用提取方法核酸的常用提取方法本讲稿第二十六页，共九十七页常用的常用的DNADNA提取方法提取方法浓盐法浓盐法阴离子去污剂法阴离子去污剂法苯酚抽提法苯酚抽提法水抽提法水抽提法沸水浴法沸水浴法碱变性法碱变性法本讲稿第二十七页，共九十七页1.1.浓盐法浓盐法原理：原理：利用利用RNPRNP和和DNPDNP在电解溶液中溶解度不同，将二者在电解溶液中溶解度不同，将二者分离；分离；常用的方法：常用的方法：用用1M 1M 氯化钠氯化钠提取氯化钠抽提提取氯化钠抽提,得到的得到的DNPDNP粘粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化使乳化,再离心
18、除去蛋再离心除去蛋白质白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而，而DNADNA位于上层水相中位于上层水相中,用用2 2倍体积倍体积95%95%乙醇可将乙醇可将DNA DNA 钠盐沉钠盐沉淀出来（淀出来（也可用也可用0.15 MNaCL0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液液反复洗涤细胞破碎液除去除去RNP,RNP,再以再以1MNaCL1MNaCL提取脱氧核糖蛋白提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿再按氯仿-异醇法除去蛋白）。异醇法除去蛋白）。本讲稿第二十八页，共九十七页1.1.浓盐法浓盐法注意注意以稀盐酸溶液提取以稀盐酸溶液提取DNA DNA 时时,加入适量加
19、入适量去污剂去污剂,如如SDSSDS可有可有助于蛋白质与助于蛋白质与DNA DNA 的分离。的分离。在提取过程中为抑制组织中的在提取过程中为抑制组织中的DNaseDNase对对DNA DNA 的降解作用的降解作用,在氯化钠溶液中加入在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂作为金属离子的烙合剂.通常用通常用0.15MNaCL,0.015M0.15MNaCL,0.015M柠檬钠柠檬钠,并称并称SSCSSC溶液溶液,提取提取DNA.DNA.本讲稿第二十九页，共九十七页2.2.阴离子去污剂法阴离子去污剂法用用SDSSDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可
20、可以直接从生物材料中提取以直接从生物材料中提取DNADNA。由于细胞中由于细胞中DNADNA与与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴因为阴离子去污剂能够破坏这种价键离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去所以常用阴离子去污剂提取污剂提取DNA.DNA.本讲稿第三十页，共九十七页3.3.苯酚抽提法苯酚抽提法苯酚作为蛋白变性剂苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了同时抑制了DNaseDNase的降解作用。的降解作用。用苯酚处理匀浆液时用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与由于蛋白与DNA DNA 联结键已断联结键已断,蛋白分子蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶
21、表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而蛋白分子溶于酚相，而DNADNA溶于水相。离心分层后取出溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含水层，多次重复操作，再合并含DNA DNA 的水相。的水相。利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA DNA。此时。此时DNADNA是十分是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的使提取的DNADNA保持天然状态。保持天然状态。本讲稿第三十一页，共九十七页4.4.水抽提法水抽提法利用核酸溶解于水的性质利用核酸溶解于水的性质
22、,将组织细胞破碎后将组织细胞破碎后,用低用低盐溶液除去盐溶液除去RNARNA，然后将沉淀溶于水中，使，然后将沉淀溶于水中，使DNADNA充分溶充分溶解于水中解于水中,离心后收集上清液；离心后收集上清液；在上清中加入在上清中加入固体氯化钠固体氯化钠调节至调节至2.6M2.6M。加入。加入2 2倍体积倍体积95%95%乙醇乙醇,立即用搅拌法搅出；立即用搅拌法搅出；然后分别用然后分别用66%66%80%80%和和95%95%乙醇以及丙酮洗涤；乙醇以及丙酮洗涤；最后在空气中干燥最后在空气中干燥,既得既得DNADNA样品。样品。此法提取的此法提取的DNADNA中蛋白质含量较高中蛋白质含量较高,故一般不用
23、。故一般不用。本讲稿第三十二页，共九十七页5.5.沸水浴法（提取大肠杆菌沸水浴法（提取大肠杆菌质粒质粒DNADNA）1.1.在在EppendorfEppendorf管中加入管中加入110 ml110 ml的的STETSTET（使用前加入溶菌（使用前加入溶菌酶至终浓度为酶至终浓度为5 mg/ml5 mg/ml）（蔗糖）（蔗糖8 8，Triton X-100Triton X-1005 5，Tris-HCl(pH8.0)Tris-HCl(pH8.0)50 mM 50 mM，EDTA(pH8.0)EDTA(pH8.0)50 mM 50 mM）溶液，）溶液，挑入米粒大小的菌团，充分悬浮并混匀。挑入米粒大
24、小的菌团，充分悬浮并混匀。2.2.上述菌体悬浮液上述菌体悬浮液沸水煮沸水煮3030秒秒。3.3.迅速放置于迅速放置于常温常温下下15000 rpm15000 rpm离心离心1515分钟。分钟。本讲稿第三十三页，共九十七页5.5.沸水浴法（提取大肠杆沸水浴法（提取大肠杆菌质粒菌质粒DNADNA）4.4.用牙签挑去菌体碎片（白色沉淀），在上清液中加入用牙签挑去菌体碎片（白色沉淀），在上清液中加入100 ml100 ml的的异丙醇异丙醇，充分混匀后，充分混匀后44，15000 rpm15000 rpm离心离心2020分分钟。钟。5.5.弃上清液，加入弃上清液，加入70%70%冰乙醇冰乙醇400 ml
25、400 ml，44，15000 15000 rpmrpm离心离心5 5分钟。分钟。6.6.沉淀凉干后用沉淀凉干后用50 ml50 ml无菌重蒸水溶解。无菌重蒸水溶解。7.7.取取5 ml5 ml电泳检测。电泳检测。本讲稿第三十四页，共九十七页6.6.碱变性法碱变性法原理：原理：碱变性抽提质粒碱变性抽提质粒DNADNA是基于染色体是基于染色体DNADNA与质粒与质粒DNADNA的的变性与复性的差异而达到分离目的。变性与复性的差异而达到分离目的。在在高高pHpH值值条件下，染色体条件下，染色体DNADNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒性。质粒DNADNA的大部
26、分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离；互补链不会完全分离；当当pHpH值调至至中性值调至至中性时，变性的质粒时，变性的质粒DNADNA又恢复原来的构型，保存又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体在溶液中，而染色体DNADNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体心，染色体DNADNA与不稳定的大分子与不稳定的大分子RNARNA、蛋白质、蛋白质SDSSDS复合物等一起复合物等一起沉淀下来而被除去。沉淀下来而被除去。本讲稿第三十五页，共九十七页核酸提取的经典案例核酸提取的经典案例本讲稿
27、第三十六页，共九十七页主要案例主要案例 碱变性法制备大肠杆菌质粒碱变性法制备大肠杆菌质粒DNA DNA 大肠杆菌染色体大肠杆菌染色体DNADNA的抽提的抽提 CTAB CTAB法提取植物基因组法提取植物基因组DNA DNA 本讲稿第三十七页，共九十七页6.6.碱变性法（制备大肠碱变性法（制备大肠杆菌质粒杆菌质粒DNADNA）1.1.5 ml1.1.5 ml培养物培养物6000 rpm6000 rpm，44离心离心1010分钟，弃去上分钟，弃去上清液。清液。2.2.加入加入100 ml100 ml溶液溶液I I悬浮菌体，室温放置悬浮菌体，室温放置5 5分钟。分钟。3.3.加入加入200 ml20
28、0 ml溶液溶液IIII，立即轻轻混匀，室温放置至溶液，立即轻轻混匀，室温放置至溶液几乎澄清。几乎澄清。4.4.加入加入150 ml150 ml溶液溶液IIIIII，轻轻混匀，冰浴，轻轻混匀，冰浴3030分钟。分钟。5.45.4，15000 rpm15000 rpm离心离心2020分钟，收集上清液。分钟，收集上清液。6.6.上清液中加入等体积的上清液中加入等体积的苯酚苯酚饱和溶液（饱和溶液（400 ml400 ml）氯仿氯仿，充分混匀，充分混匀，44，15000 rpm15000 rpm离心离心2020分钟，将上清液转移分钟，将上清液转移至另一离心管。至另一离心管。本讲稿第三十八页，共九十七页
29、6.6.碱变性法（制备大肠碱变性法（制备大肠杆菌质粒杆菌质粒DNADNA）7.7.在上清液中加入在上清液中加入400 ml400 ml氯仿氯仿溶液，混匀，溶液，混匀，10000 rpm10000 rpm离心离心1010分钟，将上清液转移至另一离心管。分钟，将上清液转移至另一离心管。8.8.在上清液中加入在上清液中加入400 ml400 ml异丙醇异丙醇，2020放置放置3030分钟，分钟，44，15000 rpm15000 rpm离心离心2020分钟。分钟。9.9.用用400 ml 75%400 ml 75%的的冰乙醇冰乙醇洗涤一次，凉干。洗涤一次，凉干。10.10.加入加入50 ml50 m
30、l无菌重蒸水溶解质粒无菌重蒸水溶解质粒DNADNA。11.11.取取2 ml2 ml作酶切电泳检查。作酶切电泳检查。本讲稿第三十九页，共九十七页6.6.碱变性法碱变性法-试剂试剂溶液溶液I I：D-GlucoseD-Glucose 50 mmol/L 50 mmol/L，Tris-HclTris-Hcl（pH pH 8.08.0）50mmol/L50mmol/L，EDTAEDTA（pH 8.0pH 8.0）10mmol/L 10mmol/L121121消毒消毒2020分钟，使用时加入溶菌酶，终浓为分钟，使用时加入溶菌酶，终浓为 5mg/ml 5mg/ml 溶液溶液IIII：SDSSDS1%1%
31、NaOH NaOH0.2 mol/L0.2 mol/L溶液溶液IIIIII：KAcKAc（pH5.5pH5.5）3 mol/L 3 mol/L本讲稿第四十页，共九十七页溶液溶液-溶菌液溶菌液1 1溶菌酶：溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的的主要化学成分肽聚糖中的-1-1，4 4糖苷键，因而具有溶糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中菌的作用。当溶液中pHpH小于小于8 8时，溶菌酶作用受到抑制。时，溶菌酶作用受到抑制。（保持碱性和较低的离子强度环境）（保持碱性和较低的离子强度环境）葡萄糖：葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止增加溶
32、液的粘度，维持渗透压，防止DNADNA受机械受机械切力作用降解。切力作用降解。本讲稿第四十一页，共九十七页溶液溶液-溶菌液溶菌液2.EDTA的作用的作用：（1）螯合螯合Mg2、Ca2等金属离子，抑制脱氧核酸酶等金属离子，抑制脱氧核酸酶对对DNA的降解作用（的降解作用（DNase作用时一定的金属离子作用时一定的金属离子作辅基）。作辅基）。（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。本讲稿第四十二页，共九十七页溶液溶液-NaOH-SDS液液 NaOH：核酸在核酸在pH大于大于5，小于，
33、小于9的溶液中，是稳定的溶液中，是稳定的的。但当。但当pH12或或pH3时，就会引起双链之间氢键的时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液解离而变性。在溶液中的中的NaOH浓度为浓度为0.2mol/L,加抽加抽提液时，该系统的提液时，该系统的pH就高达就高达12.6,因而促使染色体因而促使染色体DNA与质粒与质粒DNA的变性的变性.本讲稿第四十三页，共九十七页溶液溶液-NaOH-SDS液液SDS：SDSSDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1 1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。坏细胞
34、膜。（2 2）解聚细胞中的核蛋白。）解聚细胞中的核蛋白。（3 3）SDSSDS能与蛋白质结合成为能与蛋白质结合成为R-O-SO3R+-R-O-SO3R+-蛋白质蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDSSDS能抑能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNaseRNase去除去除RNARNA时）受到干扰。时）受到干扰。本讲稿第四十四页，共九十七页溶液溶液-3MOL/LNaAc(pH4.8)溶液溶液NaAc的水溶液呈碱性
35、，为了调节的水溶液呈碱性，为了调节pH至至4.8,必须加必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是NaAc-HAc的的缓冲液。用缓冲液。用pH4.8的的NaAc溶液溶液是是为了将为了将pH12.6的抽的抽提液调回提液调回pH至中性至中性,使变性的质粒使变性的质粒DNA能够复性能够复性,并能并能稳定存在。而高盐的稳定存在。而高盐的3Mol/LNaAc有利于变性的大分子有利于变性的大分子染色体染色体DNA,RNA,以及以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷前者是因为中和核酸上的电荷,减少相斥力而互相聚合减少相斥力而互相
36、聚合,后者是因为钠盐与后者是因为钠盐与SDS-蛋白复合物作用后蛋白复合物作用后,能形成较小能形成较小的钠盐形式复合物的钠盐形式复合物,使沉淀更完全。使沉淀更完全。本讲稿第四十五页，共九十七页大肠杆菌染色体大肠杆菌染色体DNADNA的抽提的抽提 大肠杆菌传一代后大肠杆菌传一代后30ml液体液体LB培养基以培养基以10%接种量接种量培养培养6小时小时，6000rpm，4，离心，离心10分钟收获菌体沉淀。分钟收获菌体沉淀。沉淀中加入沉淀中加入3.6mlBufferA（含溶菌酶（含溶菌酶5mg/ml），旋涡振荡混匀，），旋涡振荡混匀，37保温保温30分钟。分钟。加入加入400ml10%SDS使最终浓度
37、为使最终浓度为1%，混匀，混匀，37保温保温30分钟或澄分钟或澄清即可。清即可。加入加入10ml20mg/ml的的ProK至最终浓度为至最终浓度为1mg/ml，60保温保温60分钟。分钟。加入加入1ml预先冷冻的预先冷冻的5mol/LNaCl至最终浓度为至最终浓度为1mol/L，充分混，充分混匀后冰浴匀后冰浴30分钟。分钟。4，15000rpm，离心，离心30min。本讲稿第四十六页，共九十七页大肠杆菌染色体大肠杆菌染色体DNADNA的抽提的抽提 取上清加入等体积（取上清加入等体积（5ml）的）的苯酚苯酚饱和溶液，充分混匀后饱和溶液，充分混匀后4，15000rpm，离心，离心30分钟。分钟。取
38、上清加入等体积的取上清加入等体积的氯仿氯仿充分混匀后充分混匀后13000rpm，4，离心，离心10分钟。分钟。取上清加入取上清加入0.8V（4ml）异丙醇异丙醇充分混匀后充分混匀后-20放置放置30分钟以上，分钟以上，4，15000rpm，离心，离心30分钟。分钟。弃上清，沉淀用弃上清，沉淀用3ml70%的的冰乙醇冰乙醇洗涤，洗涤，4，15000rpm，离心，离心5分钟。分钟。弃上清，沉淀于弃上清，沉淀于37凉干后，用凉干后，用1mlddH2O溶解并移入溶解并移入Eppendorf管管中。中。取取5ml电泳。电泳。本讲稿第四十七页，共九十七页CTAB法提取植物法提取植物基因组基因组DNACTA
39、B(十六烷基三乙基溴化铵十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（度到一定程度（0.3mol/LNaCl）时，从溶液中沉淀，）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。类物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而，而CTAB溶溶于乙醇或异丙醇而除去。于乙醇或异丙醇而除去。本讲稿第四十八页，共九十七页本
40、讲稿第四十九页，共九十七页实验程序实验程序1.在在2mL离心管中，加入离心管中，加入500l的的2CTAB和和20l-巯基乙巯基乙醇醇,65预热。预热。2嫩的组织材料嫩的组织材料1-2g,用蒸馏水冲洗干净，再用灭菌用蒸馏水冲洗干净，再用灭菌ddH2O冲冲洗洗2次，放入经液氮预冷的研钵中，加入次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨液氮研磨至粉末至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到预热的离心管中，状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到预热的离心管中，总体积达到总体积达到1mL混匀后置混匀后置65水浴中保温水浴中保温45-60min，并，并不时轻轻转动试管。不时轻轻转动试管。注：注：冻存材料直接研
41、磨，绝对不能化冻。而且粉末应在冻存材料直接研磨，绝对不能化冻。而且粉末应在化冻前转移否则内源性化冻前转移否则内源性Dnase有可能降解有可能降解基因组基因组DNA。本讲稿第五十页，共九十七页实验程序实验程序3加等体积的加等体积的氯仿氯仿/异戊醇异戊醇，轻轻地颠倒混匀，室温下，轻轻地颠倒混匀，室温下10000rpm离心离心10min，移上清至另一新管中。，移上清至另一新管中。4向管中加入向管中加入1/100体积的体积的RNaseA溶液，置溶液，置3720-30min。5加入加入2倍体积的倍体积的100%乙醇乙醇或或0.7倍体积异丙醇，会出现倍体积异丙醇，会出现絮状沉淀，絮状沉淀，-20放置放置3
42、0min或或-80放置放置10min，12000rpm离心离心10-15min回收回收DNA沉淀。沉淀。6用用70%乙醇乙醇清洗沉淀两次，吹干后溶于适量的灭菌清洗沉淀两次，吹干后溶于适量的灭菌ddH2O中。中。70.8%琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测基因组基因组DNA的完整性。的完整性。本讲稿第五十一页，共九十七页核酸提取的注意事项核酸提取的注意事项本讲稿第五十二页，共九十七页注意事项注意事项最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融反复冻融提取血液基因组提取血液基因组DNADNA时，要选择有核细胞（白时，要选择有核细胞（白细胞）细胞）组培细
43、胞培养时间不能过长，否则会造成组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNADNA降解降解含病毒的液体材料含病毒的液体材料DNADNA含量较少，提取前先含量较少，提取前先富集富集本讲稿第五十三页，共九十七页注意事项（细胞破碎）注意事项（细胞破碎）材料应适量材料应适量，过多会影响裂解，导致，过多会影响裂解，导致DNADNA量量少，纯度低少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶组培细胞蛋白酶K K细菌溶菌酶破壁细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠高温温
44、浴时，定时轻柔振荡高温温浴时，定时轻柔振荡本讲稿第五十四页，共九十七页注意事项（分离与纯化）注意事项（分离与纯化）采用吸附材料吸附的方式分离采用吸附材料吸附的方式分离DNADNA时，应提时，应提供相应的缓冲体系供相应的缓冲体系采用有机（酚采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法去杂质的方法本讲稿第五十五页，共九十七页注意事项（沉淀、溶解）注意事项（沉淀、溶解）当沉淀时间有限时，用
45、当沉淀时间有限时，用预冷的预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分更充分沉淀时加入沉淀时加入1/10体积的体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充），有利于充分沉淀分沉淀沉淀后应用沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥），让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用若长期储存建议使用TE缓冲液溶解缓冲液溶解TE中的中的EDTA能螯和能螯和Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNasepH值为值为8.0，可防止，可防止DNA发生酸解发生酸解本讲稿第五十六页，共九十七页核酸提取的常见问题与对策核
46、酸提取的常见问题与对策本讲稿第五十七页，共九十七页常见问题与对策常见问题与对策1.1.DNADNA中含有蛋白、中含有蛋白、多糖、多酚类杂质多糖、多酚类杂质2.2.DNADNA在溶解前，有在溶解前，有酒精残留，酒精抑酒精残留，酒精抑制后续酶解反应制后续酶解反应3.3.DNADNA中残留有金属中残留有金属离子离子1.1.重新纯化重新纯化DNADNA，去除，去除蛋白、多糖、多酚等蛋白、多糖、多酚等杂质杂质2.2.重新沉淀重新沉淀DNADNA，让酒，让酒精充分挥发精充分挥发3.3.增加增加7070乙醇洗涤的乙醇洗涤的次数（次数（2-32-3次）次）问题一：问题一：DNADNA样品不纯，抑制后续酶解和样
47、品不纯，抑制后续酶解和PCRPCR反应。反应。原原因因对对策策本讲稿第五十八页，共九十七页问题与对策问题与对策1.1.材料不新鲜或反复冻材料不新鲜或反复冻融融2.2.未很好抑制内源核酸未很好抑制内源核酸酶的活性酶的活性3.3.提取过程操作过于剧提取过程操作过于剧烈，烈，DNADNA被机械打断被机械打断4.4.外源核酸酶污染外源核酸酶污染5.5.反复冻融反复冻融1.1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融免反复冻融2.2.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液前加入裂解缓冲液3.3.在提取内源核酸酶含量丰富的材料在提取内源核
48、酸酶含量丰富的材料的的DNADNA时，可增加裂解液中螯合剂时，可增加裂解液中螯合剂的含量的含量4.4.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔5.5.所有试剂用无菌水配制，耗材经高所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌温灭菌6.6.将将DNADNA分装保存于缓冲液中，避免分装保存于缓冲液中，避免反复冻融反复冻融问题二：问题二：DNADNA降解降解对对策策原因原因本讲稿第五十九页，共九十七页问题与对策问题与对策1.1.实验材料不佳或量少实验材料不佳或量少2.2.破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分3.3.沉淀不完全沉淀不完全4.4.洗涤时洗涤时DNADNA丢失丢失1.1.尽量选用新
49、鲜（幼嫩）的材尽量选用新鲜（幼嫩）的材料料2.2.动植物要匀浆研磨充分；动植物要匀浆研磨充分；G G菌、酵母裂解前先用生物酶菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁或机械方式破壁3.3.高温裂解时，时间适当延长高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增（对于动物细胞、细菌可增加加PKPK的用量）的用量）4.4.低温沉淀，延长沉淀时间低温沉淀，延长沉淀时间5.5.加辅助物，促进沉淀加辅助物，促进沉淀6.6.洗涤时，最好用枪头将洗涤洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒液吸出，勿倾倒问题三：问题三：DNADNA提取量少提取量少对对策策原因原因本讲稿第六十页，共九十七页核酸提取的相关说明核酸提取
50、的相关说明本讲稿第六十一页，共九十七页为什么用无水乙醇沉淀为什么用无水乙醇沉淀DNA?在用无水乙醇沉淀在用无水乙醇沉淀DNA时，为什么加时，为什么加NaAC或或NaCL?加核糖核酸酶降解核糖核酸后加核糖核酸酶降解核糖核酸后,为什么再用为什么再用SDS与与KAc来处理来处理?为什么在保存或抽提为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用过程中，一般采用TE缓冲液缓冲液？如何选择聚乙二醇如何选择聚乙二醇(6000)的浓度来沉淀的浓度来沉淀DNA?抽提抽提DNA去除蛋白质时去除蛋白质时,怎样使用酚与氯仿较好怎样使用酚与氯仿较好?为什么用酚与氯仿抽提为什么用酚与氯仿抽提DNA时时,还要加少量的异戌醇还要加