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1、 CRISPR/Cas9系统系统第三小组第三小组 找资料：李瑶找资料：李瑶 王辰尹王辰尹 郑小云郑小云 整理资料：王桂玉整理资料：王桂玉 段林菲段林菲 刘成凤刘成凤 PPT PPT制作：张龙制作：张龙 勉惠勉惠 龙欢龙欢 汇报：辛国琴汇报：辛国琴目录1简介简介 作用作用过程过程 应用应用与前景与前景32一、简介一、简介1、引入：、引入：基因定点修饰基因定点修饰是研究基因功能的重要手段之一也可被用于人类遗传性疾病的治疗，因此这类技术成为现代分子生物学的研究热点。早期仅基于同源重组的基因打靶技术效率极低效率极低，应用受到限制。直到人工核酸内切酶出现人工核酸内切酶出现，将这一现状彻底改变。一、简介一
2、、简介2、简介：、简介：人工核酸酶的原理是一样的，都是由DNA结合蛋白与核酸内切酶融合而成。2013年初，一种全新的人工核酸内切酶CRISPR/Cas9它主要是基于细菌的一种获得性免疫系统改造而成，其特点是制作简单、成本低、作用高效。一、简介一、简介CRISPR全名：全名：clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats即成簇的、规律间隔的短回文重复序列，是基因组中一个含有多个短重复序列的位点，这种位点在细菌和古细菌胞内起到了一种获得性免疫（acquiredimmunity）的作用。CRISPR系统主要依赖crRNA和tracrRNA来对
3、外源DNA进行序列特异性降解。目前已经发现了3种CRISPR/Cas系统，TypeI，TypeII，Type3，其中TypeII系统是目前改造最为成功的人工核酸酶，因为其只需一个Cas9蛋白就能够发挥CRISPR系统的免疫作用3、该、该系统系统的工作的工作原理原理：crRNA（CRISPR-derivedRNA）通过碱基配对与tracrRNA（trans-activatingRNA）结合形成tracrRNA/crRNA复合物此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。一、简介一、简介一、简介一、简介二、作用二、作用过程过程获得获得CRISPR的间隔区的间隔区CR
4、IPSR基因座的表达基因座的表达与与crRNA 的成熟的成熟CRISPR/Cas系统对系统对外源遗传物质的切割外源遗传物质的切割二、作用过程二、作用过程获得获得CRISPR的的间隔区间隔区细菌通过将入侵的噬菌体或质粒的一小段DNA序列整合到自身基因组的重复序列之间，即CRISPR5端的两个重复序列之间，从而获得高度可变的间隔区域因此，CRISPR基因座中的间隔序列从5到3的排列也记录了外源遗传物质入侵的时间顺序。噬菌体或是质粒上与间隔序列对应的序列被称为protospacer，通常protospacer的5或是3端延伸几个碱基序列很保守，被称为PAM，它的长度一般为25碱基，一般与protos
5、pacer相隔14碱基。二、作用过程二、作用过程CRIPSR基因座的表达与基因座的表达与crRNA 的成熟的成熟CRISPR基因座首先被转录成前体前体CRISPR RNA，然后在Cas9和核酸酶的作用下被剪切成成熟的成熟的crRNA基因座基因座结构结构 CRISPR/Cas的基因座结构相对的基因座结构相对简简单单以产脓链球菌的典型TypeIICRISPR/Cas为例5端tracrRNA基因中间一系列Cas蛋白编码基因3端CRISPR基因座二、作用过程二、作用过程CRISPR/Cas系统对外源遗传物质的切割系统对外源遗传物质的切割成熟的tracrRNA、crRNA和Cas9形成核糖核蛋白复合物，
6、crRNA识别外源匹配的DNA序列并与之结合，从而介导核糖核蛋白复合物对外源遗传物质的切割.三三、应用与前景、应用与前景虽然CRISPR/Cas的研究还处于初始阶段，但是其已经被应用在工业、学术和医疗领域。工业工业上：上：利用该系统构建出具有噬菌体抗性的菌株以提高奶制品发酵的产量。也能把它的这种特性用于菌株分类，以及防止某些特殊质粒的扩散，防止基因污染，以保存菌株。研究研究上：上：CRISPR/Cas系统不仅可以用来进行基因敲除，还可以敲入基因。可以在CRISPR/Cas系统切割目的基因的同时，通过同源重组修复断点的原理引入特定突变或者插入目的基因片段。该技术已经成功应用于细菌、斑马鱼、果蝇、
7、线虫、酵母、小鼠、人类细胞以及水稻等。医疗上：医疗上：还可以用在细胞水平建立疾病模型，治疗遗传疾病以及进行细胞替代治疗。HIV-1病毒有时能以休眠状态存在于人类宿主细胞中，如果将LTR-targetingCRISPR/Cas9复合物导入HIV病毒或者已经诱导的T细胞中，可以使HIV失去致病性。更重要的是，该复合物甚至能够剪切己经插入宿主染色体上的病毒基因。三三、应用、应用与前景与前景三三、应用、应用与前景与前景CRISPR/Cas9作为第三代人工核酸酶成为目前研究的热点，相对于ZFN和TALEN有其独特的优势：有其独特的优势：a构建简单方便快捷，适用于任何分子生物实验室；b用于基因组的点突变编辑优于ZFN或TALEN；cCRISPR/Cas9精确的切口酶活性用于基因治疗安全性高于ZFN或TZLEN。CRISPR/Cas系统作为一种新型的基因组定点修饰技术，它的出现大大推动了对基因功能的研究。但作为一种新兴的技术，它的基础理论研究还远远不够，很多分子机制尚不明确，技术也不够成熟。尽管现在还存在诸如如何将构建的系统成功导入人体内、脱靶现象以及切割特异性略低于TALEN等问题，但是相信在不久的将来一定可以找出解决的方案。总之，CRISPR-Cas系统研究时间虽短，但发展迅猛，以后一定会有更广泛的应用。三三、应用、应用与前景与前景谢谢谢谢