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1、有机物分离与纯化的方法柱层析的一些技巧第1页，共47页，编辑于2022年，星期六一、固体一、固体有机物分离提纯方法有机物分离提纯方法第2页，共47页，编辑于2022年，星期六第3页，共47页，编辑于2022年，星期六第4页，共47页，编辑于2022年，星期六二、液体有机物分离提纯方法二、液体有机物分离提纯方法v液体有机化合物液体有机化合物蒸馏法蒸馏法v蒸馏法原理蒸馏法原理：依液体混合物中各组分沸点不同而分离。v关键关键：控制温度缓慢上升，收集不同温度范的围馏份。v蒸馏方法分类：分类：常压蒸馏适用于b.p较低，在b.p时不分解的物质。减压蒸馏适用于b.p较高，或在b.p发生分解的物质。水蒸气蒸馏
2、适用于不与水反应，b.p较高的物质。第5页，共47页，编辑于2022年，星期六、常压蒸馏）装置不扭、歪、漏）温度计水银球位置）加沸石）容器中液体体积）热源选择）馏出速度v=2 D/S第6页，共47页，编辑于2022年，星期六）液体的干燥v液体含水：干燥剂脱水后蒸馏（干燥剂不可进入蒸馏体系）（容量与速度）v干燥剂种类及性能：vCaO 中、碱性化合物可用，脱水力强。vCaCl2 卤烃、烃、酯、醚可用（醇、酸不可用）脱水力强。vNa2 SO4多数溶剂可用，脱水能力不强。vK2 CO3碱性化合物、醇、酯脱水力较强。vP2 O5卤烃、烃（醇、酸不可用），脱水力强。vNaOH 饱和烃、肼、胺（酸性物质不可
3、用）v分子筛多数可用，脱水力强。第7页，共47页，编辑于2022年，星期六、减压蒸馏、减压蒸馏）减压蒸馏的原理液体的沸点随液面压强降低而降低。v对沸点和压强进行估算。过如下途径进行估算。v）查T-P关系图A线标减压沸点数据，B线正常压强沸点C线压强刻度（mmHg).A B C沸点低压强小压强大第8页，共47页，编辑于2022年，星期六）用近似公式估算v用近似公式 lgP=A+B/Tv P 蒸汽压;v T 绝对温度;v A、B为常数（可以通过化合物物理性质手册或者化工手册查阅）第9页，共47页，编辑于2022年，星期六）减压蒸馏装置v仪器装置v带橡皮套的毛细管、容积=1/2V、不用平底接受器v减
4、压泵v（水泵7-20mmHg）机械泵（油泵）0.1mmHg（要连接吸收装置）减压蒸馏装置图减压蒸馏装置图注意：负压与正压操作一样要带护目镜防爆！第10页，共47页，编辑于2022年，星期六）减压蒸馏操作步骤vA、查蒸馏系统可否达应有真空度 开始：开始：关安全瓶活塞，紧毛细管螺丝夹，开抽气泵，压力达要求。停止：停止：慢慢打开安全瓶活塞，压力与外界平衡，松毛细管螺丝夹，关抽气泵。vB、加液料、关活塞、开抽气、调毛细（气泡与线）、达到 压力后（平衡、稳定）再 加热。vC、热源温高于b.p20-30，压力不稳调热源。v 馏出速度0.51D/SvD、多组分蒸馏：馏出温度上升时转换接收器（使用多头接 受器
5、）。vE、蒸馏完后 先撤热源、再开活塞，压力平衡后关气泵与打开毛细管夹。可旋转多用接头第11页，共47页，编辑于2022年，星期六、旋转浓缩蒸馏法、旋转浓缩蒸馏法v一般用于提取液浓缩v）浓缩原理v使溶剂在瓶壁形成一层薄膜，扩大蒸馏面积，提高蒸馏速度。v）应用条件v压力400600mmHgv转速50160转/分。第12页，共47页，编辑于2022年，星期六、水蒸汽蒸馏v）主要用途v沸点比较高，容易热分解，或者糊状混合物中的成分。v）蒸馏原理v混合体系中总的蒸汽压等于各组分蒸汽分压之和。被蒸馏体系接近100时，水的蒸汽压接1atm，故被蒸馏的物质蒸汽可以和水蒸气合计等于1atm，从而在接近100从
6、混合物被蒸馏出来。v）必须满足的条件：v不与水反应v在100时不低与5mmHg的蒸汽压第13页，共47页，编辑于2022年，星期六）操作步骤：）操作步骤：va、装好仪器vb、调热浴温度高于b.p10以上vc、冷 却 水 接 蛇 形 冷 凝 管（低 于b.p20）vd、接真空泵（不低于300mmHg）ve、加热、开自动加液旋塞，vf、开动电机使旋转，收集馏出液。v g、关电机、除热源、关加液旋塞、压力平衡停抽气第14页，共47页，编辑于2022年，星期六）水蒸气蒸馏操作v水蒸气蒸馏操作与常压蒸馏操作类似，其装置比常压蒸馏装置多一个水蒸气发生器。水蒸气发生器T形管安全管第15页，共47页，编辑于2
7、022年，星期六三、柱层析分离（固液）有机物v1、柱层析技术用途v架设一个带活塞的玻璃柱，填入吸附剂，可以用于分离混合物是分离混合物的重要方法。v2、柱色谱的几种技术指标 直径与长度比：1：101：40 短而粗的柱子，分离快，分离效果差 长而细的柱子，分离慢，分离效果好色谱柱的分离效果还与吸附剂和洗脱剂的选择、柱子的装填质量有关。第16页，共47页，编辑于2022年，星期六3、柱层析原理与分类v）原理：混合物被束缚在色谱柱的固定相上，流动相自上而下流经固定相，带动被分离组分向下移动。与固定相作用力大的组分在流动过程中留在了后面，与固定相作用力小的组分在流动过程中跑在了前面（略），v）柱层析分类
8、：吸附、分配、凝胶vA、吸附色谱柱：吸附剂固体表面吸附各成分。vB、分配色谱柱：惰性载体表面涂高沸点液体，被分离物在淋洗剂与高沸点液体之间溶解分配。vC、凝胶色谱柱：多凝胶填粒、淋洗，凝胶网眼大小筛分不同尺寸的分子第17页，共47页，编辑于2022年，星期六4、吸附柱的装填要求v吸附剂要装填均实，淋洗剂等速水平下降，分离效果好。v）干装：先装洗脱剂于柱内，吸附剂通过漏斗直接装入盛有洗脱剂的色谱柱（边装边敲），最后应使吸附剂上有一薄层溶剂。v为保持柱上有平整表面，最上层可加石英砂。v）湿装：先装洗脱剂于柱内，用淋洗剂 调成糊状的吸附剂慢慢加入，慢慢沉降。最后应使吸附剂上有一薄层溶剂。亦应边加边敲
9、。第18页，共47页，编辑于2022年，星期六5、吸附剂的分类v吸附剂种类：氧化铝、硅胶、弗罗里硅土、纤维素、氧化镁、碳酸钙、活性碳等。v吸附剂的要求：对被吸附物有一定的作用，与被吸附物，淋洗剂无化学反应。v吸附能力：与颗粒粗细有关，粗则流速快，分离效果差；粗则流速慢，分离效果好。v氧化铝分类：酸性、中性、碱性三种v酸性：HCl浸泡，蒸馏水洗pH4.，用于分离酸性物质v中性：pH为.左右，用于分离中性物质v碱性：pH，用于分离碱性物质或烃类。第19页，共47页，编辑于2022年，星期六6、吸附剂的活性v含水量越低活性越高。v氧化铝依含水量分为五级，含水量分别为；v硅胶五级对应含水量为；v一般制
10、备方法：烘至无水（小时）加入相应水量得相应级别。v极性越强吸附力越大。第20页，共47页，编辑于2022年，星期六7、常见吸附剂的处理v中性氧化铝：活化h，使用前130活化 5h，可保一周，过期重新活化；时中性变碱性。吸附色素最佳。v硅胶：水玻璃加盐酸，沉淀脱水得无定形多孔物质。表面Si-OH称硅醇，与不饱和化合物或极性基形成氢键而吸附；Si-O-Si氧桥可水解，称溶解度，pH=以上显著，故不可用强碱性淋洗液；v硅胶层析性能与多孔骨架及坑穴体系密切相关，加热有变。活化温度不超过。130活化h备用。用于有机氯有机化合物分离。第21页，共47页，编辑于2022年，星期六8、混合吸附剂柱v用混合吸附
11、剂装柱柱可以用于纯化多种杂质的样品。不同的有机化合物样品的提纯用不同的混合柱。常见混合柱如下。v活性碳氧化镁，用于有机磷有机化合物分离。v活性碳纤维素，由于有机磷，有机氯有机化合物分离。v弗罗里硅土中性氧化铝酸性硅藻土，用于植物食品中有机氦有机化合物净化；v活性碳中性氧化铝，CHCl3淋洗由于提纯有机磷有机化合物。第22页，共47页，编辑于2022年，星期六9、淋洗剂选择v）极性递增顺序：vR-X C=C R-OCH3 R-CO2R R2C=O v R-CHO R-SHR-NH2 R-OHR-CO 2Hv）吸附力与淋洗剂性质有关。v选淋洗剂时应考虑被洗脱物质的极性与溶解度。v极性大的化合物用极
12、性大的淋洗剂洗脱；v极性小的化合物用小极性淋洗剂洗脱；v几种极性差别大的混合物用几种不同极性的淋洗剂分批洗脱。v亦可以用混合淋洗剂。第23页，共47页，编辑于2022年，星期六10、淋洗剂洗脱能力与洗脱要点v）常用淋洗剂洗脱能力：v正己烷CCl4C6H5-CH3C6H6CH2Cl2CHCl3Et 2OCH3CO2C2H5Me2COC3H7OHMeOHH2O v）淋洗要点：连续不断，不快不慢，吸附剂不露出液面。v）淋洗速度V=1滴/S为宜。v洗脱快则交换不平衡；v洗脱慢则具有大表面的吸附剂使某些成分破坏。第24页，共47页，编辑于2022年，星期六）淋洗曲线v分段收集标准品洗脱液进行含量分析，绘
13、成的淋洗剂体积样品含量曲线。v用途v使要收集的组分尽可能收集完全，无色化合物用标准品进行实验。分段收集洗脱液进行含量分析，绘成曲线。v确定淋洗过程应收集的 洗脱液体积。可以确定淋洗所需溶剂。含量淋洗剂体积第25页，共47页，编辑于2022年，星期六11、分配柱与凝胶渗透柱层析法v分配柱层析法：把有机氯有机化合物从极性小的有机化合物样品中分配到极性大的溶剂中去。主要分离含脂肪、蜡质试样的有机氯。v凝胶渗透柱层析法：用凝胶sephadex LH-20作有机磷有机化合物.分离净化。v被纯化物质的分子量范围：有机磷200-400；色素500-900。用118g葡聚糖LH-20装柱。乙醇或丙酮淋洗；淋洗
14、速度V=4.5ml/h。v多数有机磷（.水平0.050.005ppm）淋洗体积在305428ml；回收率可达66-98%。第26页，共47页，编辑于2022年，星期六六）薄层色谱分离提纯v比柱色谱更加应用广泛的分离分析手段。v用于分离提纯具有简单快速的特点。分离容量不及柱色谱大，效果也不及柱色谱好。v薄层分类：吸附与分配色谱，v分配色谱又分正相色谱与反相色谱。v正相：含水吸附剂（固定相），弱极性流动相，极性小的移动快。v反相：钝化吸附剂（固定相），强极性流动相，极性强的移动快。第27页，共47页，编辑于2022年，星期六薄层吸附色谱v1、固定相：硅胶、氧化铝活化。va加石膏为G型，不加为H型，
15、加荧光剂为GF或HFvb正相分配色谱：纤维素或用缓冲水溶液处理过的硅胶、或用极性有机溶剂处理过的硅胶。vC、反相分配色谱固定相：用硅酮、石蜡等非极性溶剂处理过的硅胶或纤维素。vD、薄层涂层：薄层自然晾干后进行活化。vE、活化温度与时间：v硅胶板105-120，1h；v氧化铝板：70，40min。第28页，共47页，编辑于2022年，星期六2、吸附剂选择吸附剂用途吸附剂用途硅胶吸附，分配氧化铝吸附，分配硅藻土 分配 纤维素 分配氢氧化钙 吸附聚酰胺吸附离子交换树脂离子交换氧化镁吸附，分配吸附剂粒度的要求：5-50m。粒度太大推进快，影响分离；粒度太小则展开慢，出现拖尾或横向扩散过度。第29页，共
16、47页，编辑于2022年，星期六3、展开剂选择v与淋洗剂标准一致。官能团极性如下：vRHRClCH=CH2ROCH3RNO2RNMe2RCOCH3RCO2RR2C=ORCHORSHRNH2RNHCORROHRCONH2RCO2Hv一般单一展开剂没有很适合的极性，多用相容的展开剂混合，以调节展开剂极性。第30页，共47页，编辑于2022年，星期六7、一般薄层色谱实验操作v点样展开显色计算Rf值v点样：在距薄板下沿1cm处的水平线上，毛细管口液滴与薄层表面相切，切忌玻璃管戳破薄层，可以重复点样。v展开：薄层板下沿水平插入层析缸，展开剂不能淹没样点，缸内充满展开剂蒸汽，要盖上盖子，展开剂水平线上升，
17、接近薄层上沿时为止。v显色：大多物质要进行物理或者化学方法显色。v薄层板从层析缸取出，在展开剂前沿作一记号，待展开剂挥发干后显色。v物理方法：紫外灯照射；碘蒸汽熏蒸等。v化学方法：可以产生有色物质的反应。第31页，共47页，编辑于2022年，星期六8、影响Rf的因素v薄层厚度薄层厚度v吸附剂种类、活度、展开剂极性、展层的饱和度v展开方法展开方法：一般不加黏合剂，薄板水平展开。v单向上行一次展开，倾角70-80vRf值接近的物质要多次单向展开。每次可用同一展开剂，也可不同的展开剂。v双向展开法：用正方形薄板，展开剂一次走到上沿后取出风干，旋转90后再展开v边缘效应边缘效应：溶剂前沿线一般朝下弯造
18、成Rf不准，且使色斑大小及形状不规则v显色是配合薄层进行鉴别。第32页，共47页，编辑于2022年，星期六四、化学提纯法v化学净化法是使杂质与某种试剂发生化学反应除掉或者消除干扰。v有机化合物提取液干扰分析成分很大程度是脂肪与色素。v最常用的化学净化法是用酸处理对酸稳定的有机化合物或用碱处理对碱稳定的有机化合物来除杂。v1、酸净化：用浓H2SO4或浓H2SO4与发烟硫酸（1：1）混合液在分液漏斗中处理萃取液，可以除脂肪、色素。v 第33页，共47页，编辑于2022年，星期六浓硫酸净化原理v不饱和脂肪，色素中含有C=C，可以和浓H2SO4加成生，成可溶于浓H2SO4的化合物而除去。第34页，共4
19、7页，编辑于2022年，星期六硫酸除杂注意事项v）对酸不稳定的有机化合物如有机磷、氨基甲酸酯不可用。v）酸体积与提取液体积之比为1：10；一般净化两次。v）提取液脱水不完全或潮天加发烟 H2SO4效果较好；v）防乳化：第一次净化轻摇，第二次净化猛摇，已乳化可以加水消乳第35页，共47页，编辑于2022年，星期六柱层析的几个技巧v1、硅胶的使用v2、洗脱剂的使用v3、装柱子的技巧v4、上样的技巧v5、过柱的技巧第36页，共47页，编辑于2022年，星期六1、硅胶的使用初做柱层析很容易把柱子装得长了或短了，有时还会有大量的硅胶剩余，浪费硅胶，这主要是对硅胶等固定相的使用的量没有掌握。柱层析用的硅胶
20、一般是100-200目，100毫升硅胶的质量在47克左右，如果装一个直径是2.8厘米的柱子，可以装18厘米高。为了避免浪费硅胶和溶剂，最初学习装柱时最好对实验室中各种不同规格的柱子摸摸底。方法很简单：用量筒量出100毫升干硅胶，直接倒入各种规格的柱子中，敲实，用刻度尺量出硅胶在柱子中的高度，这样就可以做到心中有数了。一般在装柱的时候可以根据实验所需柱子的高度来调整硅胶的使用量，这样就可以大大地节省硅胶的使用，避免造成没有必要的浪费。称量硅胶时一般称3070倍于上样量，如果极难分，也可以用100倍量以上的硅胶。第37页，共47页，编辑于2022年，星期六2、洗脱剂的使用v洗脱剂的极性可用薄层层析
21、来确定，一般以待分离样品Rf值为0.2-0.3为宜v选择的洗脱剂应该使两相邻物质Rf值之差最大化。不要认为在板上爬得高分离的效果就比较好，如果Rf在0.6，即使相差0.2也不容易在柱子上分开，因为柱子是一个多次爬板的过程，可以通过公式的比较：0.6/0.8一次的分离度，肯定不如（0.2/0.3）的三次方或四次方大。有时虽然在薄层板上看到分离的效果很好，但过柱层析时还是很难分开。这主要的原因就是薄层层析用硅胶比柱层析用硅胶要细得多，所以分离效果好。第38页，共47页，编辑于2022年，星期六v解决的办法就是降低洗脱剂的极性，一般柱层析用洗脱剂比薄层层析用的展开剂极性要再降低一倍可以达到比较好的分
22、离效果。当所分离物质极性跨度较大时，可用采梯度洗脱的方法，即逐渐增加溶剂的极性，使吸附在硅胶上的不同化合物逐个洗脱下来。v常用的展开剂极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统；极性较大的用甲醇：氯仿系统；极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸。v对于很难分离的化合物，一是增加柱子的长度和直径，二是减小洗脱剂的极性，这样可以很好地将混合物分开。v在同样能洗脱的情况下，尽量使用毒性小的洗脱剂。例如，乙酸乙酯：石油醚系统和二氯甲烷：石油醚系统，在同样都能洗脱的情况下，应该用毒性小的乙酸乙酯：石油醚系统。第39页，共47页，编辑于2022年，星期六v另外洗脱剂在过柱子后最好也回收使用
23、，一方面环保，另一方面也能节省部分经费，缺点是要消耗一定的人工。这里要注意的是，一般在过柱同时进行的是减压旋蒸，混合溶剂的比例由于挥发度的不同会导致极性的变化，一般会使得极性变大，在梯度淋洗时比较合适。还有一般回收的溶剂中会有少量水分，使用前先要用干燥剂干燥好才能使用。第40页，共47页，编辑于2022年，星期六3、装柱子的技巧v柱层析的装柱非常重要，装柱的效果会直接影响层析分离效果。有湿法装柱和干法装柱等两种方法。v湿法装柱很简单，使用也最普遍，就是先用比固定相多一倍的洗脱剂将固定相活成匀浆，柱子底部先用脱脂棉塞紧，然后倒入洗脱剂将脱脂棉中气泡赶出。用漏斗将活好的固定相倒入柱子中，打开底部活
24、塞，将柱子中高出固定相的溶剂放出。期间不断用橡皮棒敲打，将固定相敲实，做到密实均匀无气泡即可。很多时候用加压的方法可以很高效地装好柱子，而且在柱子中没有气泡产生。第41页，共47页，编辑于2022年，星期六v干法装柱与湿法装柱刚好相反的是，它是将干燥的吸附剂从柱子上端直接加入到一个空的柱子中，然后用油泵抽柱子底部，相当于减压过柱，直到柱子变得很结实，再用淋洗剂“走柱子”。v干法装柱的一个缺点就是在装入洗脱剂后，由于溶剂和固定相之间的吸附放热，所以柱子容易变花，影响分离效果。解决的方法是：（1）固定相一定要添加结实；（1）一定要用较多的溶剂“走柱子”，直到柱子的下端不再发烫，恢复到室温后再撤去压
25、力。无论使用哪种方法装柱，最后都要求所装的柱子结实、匀称、无气泡。第42页，共47页，编辑于2022年，星期六4、上样的技巧v上样也有湿法和干法之分：湿法一般用淋洗剂溶解样品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶剂越少越好。再用胶头滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁缓慢地均匀加入。在不用海沙的情况下，尽量不要破坏硅胶面。加样后，打开柱底活塞，让固定相充分地吸附所加样品。然后再加入一些洗脱剂，再充分地吸附后将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。然后就可以放心地加入大量洗脱剂，而不会冲坏硅胶表面。很多样品在上柱前是粘乎乎的，一般没关系。有的时候上样后在硅胶上又会析出，这一般都是比较大量的样品才会出现，是因为
26、硅胶对样品的吸附饱和，而样品本身又是比较好的固体才会析出，这就需要先重结晶样品，得到大部分的产品后剩余的产品再柱分。如果不能重结晶也没关系，直接过柱就行，样品会随着淋洗剂流动而慢慢溶解，最后随着洗脱剂流出。第43页，共47页，编辑于2022年，星期六v有些样品溶解性差，能溶解的溶剂又不能上柱（比如DMF，DMSO等，会随着溶剂一起走，显色是一个很长的脱尾），这时就必须用干法上柱了。干法过柱是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶，拌匀后再旋去溶剂。一般样品和硅胶按1：1的量混合，硅胶使用的量也可以少一些，但是要保证在旋干后，不能看到明显的固体颗粒，让样品都吸附在硅胶的表面上。然后小心地
27、加入到装好的柱子中，加入洗脱剂洗脱。第44页，共47页，编辑于2022年，星期六5、过柱的技巧v柱层析按过柱时的压力可以分为：加压，常压，减压。第45页，共47页，编辑于2022年，星期六v压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。v常压柱是效率最高的，但是时间也最长，例如一些天然化合物的分离，有时一个柱子过几个月也有可能。v减压柱能够减少硅胶的使用量，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发，有时会在柱子外面有水汽凝结，另外有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气，噪音大，时间长，所以减压过柱用得比较少。第46页，共47页，编辑于2022年，星期六v加压过柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，但用外加压力可以使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵。特别是在容易分解的样品的分离中很适用。一般压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。因为加压过柱效率高，分离效果较好，所以加压过柱在普通的有机化合物的分离中是非常适用的。一些低沸点溶剂装柱时往往会在柱子中产生气泡，使柱子变花，利用加压过柱法在装柱时就可以有效地解决这个问题，而且可以使柱子很快装实。第47页，共47页，编辑于2022年，星期六