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1、第七章 色谱分析法导论本讲稿第一页，共四十二页第一节第一节概论概论 一、色谱分析法应用一、色谱分析法应用二、色谱法与色谱分析方法二、色谱法与色谱分析方法三、色谱分析法的特点三、色谱分析法的特点本讲稿第二页，共四十二页一、色谱分析法应用一、色谱分析法应用 1.定量分析主要分析有机物有机物，也可分析部分无机物。GC：分析沸点500以下，热稳定性好，分子量400以下的物质，约占有机物总量的1520%。LC：分析沸点高，热稳定性差，大分子量的物质，约占有机物总量的7580%。GC与LC相结合，相互补充相互补充，可以分析绝大多数常见的有机化合物。检测限：ppmppb与所用检测器的种类和性能有关。本讲稿第
2、三页，共四十二页2.简单定性回答“是不是”本讲稿第四页，共四十二页二、色谱法与色谱分析方法二、色谱法与色谱分析方法1.色谱法色谱法是一种物理化学的分离分离方法创造人：俄国植物学家茨维特（M.Tswett）1905年，分离植物色素的试验。分离后，在玻璃管内呈现出不同颜色带，色谱一词由此得名。后来，也用来分离无色物质，习惯上仍称为色谱法。植物色素碳酸钙石油醚本讲稿第五页，共四十二页色谱发展史色谱发展史 最早创立色谱法的是俄国植物学家Tswett。他在研究植物叶子的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。
3、当时Tswett把这种色带叫做“色谱”（Chromatographie，Tswett于1906年发表在德国植物学杂志上用此名，英译名为Chromatogra-phy），在这一方法中把玻璃管叫作“色谱柱”，碳酸钙叫作“固定相”，纯净的石油醚叫作“流动相”。在在Tswett提出色谱概念后的提出色谱概念后的20多年里没有人关注这一伟大的发明。多年里没有人关注这一伟大的发明。直到1931年德国的Kuhn和Lederer才重复了Tswett的某些实验，用氧化铝和碳酸钙分离了-，-，和-胡萝卜素，此后用这种方法分离了60多种这类色素。本讲稿第六页，共四十二页Martin和Synge在 1940年提出液液分
4、配色谱法（LiquidLiquid Partition Chromatography），即固定相是吸附在硅胶上的水固定相是吸附在硅胶上的水，流动相是某种有机溶剂。1941年Martin和Syngee提出用气体代替液体作流动相的可能性，11年之后James和Martin发表了从理论到实践比较完整的气液色谱方法（GasLiquid Chromatography），因而获得了1952年的诺贝尔化学奖年的诺贝尔化学奖。在此基础上，1957年Golay开创了开管柱气相色谱法（OpenTubular Column Chromatography），习惯上称为毛细管柱气相色谱法（Capillary Colum
5、n Chromatography）。1956年Van Deemter等在前人研究的基础上发展了描述色谱过程的速率理论，1965年Giddings总结和扩展了前人的色谱理论，为色谱的发展奠定了理论基础。本讲稿第七页，共四十二页另一方面早在1944年Consden等就发展了纸色谱，1949年Macllean等在氧化铝中加入淀粉粘合剂制作薄层板使薄层色谱法（TLC）得以实际应用，而在1956年Stahl开发出薄层色谱板涂布器之后，才使TLC得到广泛地应用。在在60年代末把高压年代末把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱，出现了高效液相色谱泵和化学键合固定相用于液相色谱，出现了高效液相色谱（HPLC）。
6、）。80年代初毛细管超临界流体色谱（SFC）得到发展，但在90年代后未得到较广泛的应用。而在80年代初由Jorgenson等集前人经验而发展起来的毛细管电泳”（CZE），在90年代得到广泛的发展和应用。同时集HPLC和CZE优点的毛细管电泳色谱在90年代后期受到重视。到21世纪色谱科学将在生命科学等前沿科学领域发挥不可代替的重要作用。本讲稿第八页，共四十二页在色谱分离装置中，流动的那一相称为流流动动相相，固定不动的那一相称为固定相固定相。色谱法：是利用混合物各组分在固定相和流动相中具有不同分配系数（或吸附不同分配系数（或吸附系数、渗透能力等），系数、渗透能力等），当两相作相对运动时，这些物质在
7、两相中进行多次反复分配而实现分离。植物色素碳酸钙石油醚本讲稿第九页，共四十二页2.色谱法分类色谱法分类 有三种分类方法 按两相状态分类按两相状态分类流动相固定相液固色谱LSC液液色谱LLC气固色谱GSC气液色谱GLC液相色谱LC气相色谱GC（液体涂在担体表面）超临界色谱超临界色谱:以超临界状态超临界状态下的CO2作流动相。接近液体的溶解性和气体的流动性，兼有液相、气相色谱的优点。本讲稿第十页，共四十二页按固定相的固定方式分类按固定相的固定方式分类 柱色谱柱色谱：固定相装在色谱柱或涂布在柱壁上。“填充柱”“毛细管柱”纸色谱：以滤纸上的纤维及其结合水作固定相。薄层色谱：将吸附剂涂布在平板上作固定相
8、。平板色谱平板色谱本讲稿第十一页，共四十二页吸附色谱吸附色谱：利用固定相表面吸附力的差异分离混合物。：利用固定相表面吸附力的差异分离混合物。(物理吸附，可解吸附；硅胶、氧化铝物理吸附，可解吸附；硅胶、氧化铝、活性炭活性炭等等)分配色谱：分配色谱：利用不同组分在两相间分配系数的差异分离利用不同组分在两相间分配系数的差异分离混合物（两相对被分离组分溶解度的差异，将混合物（两相对被分离组分溶解度的差异，将水水吸附在吸附在固相硅胶上，以固相硅胶上，以氯仿氯仿冲洗，成功分离了氨基酸，这冲洗，成功分离了氨基酸，这就是现在常用的分配色谱）。就是现在常用的分配色谱）。排阻色谱：排阻色谱：利用多孔物质对不同大小
9、或形状的分子阻利用多孔物质对不同大小或形状的分子阻力上的差异分离混合物。（大孔吸附树脂为吸附性和力上的差异分离混合物。（大孔吸附树脂为吸附性和筛选性原理相结合的分离材料。）筛选性原理相结合的分离材料。）按分离机理分类按分离机理分类 本讲稿第十二页，共四十二页离子交换色谱：离子交换色谱：利用离子交换原理分离混合物。利用离子交换原理分离混合物。凡在溶液中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法凡在溶液中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法进行分离进行分离。离子交换色谱利用被分离组分与固定相之间发生。离子交换色谱利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱的固定相一般
10、离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱的固定相一般为为离子交换树脂离子交换树脂，树脂分子结构中存在许多可以电离的活，树脂分子结构中存在许多可以电离的活性中心，待分离组分中的离子会与这些活性中心发生离性中心，待分离组分中的离子会与这些活性中心发生离子交换，形成离子交换平衡，从而在流动相与固定相之子交换，形成离子交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配。间形成分配。本讲稿第十三页，共四十二页3、色谱分析法、色谱分析法 将色谱分分离离方法与适当的检检测测手段相相结结合合，用于化学物质分析的方法。是一种仪器分析方法。方法分类气相色谱法，液相色谱法（均属柱色谱）仪器分类气相色谱仪，液相色谱仪本讲稿
11、第十四页，共四十二页三、色谱分析法的特点：三、色谱分析法的特点：1.分离效能高分离效能高（最突出的优点最突出的优点）一般的分离手段（萃取、蒸馏等）与之无法相比。例例：GC可将石油中的二百多个组分一次全部分开，LC可将食品中的氨基酸（可多达20多种）一次分开。2.灵敏度高灵敏度高检测限可以达到ppmppb，与之配备高灵敏度的检测器有关。常见检测器有：热导池、氢焰检测器、电子捕获器等等。本讲稿第十五页，共四十二页3.所需样品量很小所需样品量很小（xxL）在疾病诊断、病人抽血、刑事侦察方面有较大意义。4.分析速度快分析速度快一次色谱分析一般只需要几分钟几十分钟，最快只需几秒钟，与高效率的分离和计算机
12、的应用有直接关系。5.应用范围广应用范围广 GC与LC相结合，几乎可以分析全部的常见有机物。本讲稿第十六页，共四十二页第二节第二节 色谱图及相关术语色谱图及相关术语一、色谱过程示意图一、色谱过程示意图A+B冲洗剂色谱柱检测器记录仪BABABA本讲稿第十七页，共四十二页A+BABABBAABBA检测器记录仪载气本讲稿第十八页，共四十二页流动相流出曲线组份的纵向扩散本讲稿第十九页，共四十二页二、色谱图二、色谱图 试样中各组分经色谱柱分离后依次进入检测器，由记录仪记录的电信号强度时间曲线，称为色谱图，也叫做流出曲线。下图是一个典型的气相色谱图。进样空气峰电信号t0tRtRwbw1/2h本讲稿第二十页
13、，共四十二页本讲稿第二十一页，共四十二页1.基线没有组分进入检测器时，系统噪声随时间变化的线称为基线。稳定的基线是一条直线。2.色谱峰组分的响应信号随时间变化而形成的峰形曲线。正常情况下，每一种组份对应一个峰，且色谱峰呈对称性。3.峰高（h）峰顶点到基线的距离。进样空气峰电信号t0tRtRwbw1/2h本讲稿第二十二页，共四十二页.峰底宽度（b）峰拐点切线与基线延长线相交的截距。.半峰宽（）峰高一半处的峰宽度。.峰面积（）峰与基线延长线所包围的面积。进样空气峰电信号t0tRtRwbw1/2h本讲稿第二十三页，共四十二页三、保留值三、保留值 保留值是表示样品中各组份在色谱柱中滞留时间的数值。在固
14、定的试验条件下，每一种组份都有固定的保留值。是色谱定性定性的依据。保留值包括以下几种：保留值包括以下几种：1.保留时间（保留时间（tR）从进样开始到色谱峰最大值出现所用的时间。（出现浓度最大值所用时间）。即某一组份通过色谱柱所需的时间。进样空气峰电信号t0tRtRwbw1/2h本讲稿第二十四页，共四十二页2.死时间（死时间（t。）。）不被固定相保留的组份（如GC中的空气）通过色谱柱所需的时间。实际上就是流动相流经色谱柱所需的时间。t。=L/（式中 L：柱长：流动相平均线速度)3.调整保留时间（调整保留时间（tR）某一组份在固定相中停留时间的总和。tR=tR t0（即：tR=t0+tR）进样空气
15、峰电信号t0tRtRwbw1/2h本讲稿第二十五页，共四十二页四、相对保留值与选择性四、相对保留值与选择性相对保留值：某组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比。评价两组分分离效果的指标评价两组分分离效果的指标进样空气峰电信号t0tRtRwbw1/2h本讲稿第二十六页，共四十二页 tR2：为后出峰组份的调整保留时间。总大于1。，说明两峰相距越远，即两组份的分离效果越好，即方法的选择性越好。是对分离方法的评价指标对分离方法的评价指标。选择性：两个相邻相邻组份（通常选择最难分离最难分离的物质对）的相对保留值。本讲稿第二十七页，共四十二页第三节第三节 定性和定量分析定性和定量分析 一、定性分析一、
16、定性分析 依据：在一定的条件下，每种物质都有自己固定的保留值。方法：1.与标准物质比较保留值2.在样品中加入适量的标准物质，峰高增加而半峰宽不变的色谱峰与标准物质为同一化合物。本讲稿第二十八页，共四十二页二、定量分析二、定量分析 依据：被测组份的重量（或浓度）与检测器的响应信号成正比。Wi：组分i的质量（或浓度）Ai：组分i的峰面积（即响应信号）fi ：组分i的校正因子本讲稿第二十九页，共四十二页峰面积的测量1.峰高乘半峰宽法（适用于对称峰，不适用于不对称峰或很窄的缝）。A=1.065hw2.峰高乘平均峰宽法（适用于不对称峰）A=h（w0.15+w0.85）3.用峰高表示峰面积（适用于痕量分析
17、中的对称峰）4.自动积分仪法（适用于任何峰）进样空气峰电信号t0tRtRwbw1/2h本讲稿第三十页，共四十二页校正因子 色谱定量分析中，被测物质的量与其峰面积成正比，并且有一个相互换算关系相互换算关系，这个换算关系就是校正因子校正因子。1.绝对校正因子绝对校正因子 fi与与操操作作条条件件有有关关，不不稳稳定定，在实际应用时，采用相对校正因子。本讲稿第三十一页，共四十二页2.相对校正因子相对校正因子 fi/s的测定方测定方法：准确称量一定量的被测物质和标准物质，混合后进样，分别测出它们的峰面积，按上式计算fi/s。fi/s与分析条件无关，仅仅与被测物质、标准物质以及检测器类型有关。所以，fi
18、/s是一个稳定的值。本讲稿第三十二页，共四十二页定量分析方法 1.归一化法原理：将样品中所有组分之和按100%计。本讲稿第三十三页，共四十二页优点：简便，不用称量；准确，操作条件对结果影响不大；当组份的fi/s相近时，可不必求fi/s而直接将面积归一化。缺点：所有组份都要有峰；只对个别组份定量时，比较繁琐。本讲稿第三十四页，共四十二页2.外标法（工作直线法）优点：不必求fi/s；处理批量样品时更快捷。缺点：对进样准确性要求高；整个过程中，操作条件要十分稳定（与不使用fi/s有关）。C浓度A（峰面积）A本讲稿第三十五页，共四十二页3.内标法 向待测样品中加入一内标物ws。本讲稿第三十六页，共四十
19、二页优点：因为Ws/W比值比较稳定，所以进样准确性要求不高；由于通过Ai/As比值来计算，操作条件稍有变化对测量结果没有影响。缺点：每次分析都需要准确称量试样和内标物；必须测定校正因子。本讲稿第三十七页，共四十二页对内标物的要求：应是样品中原来不存在的物质，性质与被测组份相似，能相溶但不发生化学反应；内标物色谱峰应位于被测物色谱峰附近，或位于几个被测物色谱峰中间，并与这些色谱峰完全分离；内标物的重量应与被测物质接近，能保持色谱峰的大小差不多。本讲稿第三十八页，共四十二页色谱分析参考书色谱分析参考书(1)近代色谱分析国防工业出版社近代色谱分析国防工业出版社，傅若农等著，傅若农等著(2)2)气相色
20、谱分析原理与技术，化学工业出版社，孙传经等气相色谱分析原理与技术，化学工业出版社，孙传经等(3)(3)高压液相色谱法，原子能出版社，金恒亮等高压液相色谱法，原子能出版社，金恒亮等(4)(4)毛细管色谱法，化学工业出版社，孙传经等毛细管色谱法，化学工业出版社，孙传经等本讲稿第三十九页，共四十二页色谱法分配色谱吸附色谱排阻色谱色谱图色谱峰基线保留时间死时间调整保留时间一、概念本讲稿第四十页，共四十二页色谱分析法主要分析哪些物质？气相色谱法和液相色谱法在分析对象上各有哪些特点？在应用上又有哪些关系？色谱法按分离机理分哪几类？并回答其分离机理。色谱法按照两相状态和固定相固定方式分别分为哪几类？什么是保留时间、死时间和调整保留时间？三者之间有什么关系？二、问答题本讲稿第四十一页，共四十二页试述色谱峰面积的测量方法（包括计算公式）及适用情况。什么是绝对校正因子和相对校正因子？两者在应用上有什么不同特点，为什么？试述归一化法的原理、计算公式，以及归一化法的优缺点。内标法和外标法相比，各有什么优缺点？试述内标法对内标物的要求。色谱在无机分析上的应用？（做PPT）本讲稿第四十二页，共四十二页