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1、第四章第四章微生物反应器操作微生物反应器操作主要内容主要内容 1 1、微生物反应器操作基础、微生物反应器操作基础 2 2、分批操作、分批操作 3 3、流加操作、流加操作 4 4、连续操作、连续操作4.1 4.1 微生物反应器操作基础微生物反应器操作基础n微生物培养过程根据是否要求供氧，分为微生物培养过程根据是否要求供氧，分为厌氧和好氧培养厌氧和好氧培养 。好氧培养可采用以下几种方法：好氧培养可采用以下几种方法：（1 1）液体表面培养（如使用浅盘）；）液体表面培养（如使用浅盘）；（2 2）通风固态发酵；）通风固态发酵；（3 3）通氧深层培养。）通氧深层培养。深层培养深层培养培养方式分类：培养方式
2、分类：n分批式操作分批式操作（batch operation）n反复分批式操作反复分批式操作（repeated batch operation）n流加式操作流加式操作（fed-batch operation）n反反 复复 流流 加加 式式 操操 作作（repeated fed-batch operation）n连续式操作连续式操作（continuous operation)4.2 4.2 各种反应器操作类型各种反应器操作类型 n是指基质一次性加入反应器内，在适宜是指基质一次性加入反应器内，在适宜条件下将微生物菌种接入，反应完成后条件下将微生物菌种接入，反应完成后将全部反应物料取出的操作方式。将
3、全部反应物料取出的操作方式。分批式操作分批式操作 反复分批式操作是指分批操作完成后，反复分批式操作是指分批操作完成后，不全部取出反应物料，剩余部分重新加入一不全部取出反应物料，剩余部分重新加入一定量的基质，再按照分批式操作方式，反复定量的基质，再按照分批式操作方式，反复进行。其培养过程中基质体积变化曲线如图进行。其培养过程中基质体积变化曲线如图4-1c4-1c所示所示 。反复分批式操作反复分批式操作n流加式操作流加式操作 是指先将一定量基质加入反应器内，是指先将一定量基质加入反应器内，在适宜条件下将微生物菌种接入反应器中，在适宜条件下将微生物菌种接入反应器中，反应开始，反应过程中将特定的限制性
4、基反应开始，反应过程中将特定的限制性基质按照一定要求加入到反应器内，以控制质按照一定要求加入到反应器内，以控制限制性基质保持一定，当反应终止时取出限制性基质保持一定，当反应终止时取出反应物料的操作方式反应物料的操作方式 。n酵酵母母、淀淀粉粉酶酶、某某些些氨氨基基酸酸和和抗抗生生素素等等采采用这种方式进行生产。用这种方式进行生产。反复流加式操作反复流加式操作n 反复流加式操作是指流加操作完成后，反复流加式操作是指流加操作完成后，不全部取出反应物料，剩余部分重新加不全部取出反应物料，剩余部分重新加入一定量的基质，再按照流加操作方式入一定量的基质，再按照流加操作方式进行，反复进行。其培养过程中基质
5、体进行，反复进行。其培养过程中基质体积变化曲线如图积变化曲线如图4-1d4-1d所示。所示。连连续续式式操操作作是是指指在在分分批批式式操操作作进进行行到到一一定定阶阶段段，一一方方面面将将基基质质连连续续不不断断地地加加入入反反应应器器内内，另另一一方方面面又又把把反反应应物物料料连连续续不不断断的的取取出出，使使反反应应条条件件（如如反反应应液液体体积积等等）不不随随时时间间变变化化的的操操作作方方式式。活活性性污污泥泥法法处处理理废废水水、固固定定化化微微生生物物反反应应等等多多采采用用连连续续式式操操作作。连连续续培培养养过过程程中中基基质体积变化曲线如图质体积变化曲线如图4-1e 4
6、-1e 所示。所示。连续式操作连续式操作培培养养过过程程中中基基质质体体积积变变化化优点不足应用的场合分批式操作设备制作费用低；同一设备可进行多种产品生产；高收率（若能对培养过程了解的深入）；发生杂菌污染或菌种变异的几率低。反应器的非生产周期较长；由于频繁杀菌，易使检测装置损伤；由于每次培养均要接种，增加了生产成本；需要非稳定过程控制费用；人员操作加大了污染的危险。进行少量产品生产；使用同一种反应器，进行多种产物生产；易发生杂菌污染或菌种变异从培养液中提取产物采取分批式操作。流加式操作高通融性；可任意控制反应器中的基质浓度；可确保微生物所需的环境；如果能够了解菌体在分批过程中的性质，可获得产物
7、高收率。有反应器的非生产周期；需要较高的劳动力（需要控制和高价的检测装置）；人员的操作加大了污染的危险；由于频繁杀菌，易使检测装置损伤。不能进行连续式操作；分批操作生产效率低；希望延长反应时间；出现基质抑制；使用营养要求变异株一定培养基成分的浓度是菌体收率或代谢产物生产速度的影响因素；需要高菌体浓度。连续式操作易机械化、自动化；节约劳动力；反应器体积小（由于无非生产准备时间）；可确保产品品质稳定；由于机械化操作，减少了操作人员的操作带来的污染；几乎没有因杀菌，使检测装置损伤的可能。通融性低（同一装置不能生产多种产品）；需要原料的品质均一；设备投资高（控制、自动化等操作具有一定难度）；长时间培养
8、，增加了杂菌污染或菌种变异的几率；反应器内保持醪液的恒定，有一定困难（由于产生气泡、丝状菌堵塞管路等）。需生产速率高的场合（对于同一品质，大量生产的产品）；基质是气体、液体和可溶性固体；不易发生杂菌污染或菌种变异。反反应应器器操操作作特特点点4.2.1 4.2.1 生长曲线生长曲线 分分批批培培养养中中微微生生物物的的生生长长曲曲线线如如图图4-24-2。随随培培养养的的进进行行，基基质质浓浓度度下下降降，菌菌体体量量增增加加，产产物物量量相相应应增增加加。分分批批式式培培养养过过程程中中，微微生生物物的的生长可分为：生长可分为：1 1、迟缓期、迟缓期（lag phase)；2 2、对数生长期
9、、对数生长期（lagarithmic growth phase）；）；3 3、减速期、减速期（fransient phase）；4 4、静止期、静止期（stationary phase）；5 5、衰退期、衰退期（decline phase）5 5个阶段。个阶段。分批式培养中微生物的生长曲线分批式培养中微生物的生长曲线4.2.2 4.2.2 状态方程式状态方程式 分分批批式式培培养养过过程程的的状状态态方方程程式式（环环境境过过程程的的状态方程式）可表示为：状态方程式）可表示为：基质：基质：dS/dt=-XdS/dt=-X菌体：菌体：dX/dt=dX/dt=X X产物：产物：dP/dt=XdP/
10、dt=X氧：氧：COCO2 2：当当t=0t=0时时上式中，上式中，F F为惰性气体流速，为惰性气体流速，V V为反应液总容积，为反应液总容积，PallPall为气体总压力，为气体总压力，(Po2)out(Po2)out为排气中氧的分压，为排气中氧的分压，(Po2)in(Po2)in为进气体中氧的分压，为进气体中氧的分压，(Pco2)in(Pco2)in为进气体中为进气体中C02C02的分压，的分压，(Pco2)out(Pco2)out为排气中为排气中CO2CO2的分压。的分压。一一般般微微生生物物的的最最适适温温度度、最最适适pHpH的的范范围围较较窄窄。例例 如如，CalamCalam等等
11、 人人 研研 究究 了了 温温 度度 对对 产产 黄黄 青青 霉霉（Penicillum Penicillum chrysogenumchrysogenum）生生长长速速率率和和青青霉霉素素生生成成速速率率的的影影响响，发发现现最最适适生生长长温温度度为为3030，进进行行呼呼吸吸的的最最适适温温度度为为21.721.728.628.6，产产物物青青霉霉素素的的最最适适生生成成温温度度为为24.724.7。生生产产中中一一般般采采用用定定值值控控制制。在在这这样样的的条条件件下下，可可以以认认为为分分批批培培养养过过程程中中的的动动态态特特性性取取决决于于基基质质与与微微生生物物浓浓度度（接接
12、种种量量）及及微微生生物物反反应应的的诸诸比比速速率率的的初初始始值值，因因此此，支支配配分分批批式式培培养养统统的的主主要要因因素素是是基基质质与与微微生生物物的的浓浓度度的初始值。的初始值。分批式微生物反应过程分析中，需观察分批式微生物反应过程分析中，需观察X X，S S和和P P等随时间的变化情况。由于不可能研究所有反应液等随时间的变化情况。由于不可能研究所有反应液成分随时间的变化，因此应选择与产物成分随时间的变化，因此应选择与产物P P关系最为密关系最为密切的底物切的底物S S作为观察的对象。必要时，可观察两种基作为观察的对象。必要时，可观察两种基质浓度的变化。好氧反应中，溶解氧浓度（
13、质浓度的变化。好氧反应中，溶解氧浓度（DODO）随）随时间的变化也是很重要的参数。时间的变化也是很重要的参数。分批培养时微生物细胞的生长与产物形成的动力学分批培养时微生物细胞的生长与产物形成的动力学培养基中的营养物质被微生物细胞所利用培养基中的营养物质被微生物细胞所利用生成细胞：细胞得率系数生成细胞：细胞得率系数生成代谢产物：产物得率系数生成代谢产物：产物得率系数消耗一克营养物质生成的细胞的克数或生成的产物的克数消耗一克营养物质生成的细胞的克数或生成的产物的克数工业上，一段时间的平均值，工业上，一段时间的平均值，获得为表观得率系数获得为表观得率系数4.2.3 4.2.3 反复分批操作反复分批操
14、作 反反复复分分批批操操作作系系统统（图图4-34-3）中中培培养养液液体体积积为为V V，培培养养液液取取出出率率为为，滤滤液液取取出出率率为为，由由于于V V一一定定，所所以以培培养养液液加加入入量量为为(+)V=F)。为为确确保保菌菌体体初初始始浓浓度度一一定定，有有必必要要将将流流出出液液中中部部分分含含菌菌体体的的培培养养液液取取出出，此时菌体量的衡算式为：此时菌体量的衡算式为：反复分批操作示意图反复分批操作示意图控制产物控制产物 浓度浓度控制菌体浓度控制菌体浓度 反复分批培养时的计算目标反复分批培养时的计算目标n一次分批结束后，进行下一批分批发酵，一次分批结束后，进行下一批分批发酵
15、，设定重新开始分批发酵时的初始菌体浓设定重新开始分批发酵时的初始菌体浓度为度为Xi，初始产物浓度为，初始产物浓度为Pi,，为此需计，为此需计算：算：要取出多少培养液？取出多少滤液？补要取出多少培养液？取出多少滤液？补充多少新鲜培养基？新鲜培养基的底物充多少新鲜培养基？新鲜培养基的底物浓度是多少浓度是多少(配制培养基的要求配制培养基的要求)？由上式可知由上式可知 产物浓度的衡算为产物浓度的衡算为由上式，滤液取出率为由上式，滤液取出率为产物的生产能力产物的生产能力 由由上上式式可可知知，为为提提高高产产物物生生产产能能力力，可可采采取取提提高或减少高或减少t tRBRB。RB:repeated b
16、atchP82 例题例题5-3n以葡萄糖为限制性基质，进行酿酒酵母的反复分批培养。培养以葡萄糖为限制性基质，进行酿酒酵母的反复分批培养。培养液液V=1000L，细胞初始浓度，细胞初始浓度Xi=3.0g/L，初始产物浓度，初始产物浓度Pi=1.3g/L,最终细胞浓度与产物浓度分别为最终细胞浓度与产物浓度分别为Xf=15g/L，Pi=26g/L。试计算初始基质浓度。试计算初始基质浓度Si;新鲜培养基供给量新鲜培养基供给量F及流及流加基质浓度加基质浓度S0；培养液与滤液分离取出率各为多少？已知；培养液与滤液分离取出率各为多少？已知Yp/s=0.35;Yx/s=0.1。n=1-Xi/Xf=1-3.0/
17、15=0.8n=（1-）-Pi/Pf=0.8-1.3/26=0.15n若培养终止时基质浓度若培养终止时基质浓度Sf=0,求初始基质浓度求初始基质浓度SinVSi=(Pf-Pi)V/YP/S+(Xf-Xi)V/YX/Sn即：基质需要量即：基质需要量=产物量生成所需基质消耗量产物量生成所需基质消耗量+细胞增细胞增加量所需基质消耗量加量所需基质消耗量n所以所以Si=(26-1.3)/0.35+(15-3)/0.1=191(g/L)n再次分批培养基开始，新培养基加入量为再次分批培养基开始，新培养基加入量为nF=（+）V=（0.8+0.15）1000=950（L）n基质流加浓度基质流加浓度S0为为nS0
18、=Si/(+)=191/(0.8+0.15)=201(g/L)4.3 4.3 流加操作流加操作 流加操作的优点是能够任意控制反应液中流加操作的优点是能够任意控制反应液中基质浓度基质浓度。流加操作的要点是控制基质浓度，因此，流加操作的要点是控制基质浓度，因此，其核心问题是其核心问题是流加什么流加什么和和怎么流加怎么流加。在工程上。在工程上特别要注意后者。特别要注意后者。从流加方式看，流加操作可分为无反馈控从流加方式看，流加操作可分为无反馈控制流加操作与反馈控制流加操作。前者包括定制流加操作与反馈控制流加操作。前者包括定流量流加、指数流加和反馈控制流加操作等。流量流加、指数流加和反馈控制流加操作等
19、。后者分间接控制、直接控制、定值控制和程序后者分间接控制、直接控制、定值控制和程序控制等流加操作。控制等流加操作。杯式补料系统杯式补料系统生产车间计算机生产车间计算机控制室控制室流加培养操作流加培养操作 应用举例应用举例消除快速利用碳源后，造成的阻遏效应，维持罐内良消除快速利用碳源后，造成的阻遏效应，维持罐内良好的需氧发酵条件。好的需氧发酵条件。避免培养基中某些成分的毒害作用。避免培养基中某些成分的毒害作用。生产酵母培养基中含有麦芽汁过多，开始导致细胞生产酵母培养基中含有麦芽汁过多，开始导致细胞的过速增长，同时细胞对氧气的需求大于设备提供的过速增长，同时细胞对氧气的需求大于设备提供的能力，是培
20、养系统成为厌氧条件，是酵母产生乙的能力，是培养系统成为厌氧条件，是酵母产生乙醇，导致抑制细胞的生长，成为阻遏效应。醇，导致抑制细胞的生长，成为阻遏效应。同理，面包酵母如果添加葡萄糖超过某一值时，也同理，面包酵母如果添加葡萄糖超过某一值时，也会产生此效应。会产生此效应。青霉菌发酵生产青霉素，要求精确的控制葡萄糖的补入青霉菌发酵生产青霉素，要求精确的控制葡萄糖的补入速率。生长期是葡萄糖的含量适宜。而在生产期控制补速率。生长期是葡萄糖的含量适宜。而在生产期控制补料速率，使青霉素的合成速率达到高值。料速率，使青霉素的合成速率达到高值。另一方面，产物前提物的添加，有利于产量的提高，担另一方面，产物前提物
21、的添加，有利于产量的提高，担当此物质对细胞的生长有毒害作用使，应采用缓慢的加当此物质对细胞的生长有毒害作用使，应采用缓慢的加料方式，如苯乙酸钠。料方式，如苯乙酸钠。补料分批发酵的特点有：补料分批发酵的特点有：1）可以减弱底物和代谢产物的抑制。）可以减弱底物和代谢产物的抑制。微生物的生长会受到微生物的生长会受到高浓度底物和逐步过量产生的代谢产物的抑制，若将初始底高浓度底物和逐步过量产生的代谢产物的抑制，若将初始底物浓度降低，就会限制菌体密度和产物浓度的提高。但采用物浓度降低，就会限制菌体密度和产物浓度的提高。但采用间歇补料通过不断的流加限制性底物就可克服该缺点。可间歇补料通过不断的流加限制性底物
22、就可克服该缺点。可以以避免葡萄糖效应避免葡萄糖效应对微生物生长和产物积累的影响。流加补对微生物生长和产物积累的影响。流加补料还可料还可稀释降低代谢产物的浓度稀释降低代谢产物的浓度，减轻其抑制生长作用。，减轻其抑制生长作用。2）增加次级代谢产物的产量。）增加次级代谢产物的产量。次级代谢产物的合成常常在次级代谢产物的合成常常在生长平衡期才开始合成，与生长平衡期才开始合成，与稳定期的细胞密度稳定期的细胞密度和和延续时间延续时间密密切相关。但间歇发酵的平衡期比较短，因营养物质已大量消切相关。但间歇发酵的平衡期比较短，因营养物质已大量消耗可同化量很少很快就进入衰亡期。通过补料可延长平耗可同化量很少很快就
23、进入衰亡期。通过补料可延长平衡期增加次级代谢产物的产量。衡期增加次级代谢产物的产量。3）可以提高发酵的细胞密度。可以提高发酵的细胞密度。补料发酵时不补料发酵时不断地向发酵罐补偿限制性底物，微生物始终能断地向发酵罐补偿限制性底物，微生物始终能获得充分的营养，菌体密度就可以增加，合理获得充分的营养，菌体密度就可以增加，合理改进发酵工艺细胞密度可以达到改进发酵工艺细胞密度可以达到10以上干以上干细胞，大大提高产率。细胞，大大提高产率。4）可以恒定培养条件。）可以恒定培养条件。发酵过程中的培养环发酵过程中的培养环境会随着代谢作用的进行而变化，如培养基的境会随着代谢作用的进行而变化，如培养基的pH值，这
24、时可流加氨水或通氨来恒定值，这时可流加氨水或通氨来恒定pH值值还补充氮源。还补充氮源。流流加加操操作作时时，特特定定基基质质加加入入到到反反应应器器后后，反反应应液液体体积积就就会会发发生生变变化化，这这时时、和和的的可可定义如下：定义如下：式式中中，V V为为反反应应液液体体积积，F F是是体体积积流流量量，S Sinin是是流流加液中的基质浓度，加液中的基质浓度，FSFSinin为基质的质量流量。为基质的质量流量。4.3.1 4.3.1 无反馈控制的流加操作无反馈控制的流加操作 采采用用这这种种操操作作方方式式时时，基基质质的的流流加加按按预预先先设设置置好好的的条条件件进进行行。因因此此
25、，表表达达系系统统的的数数学学模模型型是是否否正正确确成成为为反反应应成成败败的的关关键键。最最简简单单的的微微生生物物的的生长速率为生长速率为作为流加基质的平衡式，有作为流加基质的平衡式，有反应液体积变化的方程式为反应液体积变化的方程式为 式式中中，K Kvapvap为为单单位位时时间间里里由由于于通通气气，随随排排出出气气体体而而失失去去的的水水分分。如如果果流流加加的的基基质质能能够够迅迅速速并并完完全全为为菌菌体体所所消消耗耗，并并且且维维持持代代谢谢为为零零时时，可可得得到到最最大大的的菌菌体体浓浓度度X Xmaxmax。由由于于基基质质流流加加量量与与基基质质消消耗耗量相等，可认为
26、，这样由流加基质的平衡式有量相等，可认为，这样由流加基质的平衡式有 对于所供给基质的浓度，菌体浓度近似一定，即对于所供给基质的浓度，菌体浓度近似一定，即dX/dt=0dX/dt=0时。由上式，可认为（时。由上式，可认为（D D稀释率）。稀释率）。一、一、定流量流加操作定流量流加操作 定定流流量量流流加加操操作作是是指指基基质质的的流流加加速速度度保保持持一一定定的的流流加加操操作作。此此时时dV/dt=FdV/dt=F为为定定值值。由由菌菌体体的的恒恒算算式式可知，时间可知，时间t t时的菌体浓度为时的菌体浓度为 这这种种流流加加方方式式的的最最大大特特点点是是微微生生物物进进行行线线型型生生
27、长长（linear growthlinear growth），即），即 式中式中K KL L是线性生长速率常数。一般，在线性生长阶是线性生长速率常数。一般，在线性生长阶段，基质浓度相当低。段，基质浓度相当低。二、指数流加操作二、指数流加操作 通通过过采采用用随随时时间间呈呈指指数数性性变变化化的的方方式式流流加加基基质质，维维持持微微生生物物菌菌体体的的对对数数生生长长的的操操作作方方法法称称为为指指数数流流加加操操作作。此此时时，以以满满足足等等于于定定值值为为基基础础，流流加加基基质质，由由MonodMonod方方程程可可获获得得S=S=常常数数。此此时时，由由于于dX/dt=0dX/dt
28、=0，结结合合前前述述的的拟拟稳稳定定状状态态条条件件，有有如如下下方方程程式式基于上式，菌体量为基于上式，菌体量为流量为流量为 从以上结果可知，采用这种方式操作，不仅能从以上结果可知，采用这种方式操作，不仅能保证微生物呈指数生长，而且能保持基质浓度一定。保证微生物呈指数生长，而且能保持基质浓度一定。流加基质浓度流加基质浓度S Sinin与反应器内反应液最终体积、最终与反应器内反应液最终体积、最终菌体量菌体量X Xf f和菌体收率和菌体收率Y YX/SX/S有如下关系：有如下关系：拟拟稳稳定定状状态态下下初初始始流流加加速速度度F F0 0可可由由（4-244-24）给出。给出。微生物每次培养
29、都可能有微妙的变化，因微生物每次培养都可能有微妙的变化，因此，无反馈控制的流加操作适用范围很窄。此，无反馈控制的流加操作适用范围很窄。例题5-4n流加基质为葡萄糖，培养大肠杆菌。流加培养流加基质为葡萄糖，培养大肠杆菌。流加培养开始时的开始时的V0=1.0L，Sin=80g/L，F=0.2L/h，反应方程式可以用反应方程式可以用Monod方程来表示，其中方程来表示，其中n=0.2 h-1，Ks=1.0g/L,Yx/s=0.6g/g(以细胞以细胞/葡萄糖葡萄糖计计)。流加培养。流加培养2h后，求：后，求：n(1)此时的培养液体积此时的培养液体积V;n(2)拟稳定状态下反应器中的葡萄糖浓度；拟稳定状
30、态下反应器中的葡萄糖浓度；n(3)培养完成时反应器中的细胞浓度。培养完成时反应器中的细胞浓度。例题5-5n青霉菌流加培养中，为确保比生长速率青霉菌流加培养中，为确保比生长速率=0.2h-1,按照指数方式流加葡萄糖。按照指数方式流加葡萄糖。Sin=0.3kg/m3。细胞的生长可以用细胞的生长可以用Monod方程表达，方程表达，=0.30h-1，Ks=0.1kg/m3。流加开始时培养液体。流加开始时培养液体积积V0=0.005m3,细胞浓度为细胞浓度为X0=0.1kg/m3，细胞，细胞得率得率Yx/s=0.3kg/kg(以细胞以细胞/葡萄糖计葡萄糖计)。求流加。求流加培养至培养至20h时反应器内的
31、基质浓度和培养液体时反应器内的基质浓度和培养液体积，流加开始与积，流加开始与20h时的流加速度。时的流加速度。4.3.2 4.3.2 有反馈控制的流加操作有反馈控制的流加操作阴沟肠杆菌定流量流加培养阴沟肠杆菌定流量流加培养 甘油为基质进行阴沟肠杆菌甘油为基质进行阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacaeEnterobacter cloacae）定流量流加培养）定流量流加培养的实验结果与计算机模拟结果如前图。图中的实验结果与计算机模拟结果如前图。图中（a a）是甘油水溶液为流加基质的结果，如图）是甘油水溶液为流加基质的结果，如图4-44-4所示的那样，菌体浓度一定（所示的那样，菌体浓度
32、一定（XVXV以直线方以直线方式增加）。图中（式增加）。图中（b b）甘油直接为流加基质，）甘油直接为流加基质，与甘油水溶液的不同，流加的基质全部被消与甘油水溶液的不同，流加的基质全部被消耗，反应液的体积耗，反应液的体积V V一定，菌体浓度一定，菌体浓度X X按照直按照直线方式增加。此时，确保了高浓度培养的成线方式增加。此时，确保了高浓度培养的成功。功。4.44.4连续式操作连续式操作 连续操作有两大类型，即CSTR（continuous stirred tank reactor）型和CPFR(continuous plug flow tulular reactor）型。根据达成稳定状态的方法
33、不同，CSTR型连续操作，大致可分为三种。一是恒化器法（chemostat），二是恒浊器法（turbidstat），第三是营养物恒定法（nutristat）。恒化器法是指在连续培养过程中，基质流加速恒化器法是指在连续培养过程中，基质流加速度恒定，以调节微生物细胞的生长速率与恒定流量度恒定，以调节微生物细胞的生长速率与恒定流量相适应的方法。相适应的方法。恒浊器法是指预先规定细胞浓度，通过基质流恒浊器法是指预先规定细胞浓度，通过基质流量控制，以适应细胞的既定浓度的方法。营养物恒量控制，以适应细胞的既定浓度的方法。营养物恒定法是指通过流加一定成分，使培养基中的营养成定法是指通过流加一定成分，使培养基
34、中的营养成分恒定的方法。实际应用中多采用恒化器法分恒定的方法。实际应用中多采用恒化器法 。单级单级CSTRCSTR培养系统培养系统 4.4.1 4.4.1 恒化器法连续操作恒化器法连续操作连续发酵的优点：连续发酵的优点：1、高效、高效2、产品质量较稳定、产品质量较稳定3、节约了大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、节约了大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、气、电的负荷均衡合理。气、电的负荷均衡合理。缺点：缺点：1、菌种易退化、菌种易退化2、易污染杂菌、易污染杂菌3、营养物的利用率一般低于单批增大。、营养物的利用率一般低于单批增大。1 1、单级连续培养操作、单级连续培养操作 上上图图所所示示的的单单级
35、级CSTRCSTR培培养养系系统统中中，流流入入液液中中仅仅一一种种成成分分为为微微生生物物生生长长的的限限制制性性因因子子，其其他他成成分分在在不不发发生生抑抑制制的的条条件件下下充充分分存存在在。反反应应过过程程中中，菌体、限制性基质及产物的物料衡算式为菌体、限制性基质及产物的物料衡算式为 变化量变化量=流入量流入量+生成量生成量-流出量流出量 由由于于流流入入液液中中菌菌体体与与产产物物的的浓浓度度为为零零，因因此此，上述衡算式写成数学表达式为上述衡算式写成数学表达式为式中，式中，F F为反应液流入与流出速度为反应液流入与流出速度L/hL/h，V V为反应器内反应液的体积为反应器内反应液
36、的体积L L，SinSin为流入液中限制性底物的浓度为流入液中限制性底物的浓度mol/Lmol/L，S S为反应器内和流出液中限制性底物浓度为反应器内和流出液中限制性底物浓度mol/Lmol/L，其余符号同前。其余符号同前。以上式子两边同除以以上式子两边同除以V V，则，则 式中，式中，D D称为稀释率称为稀释率(dilution rate）根据菌体得率和的定义式，以及根据菌体得率和的定义式，以及MonodMonod方程，方程，可改写成可改写成 稳稳定定状状态态下下，dX/dt=dS/dt=dP/dt=0dX/dt=dS/dt=dP/dt=0，此此时时的的菌菌体浓度、基质浓度和代谢产物浓度可分
37、别表示为体浓度、基质浓度和代谢产物浓度可分别表示为事实上事实上D D是有一定限制的，就是要保证，即是有一定限制的，就是要保证，即微微生生物物反反应应一一般般是是在在 条条件件下下进进行行的的，所所以以由由上式，可以认为上式，可以认为 当当D D值值接接近近 时时，实实际际上上X X为为零零，此此时时 转转变变为为 此此时时称称为为冲冲出出（wash wash outout）点点，称称为为冲冲出出基基质质浓浓度度。也也就就是是微微生生物物的的生生长长速速度度低低于于反反应应液液流流加加速速度度时时，反反应应液液中中微微生生物物将将全全部部被被排排出出。当当然然，这这已已无无连连续续操操作作的的意
38、意义义，但但这这一一过过程程可可用用来来确确定定此此条条件件时时微生物的微生物的 。另另外外，给给出出稳稳定定状状态态下下菌菌体体生生长长速速率率和和产产物物生生成成速率，即速率，即所以获得最高产物产率时的稀释率为所以获得最高产物产率时的稀释率为此时，最高代谢产物浓度为此时，最高代谢产物浓度为从上述推导中，连续培养的稳定条件为从上述推导中，连续培养的稳定条件为假设细胞生长符合monod方程，于是：所以，连续培养只要控制所以，连续培养只要控制D，即改变培养基的供给量，即改变培养基的供给量F，就可，就可以控制以控制在任意可调水平，而在任意可调水平，而是微生物的特性参数，在分批是微生物的特性参数，在
39、分批培养过程中，是一个无法控制的参数，而在连续培养过程中，培养过程中，是一个无法控制的参数，而在连续培养过程中，通过控制操作状态参数通过控制操作状态参数D来调控来调控，因而称此类反应器为外控，因而称此类反应器为外控式的微生物反应器式的微生物反应器最高产率时的菌体浓度为最高产率时的菌体浓度为 面包酵母的连续培养中，最大产率的面包酵母的连续培养中，最大产率的 确定确定是一个优化问题。事实上，最大生产能力是一个优化问题。事实上，最大生产能力是在接近最大稀释率时达到的，其可能与基质的利用是在接近最大稀释率时达到的，其可能与基质的利用率存在矛盾。经验表明，率存在矛盾。经验表明，时，基质利用率仍可能大于时
40、，基质利用率仍可能大于95%95%。连连续续培培养养为为目目的的微微生生物物选选择择了了有有利利的的生生长长环环境境，提提高高了了竞竞争争的的优优势势，有有利利于于减减少少杂杂菌菌污污染染的的机机会会。另另外外，连连续续培培养养过过程程中中的的菌菌种种变变异异问问题题也也是是不不可可轻轻视视的的。DNADNA的的复复制制是是一一种种复复杂杂而而精精确确的的过过程程，虽虽然然出出现现差差错错的的概概率率仅仅1/101/106 6，但但因因每每mlml反反应应液液中中往往往往有有10109 9个个细细胞胞，所所以以变变异异问问题题显显得得很很重重要要。当当然然，在在这这一一数数量量中中，多多数数突
41、突变变是是不不重重要要的的。有有人人研研究究了了工工程程菌菌株株连连续续培培养养的的理理论论问问题题，多多数数情情况况下下，只只要要保保持持一定的选择压力，工程菌株一样可以稳定。一定的选择压力，工程菌株一样可以稳定。n3 3、多级连续培养、多级连续培养n多级连续培养系统是一具有多级连续培养系统是一具有n n个串联反应个串联反应器的连续反应系统。底物流经这一系统器的连续反应系统。底物流经这一系统的流量为的流量为F F，由物料衡算可得出菌体，由物料衡算可得出菌体X X、产物产物P P及限制性基质及限制性基质S S的衡算式。这些方的衡算式。这些方程式成立的基本条件是，限制性基质由程式成立的基本条件是
42、，限制性基质由n-1n-1号反应器流入号反应器流入n n号反应器中立即与号反应器中立即与n n号号反应器内的反应物料充分混合均匀。其反应器内的反应物料充分混合均匀。其有关衡算式为有关衡算式为n稳定状态下，以上三式左边为零。因此，有稳定状态下，以上三式左边为零。因此，有从以上式子可以分析得出，从第二级开始，菌体从以上式子可以分析得出，从第二级开始，菌体的比生长速率不再与稀释率相等。另外，有关具的比生长速率不再与稀释率相等。另外，有关具有反馈的多级连续培养操作方程可采用前面所述有反馈的多级连续培养操作方程可采用前面所述方法推导出来。方法推导出来。2 2、具有反馈的单级连续培养、具有反馈的单级连续培
43、养 有有时时为为了了增增加加反反应应器器内内的的菌菌体体浓浓度度，或或者者在在某某种种条条件件下下提提高高发发酵酵产产物物的的产产率率，对对于于单单级级连连续续培培养养可可以以采采取取将将反反应应器器排排出出液液中中的的部部分分微微生生物物重重新新返返回回反反应应器器中中。图图4-94-9表表示示具具有有反反馈馈的的单单级级连连续续培培养养系系统统，图图中中g g为为微微生生物物的的浓浓缩缩系系数数（11），r r为为再再循循反反应应液液的的比比例例（返返回回的的反反应应液液与与供供给给的的新新鲜鲜反反应应液液的的体体积积比比）。稳稳定定状状态态时时，菌菌体体的的物物料料衡衡算式为算式为整理得
44、整理得由此求得稀释率为由此求得稀释率为 在这种情况下，在这种情况下，D D为为“外部外部”稀释率，对于反稀释率，对于反应器本身，还要用一个应器本身，还要用一个“内部内部”稀释率稀释率D D的概念，的概念，它等于它等于D D加上加上rDrD，反馈过程中，必须满足反馈过程中，必须满足g1,r0g1,r0这样这样 因此函数值因此函数值大于，即 由由于于的的绝绝对对值值必必须须小小于于1 1，因因此此，r r和和g g在在一一定定范围内是互相依存的，不能任意选定。范围内是互相依存的，不能任意选定。具具有有反反馈馈的的单单级级或或多多级级连连续续培培养养中中，稳稳态态下下的的稀稀释释率率都都高高于于比比
45、生生长长速速率率。这这与与常常规规单单级级连连续续培培养养（保保持持）不不同同。前前者者流流入入反反应应器器的的培培养养液液体体积积要要相相对对多多一一些些。这这一一方方法法在在生生物物法法废废水水处处理理过过程程之之一一的的活活性性污污泥泥法法中中普普遍遍采采用用，因因为为其其有有利利于于提提高除污能力。高除污能力。n理论上，反馈操作使菌体产率增大，但实际运用理论上，反馈操作使菌体产率增大，但实际运用并不尽然。反应液中菌体的浓度取决于收率和底并不尽然。反应液中菌体的浓度取决于收率和底物消耗的数量，即物消耗的数量，即 n因此，无其它限制因子时，微生物菌体浓度在一因此，无其它限制因子时，微生物菌
46、体浓度在一定范围内受底物浓度的制约。如果采用控制底物定范围内受底物浓度的制约。如果采用控制底物浓度的方法来控制菌体浓度，可使无反馈反应系浓度的方法来控制菌体浓度，可使无反馈反应系统中的菌体浓度达到反馈条件时的菌体浓度的同统中的菌体浓度达到反馈条件时的菌体浓度的同样数值，此时，反馈对于提高菌体产率并不显示样数值，此时，反馈对于提高菌体产率并不显示优越性。相反，由于分离后反应液中菌体浓度降优越性。相反，由于分离后反应液中菌体浓度降低，对菌体生产（如面包酵母生产）反而不利。低，对菌体生产（如面包酵母生产）反而不利。对于具有反馈的单级系统来讲，还要考虑排出反应对于具有反馈的单级系统来讲，还要考虑排出反
47、应液中菌体的浓度。菌体分离装置处的菌体恒算式为液中菌体的浓度。菌体分离装置处的菌体恒算式为所以，所以，即菌体产率等于比生长速率与的乘积。即菌体产率等于比生长速率与的乘积。由于具有反馈时的大于无反馈时的，因此，反馈使由于具有反馈时的大于无反馈时的，因此，反馈使反应器的产率增加了倍。反应器的产率增加了倍。所以，从菌体分离装置处流出的菌体浓度为所以，从菌体分离装置处流出的菌体浓度为n固定化细胞连续培养n细胞固定化就是通过包埋法、微胶囊化、吸细胞固定化就是通过包埋法、微胶囊化、吸附法等手段，将微生物细胞限制在载体的内附法等手段，将微生物细胞限制在载体的内部或表面。部或表面。n固定化细胞培养与游离细胞培
48、养相比，有以固定化细胞培养与游离细胞培养相比，有以下一些优势：下一些优势：固定化可提供较高的细胞密固定化可提供较高的细胞密度；度；固定化减少了细胞的流失，使细胞可固定化减少了细胞的流失，使细胞可以反复利用；以反复利用；固定化可以提供对细胞有利固定化可以提供对细胞有利的微环境；的微环境；可以保护某些细胞免受剪切损可以保护某些细胞免受剪切损伤；伤；简化了下游的细胞分离步骤。简化了下游的细胞分离步骤。固定化载体常常易碎，且固定的细胞容易脱落等原因的存在，固定化细胞培养器中的剪切力也不宜过高，一般采用填充柱、流动床或气升式反应器。机械搅拌式反应器只适用于载体牢固、不易脱落的固定化细胞。通常是将固定化细
49、胞装在反应器内，一端流入培养基，另一端放出发酵液，而固定化微生物细胞始终停留在反应器内。其他培养方法其他培养方法1、双菌或者多菌培养、双菌或者多菌培养 现代发酵工业以纯种发酵为主，而传统的固现代发酵工业以纯种发酵为主，而传统的固态白酒和酱油的发酵都是多菌培养发酵的结果。态白酒和酱油的发酵都是多菌培养发酵的结果。在自然界微生物之间的共生与互生关系也是双在自然界微生物之间的共生与互生关系也是双菌与多菌共同生存的常例，这种关系反映了微菌与多菌共同生存的常例，这种关系反映了微生物存在着代谢生物存在着代谢”接力棒接力棒”的依赖状态，能相的依赖状态，能相互改善生存条件。互改善生存条件。双菌发酵：双菌发酵：
50、维生素维生素C的二步法的二步法采用采用欧文氏菌欧文氏菌和和棒状杆菌棒状杆菌进行串联发酵，先将厂葡进行串联发酵，先将厂葡萄糖转化成萄糖转化成2，5-二酮基葡萄糖酸再进一步转化产牛二酮基葡萄糖酸再进一步转化产牛2-酮某古龙酸。酮某古龙酸。以山梨醇作为发酵的主要原料，利用以山梨醇作为发酵的主要原料，利用生黑葡萄糖酸生黑葡萄糖酸杆菌杆菌或或弱氧醋酸杆菌弱氧醋酸杆菌先进行第先进行第 一步发酵，所生成的一步发酵，所生成的 山山梨糖梨糖80加热几分钟后再加入灭菌的辅料（玉米浆，加热几分钟后再加入灭菌的辅料（玉米浆，尿素及无机盐等），开始第二步的混合菌株发酵。当尿素及无机盐等），开始第二步的混合菌株发酵。当作