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1、第三章食用菌菌种生产第三章食用菌菌种生产本章重点：食用菌制种条件，制种工具的使本章重点：食用菌制种条件，制种工具的使用。用。教学目的：熟练使用制种用品、用具、设备、教学目的：熟练使用制种用品、用具、设备、设施进行制种生产。设施进行制种生产。第一节食用菌菌种的概念第一节食用菌菌种的概念一、菌种的概念一、菌种的概念原意是指孢子（相当于植物的种子），但原意是指孢子（相当于植物的种子），但在实际生产中，常将经过人工培养的纯菌在实际生产中，常将经过人工培养的纯菌丝体连同培养基质一同叫做菌种。丝体连同培养基质一同叫做菌种。菌种担孢子或子囊孢子野生扩大繁殖后的纯次生菌丝体栽培来历野生菌驯化原菌株改良生物技术
2、创新优良菌株扩大繁殖用于生产实行纯培养不含任何杂菌基本要求二、菌种类型一级菌种二级菌种三级菌种级别按保藏用种实验用种生产用种目的状态：固体菌种、液体菌种返回本节（一）级别不同的菌种1.一级种（母种）用分离法首次得到的纯次生菌丝体概念概况培养环境 试管、斜面培养基用途 再生母种扩大原种保藏用种菌丝弱而少、不可直接栽培特点返回本节2.二级种（原种）将母种扩大至粗放培养基上形成的菌种概念概况培养环境菌丝较多而壮、适应性较强特点用途 扩大栽培种大口瓶、较粗放的液体或固体培养基3.三级种（栽培种）将原种扩大至粗放培养基上形成的菌种概念概况培养环境菌丝多而壮、适应性强特点用途栽培生产菌种袋、较粗放的液体或
3、固体培养基（二）状态不同的菌种用固体基质培养的菌种1.固体菌种概念特点设备、工艺简单菌龄长而不一发酵率较低用液体基质培养的菌种2.液体菌种概念特点设备、工艺较复杂菌龄短而一致发酵率高易老化和自溶第二节食用菌制种条件第二节食用菌制种条件一、食用菌制种程序一、食用菌制种程序种菇试管培养基培养母种固体培养基原种固体培养基栽培种培养培养料灭菌培养基灭菌培养料灭菌培养一、制种设施一、制种设施晒料场晒料场 培养料摊晒和处理培养料摊晒和处理原料库原料库 存放原材料存放原材料装料库装料库 培养料混合、分装培养料混合、分装灭菌室灭菌室 培养基灭菌培养基灭菌冷却室冷却室 培养基冷却培养基冷却接种室接种室 各级菌种
4、分级各级菌种分级培养室培养室 菌种培养菌种培养冷藏室冷藏室 成种菌种短期存放成种菌种短期存放 菌种保藏定义菌种保藏定义.二、生产设备二、生产设备1 接种设备：用于分离和扩大各级菌种的专业设备包括接种室、接种箱、超净工作台、接种工具接种室要求：内外两间，面积适宜，容易搞清洁，能进行灭菌内间为接种工作间：56平方米，门窗紧密，尽量减少灰尘积累，内置工作台外间为缓冲间：23平方米，用于进接种间前换衣、帽、鞋，同时为内间提供与外界相隔环境内外间均为拉门，位置相互错开体积应尽量小，利于彻底灭菌装过滤空气的通风设施内外间墙、地板、天花板、室内用具应尽量光滑易擦洗接种室设计接种室设计接种箱缩小的接种室双人、
5、单人操作型易消毒、规模受限制接接种种箱箱超净工作台局部净化设备空气过滤除菌无论接种箱还是净化工作台，均应放在较干净、空气中尘埃少的环境中，最好置于接种室内超超净净工工作作台台接种工具接种针接种环接种刀接种铲镊子接种器等酒酒精精灯灯和和接接种种工工具具2 菌种培养设备放置接种后各级菌种，并提供适宜温度和通气条件，使菌丝生长良好的专用设备培养室培养架：以操作方便为宜,宽0.71.2米，层间40cm调温：电炉、红外线、暖气管、门窗、抽风机测温：干湿球温度计 照明：避免使用蓝光 灭菌：紫外灯三、培养设备三、培养设备菌种培养室菌种培养室培养箱（恒温箱）根据需要使温度恒定在一定范围内,一般用于培养斜面试管
6、和少部分原种恒恒温温培培养养箱箱3、培养基加工设备木材切片机木片粉碎机搅拌机装瓶装袋机4.灭菌设备：灭菌：将环境中的所有微生物杀死。一般采用热力灭菌设备干热灭菌设备原理:利用干燥热空气进行灭菌灼烧灭菌：酒精灯电热恒温干燥箱：160 12小时适宜玻璃器皿、金属用具灭菌湿热灭菌设备利用潮湿热空气进行灭菌高压灭菌手提式高压灭菌锅：9瓶立式高压灭菌锅：45瓶卧室园形高压灭菌锅 270瓶卧式方形高压灭菌锅（消毒柜）500瓶 121 20-60分钟常压灭菌：砖石油桶 蒸笼等 105 68小时5、制种容器和消毒药品容器750ml 无色、浅色菌种瓶聚丙烯菌种袋消毒药品甲醛75%洒精高锰酸钾漂白粉、来苏儿三、菌
7、种厂选建交通方便、水电充足地势干燥、环境干净空气清新、30米内没有畜禽圈舍、饲料仓库、排废工厂有堆放、摊晒原料地菌种厂设计菌种厂设计第四章第四章 制种基本技术制种基本技术知识目标知识目标明确液体菌种制作过程明确液体菌种制作过程熟悉消毒与灭菌的分类与方法熟悉消毒与灭菌的分类与方法菌种制作工艺流程及菌种质量鉴定、保藏的方菌种制作工艺流程及菌种质量鉴定、保藏的方法法三、菌种生产程序四大步骤制培养基灭菌培养接种第一节第一节 培养基制作技术培养基制作技术（一）概念及要求概念人工配制的适于菌种生长的营养基质要求营养种类、比例、水分、pH适宜；保持无菌状态。类型天然：天然有机物合成：已知成分的化学药品半合成
8、：？原料来源状态液体：营养液固体固体：天然固体原料固化：加1.5%2%琼脂表面形状斜面培养基平板培养基（二）培养基的类型粉状条状属天然植物多糖融点96以上凝点40以下冷水中不溶透明度好、粘着力强不被微生物分解利用特性二、各级菌种的培养基（一）母种培养基1.通用配方2.配制过程PDA马铃薯200g、葡萄糖20g琼脂1520g、水1000m1煮沸20min，取定量滤液制马铃薯滤液滤液沸时加入，融后加余料融化琼脂调解pH勿污管口，控制装量分装试管准备灭菌扎捆10%NaOH或HCL（一）营养液制作（一）营养液制作1.1.准备工作准备工作三、制作方法三、制作方法 2.2.称量、材料预处理称量、材料预处理
9、按配方准确称量各营养物质。将马铃薯去皮、按配方准确称量各营养物质。将马铃薯去皮、挖掉芽眼后称量挖掉芽眼后称量200g200g，切成，切成1cm1cm见方的小块。琼脂见方的小块。琼脂剪碎后用水浸泡。剪碎后用水浸泡。3.3.熬煮熬煮将将切切好好的的马马铃铃薯薯块块加加适适量量水水后后放放入入电电饭饭锅锅中中，煮至酥而不烂。煮至酥而不烂。4.4.过滤、加可溶药物过滤、加可溶药物 用双层沙布过滤，取滤汁，放在电饭锅中加用双层沙布过滤，取滤汁，放在电饭锅中加 入糖入糖 5.5.熬琼脂、定容熬琼脂、定容 在沸腾状态下加入琼脂，直到琼脂完全在沸腾状态下加入琼脂，直到琼脂完全溶化为止，定容至溶化为止，定容至1
10、000ml1000ml。（二）营养液分装（二）营养液分装 1.1.用注射器分装用注射器分装 2.2.分装标准分装标准:分装量为试管长度的分装量为试管长度的1/41/41/51/5。注意培养基不能沾污试管口。注意培养基不能沾污试管口。3.3.塞棉塞塞棉塞棉塞松紧适度，棉塞松紧适度，1/31/3在管外，在管外，2/32/3在管内。在管内。4.4.扎捆扎捆7-107-10支支试试管管捆捆在在一一起起，棉棉塞塞上上包包好好防防水水纸纸，直直立放入高压灭菌锅中。立放入高压灭菌锅中。(四四)摆斜面摆斜面灭菌结束后锅盖开灭菌结束后锅盖开1/51/5的小缝，用余热烘干报纸和的小缝，用余热烘干报纸和棉塞，然后摆
11、斜面。斜面长是试管总长的棉塞，然后摆斜面。斜面长是试管总长的1/21/2 （三）灭菌处理（三）灭菌处理 在在1.01.5 kg/cm1.01.5 kg/cm2 2压力下维持压力下维持20-30min20-30min。(四四)摆斜面摆斜面灭菌结束后锅盖开灭菌结束后锅盖开1/51/5的小缝，用余热烘干报纸和的小缝，用余热烘干报纸和棉塞，然后摆斜面。斜面长是试管总长的棉塞，然后摆斜面。斜面长是试管总长的1/21/2（二）原种、栽培种培养基主料棉籽壳87，麦麸10辅料白糖1，石灰1，过磷酸钙1配方（%）棉壳、麦麸干混余料溶于水后浇入主料清水翻拌至含水量配制1.种类(1)棉籽壳培养基主料 麦粒、玉米粒等
12、98.5%辅料 石膏粉1%,碳酸钙0.5%调pH与分装pH：一般为8.0左右原种培养基装大口瓶栽培种培养基装菌种袋配方（%）颗粒洗净，1%石灰水泡胀文火煮沸1520min晾至无明水后拌入余料配制(2)颗粒培养基栽培种的装袋第二节第二节 消毒与灭菌技术消毒与灭菌技术（一）消毒（一）消毒（disinfection）指杀灭物体中的病原微生物的方法。消指杀灭物体中的病原微生物的方法。消毒只要求达到消除传染性的目的，而对毒只要求达到消除传染性的目的，而对非病原微生物及其芽胞、孢子并不严格非病原微生物及其芽胞、孢子并不严格要求全部杀死。要求全部杀死。空间消毒法、表面消毒法、基质消毒法、空间消毒法、表面消毒
13、法、基质消毒法、煮沸消毒法煮沸消毒法常用的消毒药品常用的消毒药品 酒精、甲醛、硫磺、多菌灵、克霉灵、酒精、甲醛、硫磺、多菌灵、克霉灵、气雾消毒剂、生石灰、高锰酸钾等、石气雾消毒剂、生石灰、高锰酸钾等、石碳酸。碳酸。紫外线灯紫外线灯30W30W（二）灭菌（二）灭菌（sterilization）指杀灭物体中所有病原微生物和非指杀灭物体中所有病原微生物和非病原微生物及其芽孢、霉菌孢子的病原微生物及其芽孢、霉菌孢子的方法。方法。1.干热灭菌法干热灭菌法 (1)火焰灭菌法火焰灭菌法:火焰直接烧灼，如接种环火焰直接烧灼，如接种环。(2)热空气灭菌法热空气灭菌法 干热灭菌器适用于高温下不损坏、不变质的物品干
14、热灭菌器适用于高温下不损坏、不变质的物品,如玻璃器皿、瓷器等的灭菌。如玻璃器皿、瓷器等的灭菌。灭菌温度需灭菌温度需160维持维持2 h。2.湿热灭菌法湿热灭菌法 (1)煮沸灭菌煮沸灭菌:煮沸煮沸1020 min可杀死所有细菌的繁殖可杀死所有细菌的繁殖 体，芽孢常需煮沸体，芽孢常需煮沸12 h才被杀死才被杀死。用于饮水、一般器械。用于饮水、一般器械 如刀剪的消毒。如刀剪的消毒。(2)巴氏消毒法巴氏消毒法:以较低温度杀灭液态食品中的病原菌或特以较低温度杀灭液态食品中的病原菌或特定微生物，而又不致严重损害其营养成分和风味的消毒方法定微生物，而又不致严重损害其营养成分和风味的消毒方法.1.低温维持巴氏
15、消毒法低温维持巴氏消毒法 6365 30min 2.高温瞬时巴氏消毒法高温瞬时巴氏消毒法 7172 15s 3.超高温巴氏消毒法超高温巴氏消毒法 132 12s （3）流通蒸汽灭菌法）流通蒸汽灭菌法：是一种常压蒸汽消毒法，细菌是一种常压蒸汽消毒法，细菌繁殖体繁殖体15-30分钟可杀灭，但芽孢不全部被杀灭。分钟可杀灭，但芽孢不全部被杀灭。(4)间歇灭菌法间歇灭菌法（反复多次流通蒸汽）（反复多次流通蒸汽）100维持维持30min 温箱过夜温箱过夜 100维持维持30min 温箱过夜温箱过夜 100维持维持30min 温箱过夜温箱过夜 100维维持持30min。此法常用于一些不耐高温的培养基，如鸡蛋
16、培养基、此法常用于一些不耐高温的培养基，如鸡蛋培养基、血清培养基、糖培养基的灭菌血清培养基、糖培养基的灭菌。高压蒸汽灭菌器：高压蒸汽灭菌器：15磅磅/平方平方英寸，英寸，121.3温度下维持温度下维持1520min，可杀灭包括细，可杀灭包括细菌芽孢在内的所有微生物菌芽孢在内的所有微生物。应用此法灭菌，一定要充分应用此法灭菌，一定要充分排除灭菌器内原有的冷空气。排除灭菌器内原有的冷空气。用于普通培养基、生理盐水、用于普通培养基、生理盐水、耐热药品、手术敷料等。耐热药品、手术敷料等。手提式高压蒸汽灭菌器手提式高压蒸汽灭菌器（5）高压蒸汽灭菌法）高压蒸汽灭菌法3.辐射杀菌法辐射杀菌法 1.紫外线灭菌
17、紫外线灭菌 紫外线的穿透力弱，因此一般紫外线的穿透力弱，因此一般用于手术室、传染病房、细菌实验室的空气消用于手术室、传染病房、细菌实验室的空气消毒。紫外线对人体皮肤、眼睛有损伤作用，应毒。紫外线对人体皮肤、眼睛有损伤作用，应注意防护。注意防护。2.电离辐射电离辐射 常用于一次性塑料制品的消毒。常用于一次性塑料制品的消毒。3.微波微波 不能穿透金属表面。不能穿透金属表面。4.滤过除菌法滤过除菌法 滤过除菌法是用物理阻留的方法将液体或空气滤过除菌法是用物理阻留的方法将液体或空气中的细菌除去，以达到无菌目的。主要应用于中的细菌除去，以达到无菌目的。主要应用于一些不耐高温灭菌的血清、毒素、抗生素以及一
18、些不耐高温灭菌的血清、毒素、抗生素以及空气的除菌。空气的除菌。三、培养基的灭菌（一）母种培养基的灭菌无菌检验约30条件下空白培养23天灭菌与摆斜面摆斜面摆斜面1kg/cm2(103kpa、121）2030min母基灭菌与摆斜面（二）原种、栽培种培养基的灭菌高压灭菌1.5kg/cm2（152kpa、128.1）灭菌12h 常压灭菌100灭菌10h左右再闷12h要求攻头、控中、保尾 第三节 菌种扩繁与培养一、无菌操作二、母种的接种（一）转管法三、原种、栽培种的接种概念：菌种移至新培养基上的过程关键：无菌操作接种在严格消毒灭菌条件下进行的操作概念一、无菌操作接种环境消毒灭菌酒精棉球消毒双手开启的管口、瓶口靠近灯焰拔出的棉塞勿触及任何地方动作快，接种时间勿太长要点必备转管法注意种块勿太大原老种块勿再接入传代次数勿太多将母种移入新的过程概念过程接种环取绿豆粒大母种移入新斜面中部转管三、原种、栽培种的接种接原种用接种耙取蚕豆大母种放于瓶中料面上接栽培种用接种匙（镊、铲）取枣大原种放于袋的两端或瓶中料面上表面老菌丝及老种块勿接入栽培种接种1.黄毅.食用菌栽培.北京：高等教育出社，19982.中国食用菌菌种网1.栽培时为何不用母种作菌种？2.母种扩成原种的目的是什么？3.菌种的基本要求是什么？思考、讨论题课外学习资源