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1、第一章微生物的纯培养和显微技术本讲稿第一页，共三十页第一节 微生物的纯培养技术一一.纯培养的分离方法纯培养的分离方法（一）稀释法（一）稀释法 （二）平板划线分离法（二）平板划线分离法（三）单细胞（单孢子）挑取法（三）单细胞（单孢子）挑取法 （四）利用选择培养基分离法（四）利用选择培养基分离法二二.无菌技术无菌技术三三.微生物的保藏技术微生物的保藏技术本讲稿第二页，共三十页几个概念：纯培养技术：纯培养技术：把特定微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的技术。纯培养纯培养（pure culture）：微生物学中将在实验室条件下，从一个细胞或一种细胞 群繁殖得到的后代，称为纯培养。混合培养物混
2、合培养物：含有两种以上微生物的培养物。二元培养物二元培养物：只含有二种微生物，并保持二者之间特定关系的培养物。本讲稿第三页，共三十页平板平板（culture plate）：即培养平板的简称，指熔化的固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛有固体培养基的平皿。菌落菌落（colony）：生长在固体培养基表面或内部，来源于一个细胞、具有一定形态结构的、肉眼可见的子细胞群体。菌苔菌苔（lawn）：众多菌落在固体培养基表面连成一片时，称为菌苔。本讲稿第四页，共三十页一一.纯培养的分离方法纯培养的分离方法（一）稀释法1.固体稀释倒平板法：固体稀释倒平板法：将待分离材料作一系列稀释（将待分离材料作一系列稀释（
3、1/10，1/100，1/1000，），），取不同吸收液各少许与已熔化并冷却至取不同吸收液各少许与已熔化并冷却至45左右的琼脂培养基混合，左右的琼脂培养基混合，摇匀后倾入灭菌摇匀后倾入灭菌过的培养皿中过的培养皿中凝固后保温培养一定时间凝固后保温培养一定时间挑取挑取单个菌落，重复以上过程单个菌落，重复以上过程获得纯培养。获得纯培养。本讲稿第五页，共三十页本讲稿第六页，共三十页2.涂布平板法：涂布平板法：与上法相似，不同之处在于：先制平板与上法相似，不同之处在于：先制平板将一定量的将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面用无菌涂棒用无菌涂棒将菌液涂匀将菌液涂匀
4、培养培养挑取单个菌落，重复以上过程挑取单个菌落，重复以上过程获得纯培养。获得纯培养。本讲稿第七页，共三十页3.液体稀释法：适于细胞较大的微生物液体稀释法：适于细胞较大的微生物 待分离材料待分离材料接种于培养液中接种于培养液中培养培养测定或估计单测定或估计单位容积中的含菌数目位容积中的含菌数目稀至两、三滴液体中只含有一个稀至两、三滴液体中只含有一个微生物个体微生物个体每次取一滴至另一盛有新鲜培养基的试管每次取一滴至另一盛有新鲜培养基的试管中中摇匀，培养摇匀，培养观察观察大多数试管无微生物生长，少大多数试管无微生物生长，少数管底有一菌落，可能由一个细胞繁殖而来。数管底有一菌落，可能由一个细胞繁殖而
5、来。本讲稿第八页，共三十页 4.稀释摇管法：适于分离严格厌养菌。稀释摇管法：适于分离严格厌养菌。一系列盛由固体培养基的试管一系列盛由固体培养基的试管加热熔化加热熔化冷却冷却至至50左右左右保温保温加入待分离材料进行梯度稀释加入待分离材料进行梯度稀释迅速摇匀迅速摇匀冷凝冷凝倾注一层灭菌过的石蜡倾注一层灭菌过的石蜡培培养养挑取单个菌落。挑取单个菌落。；本讲稿第九页，共三十页本讲稿第十页，共三十页（二）平板划线分离法方法：制平板方法：制平板用接种环沾取少许待分离材料用接种环沾取少许待分离材料在培养基表面在培养基表面连续画线，随着接种环的移动，微生物得以分散连续画线，随着接种环的移动，微生物得以分散培
6、养培养在画在画线的后面部位可形成单独的菌落线的后面部位可形成单独的菌落挑取单个菌落挑取单个菌落培养培养获得获得纯培养纯培养本讲稿第十一页，共三十页本讲稿第十二页，共三十页（三）单细胞（单孢子）挑取法单细胞（单孢子）挑取法适用于分离混杂微生物中弱势群体。适用于分离混杂微生物中弱势群体。方法：方法：（1）用显微操作仪在显微镜下用毛细吸管或显微针、钩、环等挑取）用显微操作仪在显微镜下用毛细吸管或显微针、钩、环等挑取获得纯培养。获得纯培养。（2）用一般显微镜，将一滴经适当稀释后的菌液置于载玻片上，）用一般显微镜，将一滴经适当稀释后的菌液置于载玻片上，选取只含有一个细胞的液滴进行纯培养的分离。选取只含有
7、一个细胞的液滴进行纯培养的分离。此法多限于高度专业化的科学研究中采用。此法多限于高度专业化的科学研究中采用。本讲稿第十三页，共三十页（四）利用选择培养基分离法利用选择培养基分离法1.抑制其它微生物的生长：抑制其它微生物的生长：控制控制pH、温度，加抗生素等、温度，加抗生素等 2.富集培养：富集培养：光照、温度、高压、紫外线、氧气、营养等。光照、温度、高压、紫外线、氧气、营养等。通过设置有利于某些或某一微生物生长的特定条件，通过设置有利于某些或某一微生物生长的特定条件，使适应该条件的微生物旺盛生长。使适应该条件的微生物旺盛生长。此法易分离到某些特定微生物或弱势微生物。此法易分离到某些特定微生物或
8、弱势微生物。本讲稿第十四页，共三十页本讲稿第十五页，共三十页二.无菌技术1.常用器具的灭菌常用器具的灭菌常用器具：常用器具：试管、烧瓶、培养皿、涂棒、移液管、接种环等试管、烧瓶、培养皿、涂棒、移液管、接种环等方法：方法：这些器具在灭菌前须先进行包扎或装入特定容器中。这些器具在灭菌前须先进行包扎或装入特定容器中。（1）高压蒸汽灭菌）高压蒸汽灭菌 0.1MPa 121.3 1530min（2）高温干热灭菌）高温干热灭菌 160170 2h（3）烧灼灭菌）烧灼灭菌本讲稿第十六页，共三十页2.培养基的灭菌：培养基的灭菌：高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌 过滤灭菌：适于不耐温的材料过滤灭菌：适于不耐温的材料3.
9、无菌操作：无菌操作：在火焰旁或无菌箱、超净工作台上操作。在火焰旁或无菌箱、超净工作台上操作。本讲稿第十七页，共三十页本讲稿第十八页，共三十页三.微生物的保藏技术（一）保藏目的（一）保藏目的在菌种一定时间内不死亡、不变异（丢失重要的生物学性状）、在菌种一定时间内不死亡、不变异（丢失重要的生物学性状）、不被污染。不被污染。（二）保藏原理（二）保藏原理根据微生物的生理生化特性，人工创造不适宜微生物生长繁殖根据微生物的生理生化特性，人工创造不适宜微生物生长繁殖的条件，降低代谢能力，以保持其遗传性、减少变异性，达到的条件，降低代谢能力，以保持其遗传性、减少变异性，达到长期保藏的目的。长期保藏的目的。休眠
10、或休眠或半休眠半休眠本讲稿第十九页，共三十页（三）保藏方法（三）保藏方法 1.低温保藏法低温保藏法：（1）传代培养保藏）传代培养保藏(冰箱保藏法、定期移植法）冰箱保藏法、定期移植法）（2）超低温保藏法）超低温保藏法 液氮（液氮（-195）低温冰箱低温冰箱 2.干燥保藏法：干燥保藏法：沙土管保藏法沙土管保藏法 3.隔绝空气保藏法隔绝空气保藏法 冷冻真空干燥保藏法冷冻真空干燥保藏法本讲稿第二十页，共三十页第二节 显微技术 一一.普通光学显微镜普通光学显微镜（一）油镜的工作原理（一）油镜的工作原理 加油原因：加油原因：1.增加视野亮度增加视野亮度 2.增加分辨率：增加分辨率：最小可分辨距离最小可分辨
11、距离=/2NA NA=n.Sin 本讲稿第二十一页，共三十页（二）使用方法（二）使用方法本讲稿第二十二页，共三十页二、暗视野显微镜 观察细菌的运动性三、相差显微镜 观察细微结构四、荧光显微镜 特殊成分本讲稿第二十三页，共三十页本讲稿第二十四页，共三十页本讲稿第二十五页，共三十页本讲稿第二十六页，共三十页本讲稿第二十七页，共三十页五.电子显微镜以电子束为光源，因波长缩短，故分辨率提高。以电子束为光源，因波长缩短，故分辨率提高。透射电镜的样品制备及观察：透射电镜的样品制备及观察：1.金属网的处理金属网的处理 载网载网 200400目的铜网目的铜网 2.支持膜的制备支持膜的制备 塑料膜、碳膜、金属膜
12、塑料膜、碳膜、金属膜 3.将支持膜转移到至载网上将支持膜转移到至载网上 4.制片：滴液法、超薄切片法、复型法、冰冻蚀刻法等制片：滴液法、超薄切片法、复型法、冰冻蚀刻法等 5.观察观察 。本讲稿第二十八页，共三十页本讲稿第二十九页，共三十页1.为什么说纯培养技术是微生物学建立与发为什么说纯培养技术是微生物学建立与发展的基石？一般可用哪些方法获得微生物展的基石？一般可用哪些方法获得微生物的纯培养？的纯培养？2.试找到一篇使用微生物照片的文献，分析试找到一篇使用微生物照片的文献，分析该文为什么要使该文为什么要使 用微生物照片，采用的是用微生物照片，采用的是何种显微观察技术？依你之见，该文作者何种显微观察技术？依你之见，该文作者的这张照片还可以用哪些技术获得？的这张照片还可以用哪些技术获得？本讲稿第三十页，共三十页