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1、浓缩单宁合成的分子调控及紫花苜蓿遗传转化研究姓名：xxx紫色苜蓿的一般介绍紫花苜蓿(Medicago sativa L.)草质优良、营养丰富、适口性强，被誉为“饲草之王”，是亚洲、北美洲利用最广泛、最重要的豆科牧草。然而，反刍牲畜采食新鲜苜蓿后易引起膨胀病(bloat)，影响到它在放牧方面的利用。一般认为，苜蓿叶片中浓缩单宁(condensed tannins，CT)含量低是引起反色牲畜膨胀病的主要原因。通过遗传调控，促使叶片中CT合成和积累是苜蓿遗传育种的重要研究内容，具有重要的理论和实践意义。紫色苜蓿的一般介绍膨胀病的发生机制膨胀病(bloating)是一种反当家畜消化系统失调的疾病。反当
2、牲畜采食新鲜首蓓在瘤胃中会被快速消化，细胞破裂，细胞内含物，尤其是可溶性蛋白在采食后很短的时间里释放出来，在微生物作用下，致使瘤胃里蓄积由气体、泡沫、砧液和部分消化了的颗粒状植物材料形成的厚而粘稠的半固态多泡沫复合体，这种半固态多泡沫复合体进一步吸附由微生物发酵产生的气体。这种混合型气体难以通过打隔排出牲畜体外，随着发酵气体的不断产生，瘤胃逐渐膨胀起来，膨胀的瘤胃上顶胸隔膜阻止呼吸，使牲畜在很短的时间里窒息、死亡浓缩单宁的抗膨胀机理CT中的轻基有与其他化合物形成氢键的强烈趋势，它可与蛋白质上的多个位点相结合，使蛋白质的空间构像发生改变，从而阻止了蛋白质在消化道内被降解。另外，CT可直接作用于水
3、解酶，使其活性丧失。CT与蛋白质的复合物很稳定，在pH为4.5一7.0时仍以沉淀形式存在这种复合物可能在pH更低的皱胃和具有碱性环境的小肠中分解。同时，研究人员还发现单宁对不同蛋白质和氨基酸结合能力不同，它易于和富含脯氨酸(Pro)的蛋白质结合，如它能和唾液粘蛋白优先结合，而牛羊不能分泌这种唾液粘蛋白，故反当动物饲料中的单宁可与日粮蛋白结合，这为减少朦胀病的发生提供了保护屏障。研究的意义长期以来，因反当动物采食新鲜苜蓿引起膨胀病限制了这一优良牧草的直接利用。到目前为止，采用常规杂交或诱变育种手段尚未选出这样的品种。其原因可能是CT含量为隐性基因所控制，而隐性基因只有在纯合时才可表现，致使选择效
4、率极低。利用原生质体融合技术将CT含量高、不致朦胀病的豆科牧草基因组导入首蓓之中，但该技术的最大缺点是再生频率太低，难以在育种实际中应用。利用基因工程技术提高首蓓CT的合成水平，育成不引起朦胀病的首楷品系是培育不引起朦胀病首蓓品种的新的尝试。技术基础CT生物合成途径是一个较为复杂的过程，有多个酶参与其合成代谢途径，其中二氢黄酮还原酶(dihydroflavonol reduetase，DFR)为CT合成途径的限速酶，调控DFR基因表达水平将是增加CT含量的关键所在。但植株内过高的单宁含量会造成饲草适口性差而且会降低牲畜对蛋白的利用效率，在转DFR基因的苜蓿中还须考虑将CT积累控制在适度的水平，
5、以免造成适口性和降低营养价值，这就需要将DFR基因置于特定的启动子控制之下，达到限量、定位表达。研究的内容(1)PNZIP基因启动子的克隆和组织特异性、活性鉴定:从裂叶牵牛中克隆PNZIP启动子，以GFP做为报告基因构建PNZIP启动子驱动的植物表达载体，在模式植物烟草中鉴定PNZIP的组织特异性和活性。(2)DFR基因的克隆及对CT合成的调控效果鉴定:从蒺藜苜蓿中克隆DFR基因，构建原核表达载体进行原核表达，验证基因编码序列的完整性。构建PNZIP启动子和组成型CaMV35S启动子驱动的DFR基因植物表达载体，遗传转化烟草来鉴定DFR基因在高等植物中的表达活性，验证通过DFR调控CT生物合成
6、和积累的可行性。(3)农杆菌介导的PNZIP启动子驱动的DFR基因遗传转化紫花苜蓿的研究:通过农杆菌侵染系统、培养基及抗生素的筛选来优化转化系统获得较高频率的转化体系。技术图谱蒺藜苜蓿幼果裂叶牵牛子叶RNA提取 反转录cDNADNACTAB法PCRPCRDFR cDNAPNZIP启动子PNZIP启动子活性CaMV35启动子、PNZIP启动子驱动的DFR基因植物表达载体构建农杆菌介导法转化苜蓿转转基因苜蓿抗性植株获得缩合单宁的合成过程苯丙氨酸二氢山奈酚二氢栋皮黄酮二氢杨梅黄酮醇黄烷一3，4一二醇二氢黄酮还原酶DFR缩合单宁黄烷3，4-二醇还原酶结论本项目针对苜蓿作为鲜食牧草容易发生膨胀病问题展开
7、研究，对膨胀因子CT的生物合成及在分子水平的调控开展了一系列与CT生物合成相关基因克隆、表达及控制CT表达水平和位点的组织特异启动子的相关试验，取得的主要结果有:结论1.采用RT-PCR方法从蒺藜苜蓿(Medicargo trunctula L.)幼果中克隆到二氢黄酮还原酶(DFR)基因cDNA片段，分子大小约 1018bp。与GenBank中已注册的DFR基因同源性为99.8%，翻译序列表明此序列编码337个氨基酸，编码分子量为 39.8kDa的酶蛋白分子。在此基础上利用DFR基因PCR引物中设计的BamHI和SacI酶切位点，将DFR基因成功插入到pET28a(+)的T7启动子和终止子之间
8、，构建携带6xHis标签的原核表达载体pETDFR。SDS一PAGE电泳鉴定DFR基因经IPTG诱导后的表达产物，获得了与理论分子量相同的高水平特异表达蛋白条带。结论2.采用pCR技术，克隆到裂叶牵牛，harbitis nil ehoisy MomingaGlory)光合组织特异性启动子PNZIP的功能区段，分子大小约 1487bP。通过序列分析与文献报道的碱基序列同源性达到85.38%，并在线分析序列，表明所克隆的片段含有典型的真核生物核心启动子区域(一60一 10bp)和多个TAITA一box、CAAT-box等启动子元件，还存在I一box、ACE、G一box、CAANNNNATC元件、B
9、ox一11、CCAAT一盒等6类光效应元件。并利用绿色荧光蛋白基因(GFP)作为报道基因，构建PNZIP启动子驱动的GFP基因植物表达载体，根据被转化烟草组织和细胞中的荧光强度，判断了启动子的活性和组织特异性，转基因烟草的叶、茎组织中GFP基因有明显的表达，而其它组织中未见其表达，说明该启动子具有光合组织特异性活性特点。结论3.以pB1121为基础载体，成功构建了组成型 CaMv35s启动子、光合组织特异型PNZIP启动子驱动的DFR基因植物表达载体pBIDFR和pPNDFR;用直接导入法将两个植物表达载体导入农杆菌EHA105，得到了农杆菌工程菌pBIDFR/EHA105，pPNDFR/EH
10、A105菌株。结论4.用农杆菌工程菌pBIDFR/EHA105，pPNDFR/EHA105菌株转化红花大金子(Zn=4X=48)烟草 (Nictiana tabacom L.)，获得了Kan抗性再生植株。测定了野生型烟草(对照)、不同启动子驱动的DFR基因转化再生烟草的叶片、茎和根等器官中的CT含量，结果显示由于DFR基因的导入提高了转基因烟草中的CT含量。以组成型启动子驱动的DFR基因(pBIDFR)转化烟草各器宫中CT含量最高显著高于对照，叶片中的含量达到4.27mg/g;而以光合组织特异表达启动子驱动的DFR基因(pPNDFR)转基因烟草的茎叶中浓缩单宁含量显著高于野生型烟草，其中叶片中浓缩单宁含量达到4.01mg/g。结论5.以“中首一号”首蓓子叶为材料，优化了农杆菌工程菌pPNDFR/EHA105转化体系，筛选出5一7d龄子叶预培养3d、工程菌液侵染30min和共培养3d的转化体系可以获得70%以上的抗性愈伤组织诱导率。诱导抗性愈伤组织产生不定芽、不定根，获得6株抗性转基因植株和一批抗性不定芽。本研究首次报道了利用关键酶基因DFR上调表达转化植物中CT的积累量;在外源基因的表达策略上，将DFR基因置于光合组织特异性启动子的调控下，达到了DFR基因定时、定量的表达，解决了CT的生物合成的定点、定量调控。因此，本研究具有创新性。