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1、第三章第三章第三章第三章 酶工程酶工程酶工程酶工程酶工程简介酶工程简介酶工程简介酶工程简介酶工程（酶工程（Enzyme engineeringEnzyme engineering）是指通过化学是指通过化学方法、酶学方法和方法、酶学方法和DNADNA重组技术改善自然酶的重组技术改善自然酶的形成、结构和性质，提高酶的催化活性、降低形成、结构和性质，提高酶的催化活性、降低成本并在大规模工业化生产中成本并在大规模工业化生产中应用。应用。主要内容：主要内容：1 1 酶的制备和酶与细胞的固定化酶的制备和酶与细胞的固定化2 2 酶反应器的设计和放大酶反应器的设计和放大3 3反应条件的控制和优化反应条件的控制
2、和优化.第一节第一节第一节第一节 概概概概 述述述述酶工程的分类化学酶工程：通过对酶的化学修饰或固定化处理，改善酶的性质，提高酶的效率和降低成本，甚至通过化学合成法制造人工酶，也称为初级酶工程；生物酶工程：用基因工程技术生产酶以及对酶基因进行修饰或设计性能稳定、具有新的生物活性及催化效率更高的酶，也称为高级酶工程。一、酶的定义一、酶的定义一、酶的定义一、酶的定义酶酶酶是由生物体内活细胞产生的一种生物催化剂，是由生物体内活细胞产生的一种生物催化剂，是由生物体内活细胞产生的一种生物催化剂，按化学组成的不同主要分为按化学组成的不同主要分为按化学组成的不同主要分为核酸类酶核酸类酶核酸类酶（R R R酶
3、）酶）酶）和和和蛋白质类酶蛋白质类酶蛋白质类酶（P P P酶）。酶）。酶）。二、酶的分类与命名法二、酶的分类与命名法1 习惯命名法习惯命名法底物名称：底物名称：淀粉酶、蛋白酶淀粉酶、蛋白酶催化反应性质：氧化酶、转氨酶催化反应性质：氧化酶、转氨酶底物结合催化反应性质：胆固醇氧化酶、醇脱氢酶底物结合催化反应性质：胆固醇氧化酶、醇脱氢酶来源：心肌黄酶、含铁酶来源：心肌黄酶、含铁酶缺点：无系统性，一酶数名或一名数酶。缺点：无系统性，一酶数名或一名数酶。2 系统命名法与分类系统命名法与分类国际生化联合会（国际生化联合会（IUBIUB）酶学委会于）酶学委会于19611961年规定了年规定了酶的统一命名法及
4、分类原则。酶的统一命名法及分类原则。系统命名法：酶的名称由底物及反应类型两部分组系统命名法：酶的名称由底物及反应类型两部分组成。成。六大类：氧化六大类：氧化-还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶。异构酶和连接酶。三、酶的结构和特性三、酶的结构和特性1 酶的结构酶的结构酶的组成成分酶的组成成分酶的组成成分酶的组成成分单纯酶单纯酶仅由蛋白质组成的酶。仅由蛋白质组成的酶。结合酶结合酶除蛋白质外，还有非蛋白质的成分。除蛋白质外，还有非蛋白质的成分。全酶全酶=酶蛋白酶蛋白+辅因子辅因子辅因子有两种：辅酶和辅基辅因子有两种：辅酶和辅基根据酶的聚合状态，酶可以分为三
5、类：根据酶的聚合状态，酶可以分为三类：根据酶的聚合状态，酶可以分为三类：根据酶的聚合状态，酶可以分为三类：单体酶单体酶寡聚酶寡聚酶多酶复合体多酶复合体酶的活性中心酶的活性中心指酶分子中直接和底物结合，并指酶分子中直接和底物结合，并和酶催化作用直接相关的部位。和酶催化作用直接相关的部位。组成：组成：由一些氨基酸残基的侧链基团组成。这些基团在由一些氨基酸残基的侧链基团组成。这些基团在一级结构上可能相聚很远，甚至可能不在一一级结构上可能相聚很远，甚至可能不在一条肽链上，但在蛋白质空间结构上彼此靠近，条肽链上，但在蛋白质空间结构上彼此靠近，形成具有一定空间结构的区域。形成具有一定空间结构的区域。对于结
6、合酶，辅因子常常是活性中心的组成部分。对于结合酶，辅因子常常是活性中心的组成部分。酶活性中心的特点：酶活性中心的特点：a)a)活性中心在酶分子总体积中只占相当小的部分活性中心在酶分子总体积中只占相当小的部分（1-2%1-2%），相当于），相当于2-32-3个氨基酸。个氨基酸。b)b)都是酶分子表面的一个凹穴，有一定的大小和形都是酶分子表面的一个凹穴，有一定的大小和形状，但不是刚性的，而具有一定的柔性。状，但不是刚性的，而具有一定的柔性。c)c)活性中心为非极性的微环境，有利于与底物结合。活性中心为非极性的微环境，有利于与底物结合。d)d)底物与酶通过形成较弱键力的次级相互作用并结底物与酶通过形
7、成较弱键力的次级相互作用并结合到酶的活性中心。合到酶的活性中心。e)e)酶的活性部位并不是和底物的几何图形正好吻合，酶的活性部位并不是和底物的几何图形正好吻合，而是在酶与底物结合的过程中，底物分子或酶分而是在酶与底物结合的过程中，底物分子或酶分子或它们两者的构想同时发生一定变化后才能相子或它们两者的构想同时发生一定变化后才能相互契合，这时催化基团的位置也正好处于所催化互契合，这时催化基团的位置也正好处于所催化底物的敏感化学键部位。底物的敏感化学键部位。2 酶的特性催化效率高催化效率高专一性强专一性强反应条件温和反应条件温和催化活性受到调节和控制催化活性受到调节和控制四、酶的来源四、酶的来源酶作
8、为生物催化剂普遍存在于动物、植物和微生物酶作为生物催化剂普遍存在于动物、植物和微生物中，可直接从生物体中分离提纯。中，可直接从生物体中分离提纯。酶的生产方法可分为提取法酶的生产方法可分为提取法发酵法以及化学合成发酵法以及化学合成法。法。化学法仍在实验室阶段；化学法仍在实验室阶段；提取法是最早采用且沿用至今的方法，如从提取法是最早采用且沿用至今的方法，如从动植物组织液中提取胰蛋白酶和菠萝蛋白酶；动植物组织液中提取胰蛋白酶和菠萝蛋白酶；发酵法是发酵法是5050年代以来酶生产的主要方法，如年代以来酶生产的主要方法，如生成葡萄糖异构酶和枯草芽孢杆菌蛋白酶等。生成葡萄糖异构酶和枯草芽孢杆菌蛋白酶等。五、
9、酶促动力学六、酶的分离纯化与酶的活力测定1 酶的分离纯化细胞外酶和细胞内酶细胞外酶和细胞内酶在生物细胞内除了目标酶还有很多其他的酶，因在生物细胞内除了目标酶还有很多其他的酶，因此需要分离和纯化的步骤。此需要分离和纯化的步骤。基本步骤：基本步骤：破碎细胞膜破碎细胞膜抽提抽提纯化纯化比活力：纯度的量度，指每毫克质量的蛋白质中所含的某种酶的催化活力，一般用单位/毫克蛋白（U/mg蛋白质表示）。酶的比活力越高，酶的纯度也就越高。纯化倍数=每次比活力/第一次比活力产率%=每次总活力/第一次总活力2 2 酶的活力测定酶的活力测定1 1 1 1个酶活力国际单位个酶活力国际单位个酶活力国际单位个酶活力国际单位
10、是指在特定条件下，是指在特定条件下，是指在特定条件下，是指在特定条件下，1min1min1min1min内生成内生成内生成内生成1 1 1 1molmolmolmol产物的酶量（或转化产物的酶量（或转化产物的酶量（或转化产物的酶量（或转化1 1 molmolmolmol 底物的酶量）。底物的酶量）。底物的酶量）。底物的酶量）。第二节第二节 酶和细胞固定化酶和细胞固定化酶固定化技术发展史2020世纪世纪6060年代，以色列科学家发现酶的固定化现象。年代，以色列科学家发现酶的固定化现象。19691969年，千畑一郎等将固定化氨基酰化酶应用于生产年，千畑一郎等将固定化氨基酰化酶应用于生产L-L-氨氨
11、基酸，开创了固定化酶应用于工业生产的先例；基酸，开创了固定化酶应用于工业生产的先例；19711971年召开的第一届国际酶工程会议上，建议采用统一的年召开的第一届国际酶工程会议上，建议采用统一的英文名称英文名称Immobilized EnzymeImmobilized Enzyme；19731973年，固定化大肠杆菌菌体中的天冬氨酸酶连续生产年，固定化大肠杆菌菌体中的天冬氨酸酶连续生产L-L-天冬氨酸。天冬氨酸。19861986年，利用固定化原生质体发酵生产碱性磷酸酶和葡萄年，利用固定化原生质体发酵生产碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶等相继获得成功。糖氧化酶等相继获得成功。一、固定化酶的制备一、固定化酶
12、的制备 固定化酶的定义：固定化酶的定义：固定化酶的定义：固定化酶是指限制或固定于固定化酶是指限制或固定于固定化酶是指限制或固定于特定空间特定空间特定空间位置的酶，具体来说，位置的酶，具体来说，位置的酶，具体来说，是指是指是指经物理经物理经物理或化学方法处理，使酶或化学方法处理，使酶或化学方法处理，使酶变成不易随变成不易随变成不易随水流失即运水流失即运水流失即运动受到限制，而动受到限制，而动受到限制，而又能发挥又能发挥又能发挥催化作用的酶催化作用的酶催化作用的酶制剂。制剂。制剂。广义的固定化酶包括：广义的固定化酶包括：广义的固定化酶包括：固定化辅酶；固定化细胞；固定化细胞器固定化辅酶；固定化细胞
13、；固定化细胞器固定化辅酶；固定化细胞；固定化细胞器为了减少从微生物或者其他生物体中提取酶的麻烦，有时为了充为了减少从微生物或者其他生物体中提取酶的麻烦，有时为了充为了减少从微生物或者其他生物体中提取酶的麻烦，有时为了充分利用生物细胞的多酶系统，开发另外一种固定化催化剂的形分利用生物细胞的多酶系统，开发另外一种固定化催化剂的形分利用生物细胞的多酶系统，开发另外一种固定化催化剂的形式，固定化细胞。式，固定化细胞。式，固定化细胞。固定化酶固定化酶的特点的特点 具有生物催化剂的功能，又具有生物催化剂的功能，又有固相有固相 催化剂的功催化剂的功能。能。可重复使用，降低成本；可重复使用，降低成本；反应后，
14、酶底物产物易分开反应后，酶底物产物易分开，产物中，产物中无残留酶，无残留酶，易纯化，产品质量易纯化，产品质量高。高。稳定性提高，反复使用多次后，酶的活力无明稳定性提高，反复使用多次后，酶的活力无明显下降；显下降；反应条件易于控制，可以自动控制，节约劳动反应条件易于控制，可以自动控制，节约劳动力。力。固定化酶的制备原则（1 1）必须注意维持酶的构象，特别是活性中心的构象。）必须注意维持酶的构象，特别是活性中心的构象。（2 2）酶与载体必须有一定的结合程度。酶的固定化既不影响酶的原有构象，又）酶与载体必须有一定的结合程度。酶的固定化既不影响酶的原有构象，又能使固定化酶能有效回收贮藏，利于反复使用。
15、能使固定化酶能有效回收贮藏，利于反复使用。（3 3）固定化应有利于自动化、机械化操作。这要求用于固定化的载体必须有一）固定化应有利于自动化、机械化操作。这要求用于固定化的载体必须有一定的机械强度，才能使之在制备过程中不易破坏或受损。定的机械强度，才能使之在制备过程中不易破坏或受损。（4 4）固定化酶应有最小的空间位阻。）固定化酶应有最小的空间位阻。（5 5）固定化酶应有最大的稳定性。在应用过程中，所选载体应不和底物、产物）固定化酶应有最大的稳定性。在应用过程中，所选载体应不和底物、产物或反应液发生化学反应。或反应液发生化学反应。（6 6）固定化酶的成本适中。）固定化酶的成本适中。酶和细胞固定化
16、方法酶和细胞固定化方法酶和细胞固定化方法酶和细胞固定化方法 酶和细胞固定化方法酶和细胞固定化方法酶和细胞固定化方法酶和细胞固定化方法酶和细胞固定化方法酶和细胞固定化方法 载体结合法载体结合法载体结合法载体结合法载体结合法载体结合法 交联法交联法交联法交联法交联法交联法 包埋法包埋法包埋法包埋法包埋法包埋法 网格型网格型网格型网格型网格型网格型 微囊型微囊型微囊型微囊型微囊型微囊型物理吸附法物理吸附法物理吸附法物理吸附法物理吸附法物理吸附法 离子结合法离子结合法离子结合法离子结合法离子结合法离子结合法 共价结合法共价结合法共价结合法共价结合法共价结合法共价结合法 热处理（细胞）热处理（细胞）热处
17、理（细胞）热处理（细胞）热处理（细胞）热处理（细胞）酶和细胞固定化模式酶和细胞固定化模式酶和细胞固定化模式酶和细胞固定化模式结晶法使酶结晶从而实现固定化的方法。载体是酶蛋白本身。对于活性低的酶，可以提高酶浓度和单位体积的活力。局限性：在重复使用中，酶有损耗。（1）吸附法通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法，是固定化中作用而达到固定目的的方法，是固定化中最简单的方法。最简单的方法。吸附法又可分为物理吸附法和离子吸附法。吸附法又可分为物理吸附法和离子吸附法。物理吸附法物理吸附法物理吸附法(physical adsorption)(ph
18、ysical adsorption)是通过非特异性物理吸附作是通过非特异性物理吸附作用将酶直接吸附在水不溶性载体表面上而使酶固定化的方用将酶直接吸附在水不溶性载体表面上而使酶固定化的方法。包括范德华力、疏水相互作用、氢键。法。包括范德华力、疏水相互作用、氢键。物理吸附法常用的载体：物理吸附法常用的载体：有机载体：纤维素、胶原、淀粉及面筋等；有机载体：纤维素、胶原、淀粉及面筋等；无机载体：活性炭、氧化铝、皂土、多孔玻璃、硅胶、二无机载体：活性炭、氧化铝、皂土、多孔玻璃、硅胶、二氧化钛、羟基磷灰石等。氧化钛、羟基磷灰石等。离子吸附法离子吸附法离子吸附法(ion adsorption)(ion ad
19、sorption)是通过离子键使酶与含有离子交是通过离子键使酶与含有离子交换基团的水不溶性载体相结合的固定化方法。换基团的水不溶性载体相结合的固定化方法。阴离子交换剂：阴离子交换剂：DEAE-DEAE-纤维素，纤维素，DEAE-DEAE-葡萄糖凝胶等葡萄糖凝胶等阳离子交换剂：阳离子交换剂：羧甲基纤维素等羧甲基纤维素等此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、-淀粉酶、纤维淀粉酶、纤维素酶等，在工业上用途较广。素酶等，在工业上用途较广。19691969年最早用于工业化生产的固定化氨基酰化酶：使用多年最早用于工业化生产的固定化氨基酰化酶：使用多糖类阴离子交换剂糖类阴离
20、子交换剂DEAE-DEAE-葡萄糖凝胶固定化。葡萄糖凝胶固定化。吸附法的优点：操作简单，条件温和，吸附剂可再生反复使用。吸附法的缺点：酶和载体的吸附力比较弱，容易在不适宜的pH、高盐浓度、高底物浓度或高温条件下解析脱落，易导致催化活力的丧失和污染反应产物等后果。（2）包埋法包埋法（entrapment）是将酶包埋在高聚物的细微凝胶网格中或高分子半透膜内的固定化方法。前者又称为凝胶包埋法，酶被包埋成网格型；后者又称为微胶囊包埋法，酶被包埋成微胶囊型。基本原理：单体和酶溶液混合，再借助引发剂进行聚合反应，将酶固定于载体材料的网格或微囊中。网格型：包埋在高分子凝胶细微网格中。网格型：包埋在高分子凝胶
21、细微网格中。将块状聚合形成的凝胶切成小块，或直接包埋在珠将块状聚合形成的凝胶切成小块，或直接包埋在珠状聚合物中，后者可以使固定化酶机械强度提高状聚合物中，后者可以使固定化酶机械强度提高1010倍，并改进酶的脱落的情况。倍，并改进酶的脱落的情况。常用的材料：常用的材料：聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等合成高分子物聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等合成高分子物质质淀粉、明胶、胶原、海藻酸和角叉胶等天然高分子淀粉、明胶、胶原、海藻酸和角叉胶等天然高分子物质。物质。微囊型：包埋在高分子半透膜中。膜既能形成类似细胞内的环境，又能阻止酶的脱落或直接与微囊外的环境接触；小分子底物能迅速通过膜与酶作用，产物也能
22、扩散出来。制备方法：1 界面沉淀法：利用高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成膜将酶包埋。2 界面聚合法：将亲水性单体和疏水性单体利用界面聚合的原理包埋酶的方法。3 纤维包埋法（二级乳化法）：酶溶液先在高聚物有机相中乳化分散，乳化液再在水相中分散形成次级乳化液，当有机高聚物溶液固化后，每个固体球内包含多滴酶液。包埋法的优点反应条件温和，不需要与酶的氨基酸残基进行反应，不改变酶的结构；酶回收率高；n缺点：包埋时发生化学聚合反应，酶容易失活（微囊型），要要巧妙设计反应条件。由于高分子网格的扩散阻力，会改变固定化酶的动力学行为，降低酶活力。仅适用于小分子底物和产物的酶。（3）交联法交联法（交联
23、法（cross-linkingcross-linking）是使用双功能或多功能试剂使酶分）是使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互交联呈网状结构的固定化方法。子之间相互交联呈网状结构的固定化方法。常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、异氰酸衍生物等。常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、异氰酸衍生物等。戊二醛和酶蛋白中的游离氨基发生戊二醛和酶蛋白中的游离氨基发生SchiffSchiff反应，形成薛夫碱，反应，形成薛夫碱，从而使酶分子之间相互交联形成固定化酶。从而使酶分子之间相互交联形成固定化酶。交联法的特点反应条件比较激烈，固定化的酶回收率比较低，但是降低交联剂的浓度和缩短反应的时间有利于固定化酶比活
24、力的提高。交联剂一般价格昂贵，所得到的固定化酶活力较低，不易成型，一般作为其他固定方法的辅助手段，如与吸附法和包埋法联合使用，起到加固结合的作用。（4）共价键结合法共价键结合法共价键结合法(covalent binding(covalent binding）是将酶与聚合物载体以共价）是将酶与聚合物载体以共价键结合的固定化方法。键结合的固定化方法。常用方法归纳起来有两类：常用方法归纳起来有两类：1 1 将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应；将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应；2 2 在载体上连上一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。在载体上连上一个双功能试剂，然后将酶偶联上
25、去。酶蛋白上可供载体结合的功能基团（1 1）酶蛋白）酶蛋白N N末端的末端的-氨基或赖氨酸残基的氨基或赖氨酸残基的-氨氨基。基。（2 2）酶蛋白）酶蛋白C C末端的末端的-羧基、天门冬氨酸残基的羧基、天门冬氨酸残基的-羧基以及谷氨酸残基的羧基以及谷氨酸残基的-羧基。羧基。（3 3）苯丙氨酸和酪氨酸残基的苯环。）苯丙氨酸和酪氨酸残基的苯环。（4 4）其他：半胱氨酸残基的巯基；丝氨酸、苏氨酸）其他：半胱氨酸残基的巯基；丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的羟基；组氨酸残基的咪唑基；色和酪氨酸残基的羟基；组氨酸残基的咪唑基；色氨酸残基的吲哚基。氨酸残基的吲哚基。参加和载体共价结合的基团必须不是活性中心的基团，
26、也不是维持酶蛋白空间结构必须的基团。共价结合载体的特点1 1 可以在温和条件下与酶蛋白发生偶联反应；可以在温和条件下与酶蛋白发生偶联反应；2 2 具有一定的机械强度和较大的表面积。具有一定的机械强度和较大的表面积。常用的载体有：常用的载体有：天然的高分子物质：纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖、天然的高分子物质：纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖、淀粉及其他衍生物；淀粉及其他衍生物；无机物：陶瓷、玻璃等；无机物：陶瓷、玻璃等；人工合成的高聚物：甲基丙烯酸共聚物、顺丁烯二人工合成的高聚物：甲基丙烯酸共聚物、顺丁烯二酸酐和乙烯的共聚物、氨基酸共聚物及聚苯乙烯酸酐和乙烯的共聚物、氨基酸共聚物及聚苯乙烯等。等。载体活
27、化的主要反应重氮法叠氮法溴化氰法芳香烃化法重氮法重氮法是将酶蛋白与水不溶性载体的重氮基团通过共价键相连接而固定化的方法，是共价键法中使用最多的一种。常用的载体有多糖类的芳族氨基衍生物、氨基酸的共聚体和聚丙烯酰胺衍生物等。具有芳香族的水不溶性载体在稀盐酸和亚硝酸钠中进行反应，成为重氮盐化合物，然后再与酶发生偶合反应，得到固定化酶。酶蛋白中的游离氨基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸中的酚基参与此反应。叠氮法即载体活化生成叠氮化合物，再与酶分子上的相应基团偶即载体活化生成叠氮化合物，再与酶分子上的相应基团偶联成固定化酶。联成固定化酶。含有羟基、羧基、羧甲基等基团的载体都可用此法活化。含有羟基、羧基、羧甲基等
28、基团的载体都可用此法活化。如如CMCCMC、CM-CM-sephadexsephadex（交联葡聚糖）、聚天冬氨酸、（交联葡聚糖）、聚天冬氨酸、乙烯乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物等都可用此法来固定化酶。其顺丁烯二酸酐共聚物等都可用此法来固定化酶。其中使用最多的是羧甲基纤维素叠氮法。中使用最多的是羧甲基纤维素叠氮法。溴化氰法即用溴化氰将含有羟基的载体，如纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，活化生成亚氨基碳酸酯衍生物，然后再与酶分子上的氨基偶联，制成固定化酶。任何具有连位羟基的高聚物都可用溴化氰法来活化。烷基化和芳基化法以卤素为功能团的载体可与酶蛋白分子上的氨基、以卤素为功能团的载体可与酶蛋白分子上的氨基
29、、巯基、酚基等发生烷基化或芳基化反应而使酶固巯基、酚基等发生烷基化或芳基化反应而使酶固定化。定化。此法常用的载体有卤乙酰、三嗪基或卤异丁烯基此法常用的载体有卤乙酰、三嗪基或卤异丁烯基的衍生物。的衍生物。对于无机载体，可用直接法和涂层法（用活化物的聚合物如白蛋白或葡聚糖涂层）。共价结合法的优缺点优点：共价键的键能高，酶和载体之间的结合相当牢固，优点：共价键的键能高，酶和载体之间的结合相当牢固，即使用高浓度底物溶液或盐溶液，也不会使酶分子从载即使用高浓度底物溶液或盐溶液，也不会使酶分子从载体上脱落下来，具有酶稳定性好、可连续使用较长时间体上脱落下来，具有酶稳定性好、可连续使用较长时间的优点。的优点
30、。缺点：载体活化的难度较大，操作复杂，反应条件较剧缺点：载体活化的难度较大，操作复杂，反应条件较剧烈，制备过程中酶直接参与化学反应，易引起酶蛋白空烈，制备过程中酶直接参与化学反应，易引起酶蛋白空间构象变化。间构象变化。二 辅酶和辅基的固定化辅酶固定化原因辅酶固定化原因1 1 1 1）辅酶因子中特殊化学基团参与催化反应；）辅酶因子中特殊化学基团参与催化反应；）辅酶因子中特殊化学基团参与催化反应；）辅酶因子中特殊化学基团参与催化反应；2 2 2 2）辅酶因子流失，且不能再生；）辅酶因子流失，且不能再生；）辅酶因子流失，且不能再生；）辅酶因子流失，且不能再生；3 3 3 3）辅酶因子价格昂贵；）辅酶
31、因子价格昂贵；）辅酶因子价格昂贵；）辅酶因子价格昂贵；工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生。和再生。和再生。和再生。辅酶固定化的方法：1.1.1.1.固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰法，碳固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰法，碳固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰法，碳固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亚胺法以及重氮偶联法等共价偶联，或将其进二亚胺法以及重氮偶联法等共价偶联，或将其进二亚胺法以及重氮偶联法等共价偶联，或将其进二亚胺法以及重氮偶联法等共价偶联，或将其进
32、行适当的化学修饰后固定在超滤器中。行适当的化学修饰后固定在超滤器中。行适当的化学修饰后固定在超滤器中。行适当的化学修饰后固定在超滤器中。2.2.2.2.辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的障碍。障碍。障碍。障碍。需要辅酶的酶反应体系：1 辅酶与酶均不固定化；2 辅酶不固定而酶固定；3 辅酶固定而酶不固定；4 辅酶和酶分别固定；5 辅酶和酶共固定；6 辅酶与酶分子偶联形成辅酶-酶复合物的反应系统（辅酶分子量小，难以截留）（辅酶分子量小，难以截留）反应的扩散阻力大反应的扩散阻
33、力大辅酶固定化的形式：三三 固定化细胞的制备固定化细胞的制备固定化细胞的定义固定化细胞的定义 将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。为细胞固定化技术。固定化细胞就是被限制自由移动的细胞，即固定化细胞就是被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理化学因素的约束或限制在一细胞受到物理化学因素的约束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力。并具有能被反复或连续使用的活力。固定化固定化细胞细胞的特点的特点 有细胞特性，生物催化剂有细胞特性，生物催化剂功能，固功能，固相催化剂相催化剂
34、特点。特点。优点：优点：无须进行酶的分离纯化无须进行酶的分离纯化无须进行酶的分离纯化无须进行酶的分离纯化保持酶的原始状态，保持酶的原始状态，保持酶的原始状态，保持酶的原始状态，酶回收率高酶回收率高酶回收率高酶回收率高比固定化酶稳定性高比固定化酶稳定性高比固定化酶稳定性高比固定化酶稳定性高细胞内酶辅助因子可再生细胞内酶辅助因子可再生细胞内酶辅助因子可再生细胞内酶辅助因子可再生细胞本身含多酶体系细胞本身含多酶体系细胞本身含多酶体系细胞本身含多酶体系抗污染能力强抗污染能力强抗污染能力强抗污染能力强3 固定化细胞生理学特性如上图所示：如上图所示：第一类一般只适用于一种酶催化的反应。第一类一般只适用于一
35、种酶催化的反应。第二类由一种辅酶或少数几种酶催化的反应。第二类由一种辅酶或少数几种酶催化的反应。第三类适用与多酶反应，特别是需要辅酶的反应。第三类适用与多酶反应，特别是需要辅酶的反应。4 4 固定化固定化细胞的制备技术细胞的制备技术理想的固定化细胞的制备方法，应该具有理想的固定化细胞的制备方法，应该具有如下特点如下特点：1.1.1.1.能够控制固定化细胞的大小和孔隙度。能够控制固定化细胞的大小和孔隙度。能够控制固定化细胞的大小和孔隙度。能够控制固定化细胞的大小和孔隙度。2.2.2.2.方法简单、易行，应尽可能少损伤细胞。方法简单、易行，应尽可能少损伤细胞。方法简单、易行，应尽可能少损伤细胞。方
36、法简单、易行，应尽可能少损伤细胞。3.3.3.3.具有良好的机械稳定性和化学稳定性。具有良好的机械稳定性和化学稳定性。具有良好的机械稳定性和化学稳定性。具有良好的机械稳定性和化学稳定性。4.4.4.4.单位体积的固定化细胞应该拥有尽可能多的细单位体积的固定化细胞应该拥有尽可能多的细单位体积的固定化细胞应该拥有尽可能多的细单位体积的固定化细胞应该拥有尽可能多的细胞。胞。胞。胞。载体结合法载体结合法 是将细胞悬液直接与水不溶性的载体是将细胞悬液直接与水不溶性的载体 相结相结合的固定化方法。合的固定化方法。涉及到酶或细胞的化学修饰，可能引起细胞涉及到酶或细胞的化学修饰，可能引起细胞破坏，应尽量在温和
37、的条件下进行反应。破坏，应尽量在温和的条件下进行反应。由于在使用中细胞间、细胞和载体之间的键由于在使用中细胞间、细胞和载体之间的键不容易被破坏，所以操作的稳定性高。不容易被破坏，所以操作的稳定性高。包埋法包埋法 将细胞定位于凝胶网格内的技术。将细胞定位于凝胶网格内的技术。实际使用中限制酶活力的因素较多，且实际使用中限制酶活力的因素较多，且只适合于小分子底物。只适合于小分子底物。适合用于固定活细胞。适合用于固定活细胞。交联法交联法 用多功能试剂对细胞进行交联的固用多功能试剂对细胞进行交联的固 定化定化方法。方法。没有良好的机械强度，不合适实际使用，没有良好的机械强度，不合适实际使用，细胞浓度较高
38、。细胞浓度较高。无载体法无载体法 靠细胞自身的絮凝作用靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细制备固定化细胞胞的的技术。技术。选择性热变性法专用于细胞固定化。是将细胞在适当的温度下处理使细胞膜蛋白变性，但不使酶变性而使酶固定于细胞内的方法。5 固定化活细胞将活细胞限制或定位于特定空间位置的方法。无需进行酶的分离和纯化，减少酶的活力损失，无需进行酶的分离和纯化，减少酶的活力损失，同时大大降低了成本；同时大大降低了成本；保持了酶的原始状态，比固定化酶的稳定性更高，保持了酶的原始状态，比固定化酶的稳定性更高，对污染的抵抗力更强；对污染的抵抗力更强；细胞本身含多酶系统，可催化一系列反应，且不细胞本身含多酶系统
39、，可催化一系列反应，且不需添加辅助因子；需添加辅助因子；细胞生长停滞时间短，细胞多，反应快等。细胞生长停滞时间短，细胞多，反应快等。固定化活细胞的优越性缺点缺点缺点缺点必须保持菌体的完整，需防止菌体的自溶，否则必须保持菌体的完整，需防止菌体的自溶，否则影响产物的纯度；影响产物的纯度；必须抑制细胞内蛋白酶对目的酶的分解；必须抑制细胞内蛋白酶对目的酶的分解；胞内多酶的存在，会形成副产物；胞内多酶的存在，会形成副产物；载体、细胞膜或细胞壁会造成底物渗透与扩散的载体、细胞膜或细胞壁会造成底物渗透与扩散的障碍等。障碍等。制备方法固定化完整细胞的方法很多，但是没有一种理想的固定化完整细胞的方法很多，但是没
40、有一种理想的通用方法；对于特定的应用，必须找到价格低廉、通用方法；对于特定的应用，必须找到价格低廉、简便的方法，高活力保留和操作稳定性是评价固简便的方法，高活力保留和操作稳定性是评价固定化生物催化剂的先决条件。定化生物催化剂的先决条件。四、固定化酶的形状与性质四、固定化酶的形状与性质固定化酶的形状固定化酶的形状固定化酶的形式多样，依不同用途有颗粒状、纤固定化酶的形式多样，依不同用途有颗粒状、纤维状、酶膜和酶管等形状。维状、酶膜和酶管等形状。其中颗粒占绝大多数，它和纤维状主要用于工业其中颗粒占绝大多数，它和纤维状主要用于工业发酵生产，如装成酶柱用于连续生产，或在反应发酵生产，如装成酶柱用于连续生
41、产，或在反应器中进行批式搅拌反应。器中进行批式搅拌反应。固定化酶的性质固定化酶的性质固定化酶的性质固定化酶的性质酶活力酶活力酶活力酶活力的变化的变化的变化的变化固定化酶的活力在多数情况下比天然酶的活力低，其原因固定化酶的活力在多数情况下比天然酶的活力低，其原因可能是：可能是：酶活性中心的重要氨基酸残基被载体结合；酶活性中心的重要氨基酸残基被载体结合；高级结构和空间构象的改变；高级结构和空间构象的改变；空间位阻的影响；空间位阻的影响；内扩散阻力；内扩散阻力；半透膜的隔离。半透膜的隔离。个别情况下，酶经固定化后其活力升高。个别情况下，酶经固定化后其活力升高。酶稳定性的变化酶稳定性的变化酶稳定性的变
42、化酶稳定性的变化操作稳定性：体内半衰期操作稳定性：体内半衰期贮藏稳定性：低温放置贮藏稳定性：低温放置热稳定性：耐热性提高热稳定性：耐热性提高对蛋白酶的稳定性：空间位阻对蛋白酶的稳定性：空间位阻其他：对有机溶剂、其他：对有机溶剂、pHpH、酶抑制剂等的稳定性均有提高。、酶抑制剂等的稳定性均有提高。酶学特性的变化酶学特性的变化底物特异性：对高分子底物的活性明显下降；底物特异性：对高分子底物的活性明显下降；最适最适pHpH：最适：最适pHpH和和pHpH曲线常会发生偏移；曲线常会发生偏移；最适温度：多数较游离酶高；最适温度：多数较游离酶高；动力学常数：动力学常数：KmKm均增大，增大幅度视情况而定；
43、均增大，增大幅度视情况而定；最大反应速度：与游离酶大多数是相同或相近。最大反应速度：与游离酶大多数是相同或相近。五五 评价固定化酶生物催化剂的指标评价固定化酶生物催化剂的指标1 1 1 1 固定化酶固定化酶固定化酶固定化酶(细胞）的活力细胞）的活力细胞）的活力细胞）的活力定义：定义：定义：定义：-固定化酶细胞催化策一特定化学反应的能力，其固定化酶细胞催化策一特定化学反应的能力，其固定化酶细胞催化策一特定化学反应的能力，其固定化酶细胞催化策一特定化学反应的能力，其大小可用在一定条件下它所催化的某一反应的反应的速度大小可用在一定条件下它所催化的某一反应的反应的速度大小可用在一定条件下它所催化的某一
44、反应的反应的速度大小可用在一定条件下它所催化的某一反应的反应的速度来表示。来表示。来表示。来表示。固定化酶（细胞）的单位可定义为每毫克干重固定化酶（细固定化酶（细胞）的单位可定义为每毫克干重固定化酶（细固定化酶（细胞）的单位可定义为每毫克干重固定化酶（细固定化酶（细胞）的单位可定义为每毫克干重固定化酶（细胞）每分钟转化底物（或生产产物）的量。胞）每分钟转化底物（或生产产物）的量。胞）每分钟转化底物（或生产产物）的量。胞）每分钟转化底物（或生产产物）的量。mol.minmol.minmol.minmol.min-1-1-1-1 分批测定法分批测定法分批测定法分批测定法 连续测定法连续测定法连续测
45、定法连续测定法2 2 偶联率及相对活力的测定偶联率及相对活力的测定固定化酶的活力回收是指固定化后固定化酶（细固定化酶的活力回收是指固定化后固定化酶（细固定化酶的活力回收是指固定化后固定化酶（细固定化酶的活力回收是指固定化后固定化酶（细胞）所显示的活力占被固定的等当量游离酶胞）所显示的活力占被固定的等当量游离酶胞）所显示的活力占被固定的等当量游离酶胞）所显示的活力占被固定的等当量游离酶(细胞）细胞）细胞）细胞）总活力的百分数。总活力的百分数。总活力的百分数。总活力的百分数。偶联率偶联率偶联率偶联率1 1时表示反应控制好，固定化酶失活不时表示反应控制好，固定化酶失活不时表示反应控制好，固定化酶失活
46、不时表示反应控制好，固定化酶失活不明显；明显；明显；明显；偶联率时，扩散限制对酶活力有影响；偶联率时，扩散限制对酶活力有影响；偶联率时，扩散限制对酶活力有影响；偶联率时，扩散限制对酶活力有影响；偶联率偶联率偶联率偶联率1 1时有细胞分裂或从载体排除抑制剂等时有细胞分裂或从载体排除抑制剂等时有细胞分裂或从载体排除抑制剂等时有细胞分裂或从载体排除抑制剂等原因原因原因原因。3 固定化酶（细胞）的半衰期操作稳定性是影响固定化酶（细胞操作稳定性是影响固定化酶（细胞)实用实用的关键因素的关键因素半衰期半衰期-在连续测定条件下，固定化酶在连续测定条件下，固定化酶（细胞）的活力下降为最初活力一半所经（细胞）的
47、活力下降为最初活力一半所经历时间，以历时间，以t t1/21/2表示。表示。半衰期是衡量稳定性的指标半衰期是衡量稳定性的指标固定化固定化固定化固定化酶酶酶酶（细细细细胞）活力随胞）活力随胞）活力随胞）活力随时间时间时间时间成指数关系，半衰成指数关系，半衰成指数关系，半衰成指数关系，半衰期期期期：K KD D=-2.303/t=-2.303/tlg(E/E0)E/E0 是是是是时间时间时间时间t t t t后后后后酶酶酶酶活力残留的百分数活力残留的百分数活力残留的百分数活力残留的百分数一 酶反应器各种反应器的示意图各种反应器的示意图各种反应器的示意图各种反应器的示意图酶反应器的类型间歇式搅拌罐反
48、应器间歇式搅拌罐反应器连续流动搅拌罐反应器连续流动搅拌罐反应器填充床反应器填充床反应器流化床反应器流化床反应器连续搅拌罐连续搅拌罐-超滤膜反应器，连续流动搅拌罐反应超滤膜反应器，连续流动搅拌罐反应器器/连续搅拌罐连续搅拌罐循环式反应器循环式反应器这类反应器结构简单，造价较低，传质阻这类反应器结构简单，造价较低，传质阻力很小，反应能迅速达到稳态，主要应用力很小，反应能迅速达到稳态，主要应用在饮料和食品工业中。其缺点是操作麻烦，在饮料和食品工业中。其缺点是操作麻烦，在反复回收过程中固定化酶容易损失，所在反复回收过程中固定化酶容易损失，所以工业规模的固定化酶很少采用。常用于以工业规模的固定化酶很少采
49、用。常用于游离酶。游离酶。间歇式搅拌罐反应器间歇式搅拌罐反应器间歇式搅拌罐反应器这种反应器在运转过程中，底这种反应器在运转过程中，底物以恒定的流速流入反应器，物以恒定的流速流入反应器，与此同时，反应液则以同样的与此同时，反应液则以同样的流速流出反应器。反应桶内装流速流出反应器。反应桶内装有搅拌器，使反应组分与固定有搅拌器，使反应组分与固定化酶颗粒混合均一，出口处有化酶颗粒混合均一，出口处有过滤膜，可使不断补充新鲜底过滤膜，可使不断补充新鲜底物与反应液流量维持动态平衡。物与反应液流量维持动态平衡。连续流动搅拌罐反应器连续流动搅拌罐反应器连续流动搅拌罐反应器 优点：反应液混合良好，各部位的成分相同
50、，并与流优点：反应液混合良好，各部位的成分相同，并与流出液的组成也一致。连续流动搅拌罐反应器的开放结出液的组成也一致。连续流动搅拌罐反应器的开放结构使得调换固定化酶比较容易，而且有利于控制温度构使得调换固定化酶比较容易，而且有利于控制温度和调节和调节pHpH，还能够处理胶态或不溶性底物，受底物抑还能够处理胶态或不溶性底物，受底物抑制的固定化酶采用连续流动搅拌罐反应器有较高的转制的固定化酶采用连续流动搅拌罐反应器有较高的转化率。化率。缺点：由搅拌产生的剪切力较大，易打碎磨损固定化缺点：由搅拌产生的剪切力较大，易打碎磨损固定化酶颗粒。需改良的连续流动搅拌罐反应器。酶颗粒。需改良的连续流动搅拌罐反应