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1、文件名称新型冠状病毒核酸混采样本采集包装运输及检测规范文件编号PLA63750-S0P-005版本/修订号D/0编制人审核人批准人生效日期1范围及目标本文件规定了新型冠状病毒肺炎混采样本的采集、包装运输及检测操作过程。适用于为开展新型冠 状病毒检测进行的混采样本采集、包装、运输等过程以及在二级生物安全实验室佩戴三级防护装备时进 行的样本处理、核酸检测、抗体检测及结果判读等内容，保障实验室检测质量，确保实验室生物安全。2术语与定义下列术语和定义适用于本文件。2. 1新型冠状病毒SARS-CoV-2是引发新型冠状病毒肺炎(Coronavirus Disease 2019, COVID-19)的病原
2、体,按照 病原微生物危害程度分类中的第二类病原微生物进行管理。属于冠状病毒科B属的新型冠状病毒，有 包膜，颗粒呈圆 形或椭圆形，常为多形性，直径60nm140nm。主要通过呼吸道飞沫和密切接触传播, 导致发热、乏力、干咳甚至肺炎等症状。2. 2 实验室生物安全 laboratory biosafety实验室的生物安全条件和状态不低于容许水平，可避免实验室人员、来访人员、社区及环境受到不 可接受的损害，符合相关法规、标准等对实验室生物安全责任的要求。2. 3 风险评估 risk assessment评估新型冠状病毒样本采集、包装、运输及检测过程风险大小以及确定是否可接受的全过程。2. 4 三层包
3、装系统 three-layer packaging system高致病性病原微生物菌(毒)种或者样本包装由内到外分别为主容器、辅助容器和外包装三层包装。 主容器要求无菌、不透水、防泄漏，可以采用玻璃、金属或塑料等材料，应采用可靠的防漏封口。辅助 容器是在主容器之外的结实、防水和防泄漏的第二层容器，作用是包装及保护主容器。外包装是在辅助 容器外面的一层保护层，具有足够的强度。2. 5 气溶胶 airosol悬浮于气体介质中的粒径一般为0.001 um100 um的固态或液态微小粒子形成的相对稳定的 分散体系。2. 6 临床样本 clinical sample通常被定义为来源于人类或动物，包括但不
4、限于血液，唾液，排泄物，身体组织和组织液等。是用 于诊断检查或评估的标本。3.7灭活inactivation灭活是指用物理或化学手段杀死病毒、细菌。2.7实时定量荧光聚合酶链式反应real-time PCR用于新型冠状病毒的核酸检测。是指在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实 时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行总量分析或通过Ct值对模板进行相对定量。 2. 8 空白对照 blank control用样本采集的本底试剂作为一份样本参与实验检测，检测结果为阴性。2. 9 阳性对照 positive control在实验过程中对明确结果为阳性的样本进行检测，检测结果
5、为阳性，该样本为阳性对照。3. 10 阴性对照 negtive control在实验过程中对明确结果为阴性的样本进行检测，检测结果为阴性，该样本为阴性对照。4. 11 准运证 proof of permitted transportation可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种和样本的运输需由运输单位在运输前向卫生健康行政 部门提供运输单位和接收单位的证明材料提出运输申请，在确认运输单位和接收单位都符合条件要求 后，由卫生健康行政部门颁发可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本准运证书。5. 12 生物安全二级实验室 biosafety level 2 laboratory生物安全防
6、护水平为二级的实验室适用于操作能够引起人类或者动物疾病，但通常对人、动物或者 环境不构成严重危害，传播风险有限，实验室感染后很少引起严重疾病，并且具备有效治疗和预防措施 的微生物。按照实验室是否具备机械通风系统，将BSL-2实验室分为普通型BSL-2实验室、加强型 BSL-2实验室。3样本采集前准备5.1 安排一个通风良好的地方，采样点需设立清晰的指引标识。5.2 根据不同的采集对象设置不同的采样区域，将新型冠状病毒肺炎患者、疑似患者或者高度感染可能 性患者、发热患者与其他“愿检尽检”人群分区采样，避免交叉感染。5.3 尽可能保证人员单向流动，落实“1米线”间隔要求，严格控制人员密度。5.4
7、嘱咐被采样人员登记填写新型冠状病毒核酸检测信息登记表、5.5 新型冠状病毒肺炎患者、疑似患者或者高度感染可能性患者还需要详细登记新型冠状病毒感染的 肺炎病例个案调查表4新型冠状病毒肺炎样本采集4.1 样本采集样本采集人员个人防护装备为N95及以上防护口罩、护目镜、连体防护服、双层乳胶手 套、防水靴 套；如接触了患者血液、体液、分泌物或排泄物，应及时更换外层乳胶手套。样本采集对 象：疑似病例、聚集病例、其他需要进行新型冠状病毒感染诊断或鉴别诊断者，或其他 需要进一步筛 查检测的环境或生物材料（如溯源分析）。4. 2样本种类4.2.1 上呼吸道样本：包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物等。下呼吸道样本：
8、包括深咳痰液、呼吸道 抽 取物、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、肺组织活检标本。4.2.2 血液样本：应采集发病后7 d内的急性期抗凝血。采集量5 ml,以空腹血为佳，建议使用含有 EDTA抗凝剂的真空采血管采集血液。4.2.3 血清样本：主要用于抗体的测定，尽量采集急性期、恢复期双份血清。第一份血清应尽早（最 好 在发病后7 d内）采集，第二份血清应在发病后第3 w4 w采集。采集量5 ml,建议使用无抗凝剂 的真空采血管。4.2.4 眼结膜样本：出现眼部感染症状的病例需采集眼结膜拭子标本。4.2.5 便样本：初次检测患者出现腹泻症状时可以采集粪便标本；呼吸道样本初次检测为阴性且流行病 学史或临床
9、表现符合病例标准的患者可加采便标本。4. 3样本采集方法4. 3. 1混合拭子。混合咽拭子的采集：被采集人员头部微仰，嘴张大，发“啊”音，露出两侧咽扁桃体，采集人 员将拭子越过被采集人员舌根，在两侧咽扁桃体稍微用力来回擦拭至少3次，然后在咽后壁上下擦拭至 少3次。操作完毕后，将拭子头置入管中、拭子折断点置于管口处，稍用力折断使拭子头落入采集管的 液体中，弃去折断后的拭子杆，旋紧管盖，将采集管置于稳定的置物架上。每例采集后采集人员均应进 行手消毒。依照上述采集方法依次采集其余9支拭子，将完成采集的拭子放入同一采集管中，动作轻柔,避免气溶胶产生。连续采集10支拭子以后，旋紧管盖，防止溢洒。如采集管
10、内拭子不足10支，应做好 特殊标记并记录。混合鼻拭子的采集。将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓 慢转动退出。取另一根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子以同样的方法采集另一侧鼻孔。上述两根拭子浸入 同一含1川1采样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。依照上述采集方法依次采集其余9支拭子，将完成采 集的拭子放入同一采集管中，动作轻柔，避免气溶胶产生。连续采集10支拭子以后，旋紧管盖，防止 溢洒。如采集管内拭子不足10支，应做好特殊标记并记录。4. 4注意事项4. 4.1有流行病学史和典型临床表现的病例，单次检测结果为阴性，需重复采样，并加采粪便和血液样 本。4.4. 2每个送检样本均
11、需编写唯一的送检编号，在样本管外标注送检编号，在送检单上记录送检编号， 确保送检编号和样本一一对应、可追溯。4. 4. 3 开放读码框 lab （openreading frame lab , ORF lab ）和核壳蛋白（nucleocapsidprotein, N）有基因扩增，但不满足新型冠状病毒肺炎防控方案（第五版）的阳性判定标准时，需重复采样, 并加采粪便和血液样本。5样本的包装和运送1.1 所有新型冠状病毒相关感染性样本的运输应采取A类包装，符合危险品航空安全运输技术细则 的分类包装要求，按照三层包装系统包装。1.2 样本采集后用75%酒精或2000 mg/L含氯制剂消毒擦拭样本管外
12、表面，确保装有感染性样本的样 本管外侧无污染。5. 3逐一核对样本信息及样本数量。5.1 在样本管上标记患者姓名、样本编号和采样日期等信息后，将其放入大小合适的塑料袋内密封，每 袋装一份标本，直立放置在有吸附材料和衬垫材料的辅助容器内，将样本辅助容器直立放置于外包装箱 内，外包装箱内有支撑物固定辅助容器。5.2 填写送检单，写明标本来源的姓名、性别、年龄、采样时间、采样地点、样本类型、样本量、管数 等信息。5.3 样本应由经过培训的人员乘专车运送到检测机构，途中应携带应急处置物品。5.4 运输途中要采用必要的人防技防措施，严防样本被抢、被盗、泄露、遗失和误用。5.5 样本运输严格按照可感染人类
13、的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定要求执 行, 在本市行政区域内的运输应经北京市卫生健康委员会审批并出具可感染人类的高致病性病原微生物 菌（毒）种或样本准运证书后方可进行，未经批准，不得运输。5.6 因运输样本的外包装箱需经过公共区域，故应是经过消毒确保洁净无污染，且送样人员不应着连体 防护服、戴手套运输样本。5.7 新型冠状病毒检测标本送检表由送样人持有，不能放在转运箱内。6样本的交接及辅助容器开启6. 1样本的交接6.1.1 每个样本应有唯一的样本编号，样本编号应可追溯。为满足生物安全的需要，应将送检单复印并 分别交给需要的工作人员。6.1.2 由收样人员将样本运至实验区，佩
14、戴手套、一次性罩衣和一次性医用口罩后，在收样室打开外包 装箱，喷洒消毒后，将标本辅助容器取出，检查有无液体渗漏现象，确保无渗漏后，放置自封袋内，在 自封袋内喷洒75%酒精或2000 mg/L含氯消毒液后，封好自封袋，在自封袋上做好标识，放置于样本 暂 存实验室4冰箱内暂存待检。如发现渗漏应立即用吸水纸覆盖后，喷泗有效氯含量为5000 mg/L的含 氯消毒液进行消毒处理，不得继续检测操作。6.2辅助容器的开启6.2.1 打开生物安全柜，待生物安全柜气流稳定后，在安全柜台面上铺吸水垫单。6.2.2 将样本辅助容器放置于生物安全柜内适当位置。6.2.3 打开辅助容器，使用2000 mg/L含氯消毒液
15、对辅助容器内壁和样本管进行喷泗消毒。6.2.4 取出样本管并检查样本管外壁表面是否有破损、管口泄漏或管壁残留物等，确认无渗漏后，用 2000 mg/L含氯消毒液喷洒、擦拭消毒样本管外表面。如发现渗漏应立即用吸水纸覆盖后，喷洒有效氯 含量为5000 mg/L的含氯消毒液进行消毒处理，不得继续检测操作。6.2.5 将样本管放于样本架上保持直立，核对样本信息。6.2.6 将辅助容器进行内外壁喷泗或擦拭消毒后从安全柜内移出，放置于移动紫外灯下，以备实验结 束 后进一步紫外照射消毒。6. 3注意事项6. 3.1样本辅助容器的开启应在生物安全二级实验室的生物安全柜内进行。6. 3.2样本的消毒、样本信息核
16、对至少需要2名工作人员配合完成。7样本的灭活及分装7.1 基本要求 样本灭活及分装需在生物安全二级或以上级别实验室进行，需要至少2名工作人员进入 实验室核心工作间配合操作。人员防护装备为N95及以上防护口罩、护目镜、连体防护服、双层乳胶 手套、防水靴套。7.2 样本热灭活从消毒后的辅助容器中取出装在封口袋里的样本管，检查样本管和封口袋的密闭性， 密闭性良好无 泄漏，用2000 mg/L含氯消毒液进行外表面擦拭消毒，再进行56以上，30 min以上 灭 活。7. 3样本分装7. 3.1样本的分装操作需在生物安全二级或以上级别实验室生物安全柜内进行。7. 3.2准备分装使用的冻存管。所有标本应放在
17、大小适合的（2 ml）带螺旋盖、内有垫圈、耐冷冻的样 本采集管里，拧紧。容器外注明必要信息。7. 3.3咽拭子、消化后痰液、呼吸道灌洗液、粪便等样本每份原始样本建议分装体积每支1 mlo7. 3.4全血、血清样本每份原始样本建议分装体积每支800 ulo7. 3.5样本分装后，盖紧管盖，用2000 mg/L含氯消毒液进行外表面擦拭消毒。7. 4注意事项7. 4.1样本管外的封口袋应完全彻底消毒才可灭活。7. 4. 2分装后的样本管要进行擦拭消毒再进行暂存或保存。8样本检测8. 1基因检测8.1.1 核酸提取灭活后样本的核酸提取需在生物安全二级实验室进行，需要至少2名工作人员进入实 验室配合操作
18、。人员防护装备为N95及以上防护口罩、护目镜、连体防护服、双层乳胶手套、防水靴套。 按照商品化试 剂盒说明书进行手工或仪器提取核酸。a）核酸提取过程需设空白对照，不可使用扩增试剂盒中的阴性对照替代空白对照。b）加样及加试剂均需在生物安全柜中进行，动作要轻柔，避免形成气溶胶。c）核酸提取与基因扩增需在两个独立的实验间完成。8.1.2 试剂准备 核酸扩增体系的配置在洁净的试剂配制区进行，模板的加入需在单独的区域或独立的 操作台进行，产物扩增区为独立区域。工作人员防护装备为：实验服、一次性医用口罩、帽子、乳胶 手套。8. 1.3 PCR检测 采用实时定量荧光聚合酶链式反应（Real-timePCR）
19、法检测ORFlab和N基因。检测过 程中需设立空白对照（参加核酸提取）、阴性对照和阳性对照，呼吸道标本建议加做核糖核蛋白（RNP） 基因内参。a）体系配制、加模板及扩增要分区进行，避免加样器及耗材混用形成交叉污染。b）加模板时应轻柔操作，避免反复吹吸产生气溶胶形成交叉污染。c）加模板后如果用96孔板进行PCR扩增，确保封口膜封闭严密，避免样本交叉污染。d） PCR扩增结束后不得打开扩增管，避免产物气溶胶污染实验室环境。8. 2抗体检测8.2.1 灭活后样本的操作在生物安全二级实验室进行。人员防护装备为N95及以上防护口罩、护目镜、 连体防护服、双层乳胶手套、防水靴套。8.2.2 采用免疫层析法
20、、化学发光免疫法或其他血清学检测技术检测血液、血清或血浆中SARS-Cov-2的 IgM IgG抗体和/或总抗体。8.2.3 严格按照要求做好质控，严格按照要求进行结果判读。8. 3实验室具体检测流程参考：新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测标准操作规程9样本保存9. 1用于核酸检测的标本应尽快进行检测，能在24 h内检测的标本可置于4保存；24 h内无法检 测 的标本则应置于-70或以下保存（或-20冰箱暂存）。9.2 血清可在4存放3 d, -20C以下可长期保存。9.3 新型冠状病毒检测阳性样本需设立专库或专柜保存，应置于-70或以下保存，严格实施“双人双 锁”管理，确保样本来源、使用
21、、销毁等步骤记录明确、可追溯。（注：目前实验室不保存阳性样本， 阳性样本阳性送长沙市疾控确认，具体阳性处理流程参考：（2019-nCoV）核酸检测生物安全要求及应 急预案）10生物安全柜内清场及感染性废物处理10.1 废弃的样本管、吸头等感染性物品置于加有消毒液的废物收集容器及利器盒中。10.2 实验人员每一次生物安全柜内操作后需要进行柜外操作时，需对手套和手臂部位进行消毒（可使 用75%酒精或者84消毒液喷洒消毒）或换戴外层手套进行下一步操作。10.3 生物安全柜内操作结束后，将废物收集容器加盖，但不严密封死，消毒容器外表面后，移出生物安 全柜后装入双层医疗废物收集袋中扎口，同时将与样本操作
22、相关的医疗废物置于实验室内的高压灭菌 器中进行121, 30 min的高压灭菌，每次高压需要放置化学指示卡进行高压效果监测，在高压结束 后将化学指示卡贴在使用记录本上并记录高压灭菌器的使用过程。每月进行一次高压灭菌效果的生物 监测。10.4 用75%酒精或2000 mg/L含氯消毒液擦拭消毒生物安全柜台面及侧壁，在有连续新型冠状病毒样 本核酸提取实验时，建议两次实验间隔期不关闭生物安全柜。10.5 75%酒精或2000 mg/L含氯消毒液擦拭或喷洒消毒实验室台面及仪器外表面。10.6 打开移动紫外灯，对生物安全柜及实验操作相关区域进行30 min照射消毒。10.7 在缓冲区按顺序脱去防护装备，
23、将防护装备置于医疗废物收集袋中（不超过包装容积的3/4）进行 包装，消毒外表面后准备高压灭菌。10.8 打开移动紫外灯对缓冲间进行30 min照射消毒。10.9 用于新型冠状病毒核酸提取的实验室，根据生物危害风险评估结果定期对实验室进行终末消毒， 以消除潜在的污染风险。11安全防护11.1 未经培养的感染性材料的操作：未经培养的感染性材料、样本、病毒核酸等，在采用可靠的方法 灭活（56以上恒温灭活30分钟以上）后，在生物安全二级实验室进行。11.2 新型冠状病毒的分离、培养、滴定、中和试验、活病毒及其蛋白纯化、病毒冻干以及产生活病毒的 重组实验等操作应当在生物安全三级实验室内进行。（目前实验室
24、未涉及）11.3 从事新型冠状病毒检测标本采集和核酸检测人员防护装备：N95及以上防护口罩、护目镜、连体 防 护服、双层乳胶手套、防水靴套；如接触了患者血液、体液、分泌物或排泄物，应及时更换外层乳胶 手 套。12参考文件12.1 医疗废物管理条例12.2 病原微生物实验室生物安全管理条例12.3 医疗机构临床基因扩增管理办法12.4 新型冠状病毒肺炎防控方案（第八版）12.5 新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（第八版）12.6 新型冠状病毒实验室生物安全指南12.7 新型冠状病毒肺炎样本采集包装运输及检测规范T/BPMA 0004202013相关文件13.1 （2019-nCoV）核酸检测生物安全要求及应急预案13.2 新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测标准操作规程14相关记录表格14. 1新型冠状病毒感染的肺炎病例个案调查表14.2新型冠状病毒核酸检测信息登记表文件修订记录:序号修订前修订后修订人修订日期