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1、南京军区医学科技创新经费资助重点项目南京军区医学科技创新经费资助重点项目(11Z012)青蒿琥酯联合骨髓间充质干细胞青蒿琥酯联合骨髓间充质干细胞青蒿琥酯联合骨髓间充质干细胞青蒿琥酯联合骨髓间充质干细胞移植对纤维化的治疗作用究移植对纤维化的治疗作用究移植对纤维化的治疗作用究移植对纤维化的治疗作用究移植对移植对肝肝纤维化的治疗作用纤维化的治疗作用研研究移植对究移植对肝肝纤维化的治疗作用纤维化的治疗作用研研究究解放军第解放军第解放军第解放军第123123医院医院丁体龙丁体龙医院医院丁体龙丁体龙研究背景研究背景研究背景研究背景肝纤维化治疗1原发病的病因治疗(抗病毒抗血吸虫1.原发病的病因治疗(抗病毒、
2、抗血吸虫、戒酒等)2.针对肝星状细胞的治疗(抑制HSC增殖：干扰素、S-腺苷蛋氨酸等；促进HSC凋干扰素腺苷蛋氨酸等；促进凋亡：胶霉毒素、姜黄素等)降解胶原消炎保肝等综合治疗3.降解胶原、消炎、保肝等综合治疗4.肝移植(最有效，但供体缺乏、创伤大、移植排斥、价格昂贵、远期存活率低)植排斥、价格昂贵、远期存活率低)5.细胞移植(来源广泛、创伤小、可重复、费用相对较低)用相对较低)?骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是最具有潜力的供体细胞，具cells,MSC)是最具有潜力的供体细胞，具有多向分化潜能，已被证实具有抗纤维化的作用的作用。?体外研究证实，MSC可
3、分化为肝干细胞，具有肝细胞的特征(合成糖原、分泌白蛋白等)等)?另有研究得到否定的结论未能找到MSC?另有研究得到否定的结论：未能找到MSC分化为肝细胞的证据，甚至发现其向成纤维细胞转化促进了肝纤维化的发生发展维细胞转化，促进了肝纤维化的发生发展。?决定MSC分化方向的最重要因素-肝脏干细胞生存微环境细胞生存微环境(niche)。?干细胞niche的组成：肝内基质细胞(肝星状干细胞的组成肝内基质细胞(肝星状细胞、Kupffer细胞、肝窦内皮细胞)、基质细胞分泌的可溶性因子(生长因子、趋化因细胞分泌的可溶性因子(生长因子、趋化因子、炎症因子等)、胞外基质(纤维连接蛋白、胶原、层粘连蛋白、蛋白多糖
4、等)及神经系胶原、层粘连蛋白、蛋白多糖等)及神经系统。青蒿琥酯是我国学者从黄花蒿中提取的一青蒿琥酯是我国学者从黄花蒿中提取的种含内过氧化物基团的倍半萜内酯化合物，具有抗疟免疫抑制抗病毒及抗肿瘤等具有抗疟、免疫抑制、抗病毒及抗肿瘤等多方面的药理作用，其抗纤维化作用是近年来才被发现的另一重大药理作用，且无明显的不良反应。明显的不良反应。促进HSC向肝改善肝脏微环境促进HSC向肝细胞转化增强青蒿琥酯抗?青蒿琥酯改善肝脏功能增强青蒿琥酯抗肝纤维化效果?1.1.材料与方法材料与方法材料与方法材料与方法1.1.材料与方法材料与方法材料与方法材料与方法材料与方法材料与方法材料与方法材料与方法?材料：实验动物
5、：SD大鼠120只，雌雄不限，2月龄，体质量（20020）g,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司机构许可证号验动物有限责任公司，机构许可证号：SCXK(沪)：2003-0003，实验室常规饲养，光照和暗适应各12h/d一周以后用于实验和暗适应各12h/d，周以后用于实验；MASSON三色染色试剂盒：上海杰美基因医药科技有限公司；TGF-1和TNF-ELISA试剂盒：科技有限公司；TGF 1和TNF ELISA试剂盒：武汉博士德生物科技有限公司产品；RNAiso Plus抽提试剂及DL2000 DNA Marker为TaKaRa公司产品，PCR 逆转录试剂为AMV公司产品，PCR引物由上海生工生
6、物工程公司合成。SDSD 大鼠肝脏纤维化模型的构建大鼠肝脏纤维化模型的构建大鼠肝脏纤维化模型的构建大鼠肝脏纤维化模型的构建SD SD 大鼠肝脏纤维化模型的构建大鼠肝脏纤维化模型的构建大鼠肝脏纤维化模型的构建大鼠肝脏纤维化模型的构建?SD大鼠120只，随机抽取10只处死后作骨髓间充质干细胞培养，另取20只作为正常对照组，其余90只参照文献的方法制作大鼠肝纤维化模型首90只参照文献的方法制作大鼠肝纤维化模型。首次将CCl4按5ml/Kg剂量皮下注射，以后在临用前将CCl4与橄榄油配成40%的CCl4 橄榄油油性前将CCl4与橄榄油配成40%的CCl4-橄榄油油性溶剂，按3ml/Kg剂量皮下注射，第
7、周2次，共10周。10周后随机抽取10只，肉眼见肝脏明显肿胀、周。10周后随机抽取10只，肉眼见肝脏明显肿胀、变性，其中多为脂肪变性，部分呈气球样变，有的胞浆呈空泡状。病理检测见正常肝小叶结构消的胞浆状病检测见常肝小叶结构消失，汇管区和中央静脉周围有纤维瘢痕形成，提示肝纤维化模型制作成功。SDSD大鼠骨髓间充质干细胞的分离培大鼠骨髓间充质干细胞的分离培大鼠骨髓间充质干细胞的分离培大鼠骨髓间充质干细胞的分离培SDSD大鼠骨髓间充质干细胞的分离培大鼠骨髓间充质干细胞的分离培大鼠骨髓间充质干细胞的分离培大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养以及鉴定：养以及鉴定：养以及鉴定：养以及鉴定：?采用密度梯度离心结合
8、贴壁生长的方法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞。用流式细离培养大鼠骨髓间充质干细胞。用流式细胞仪检测细胞表面标志CD34、CD45、CD44CD90以确定细胞种类和纯度CD44、CD90，以确定细胞种类和纯度。治疗方法与分组治疗方法与分组治疗方法与分组治疗方法与分组治疗方法与分组治疗方法与分组：治疗方法与分组治疗方法与分组：?将造模成功的80只大鼠随机分成模型组、Art治疗组、BMSCs移植组和联合治疗组，每组20只A t治疗方法和细胞移植方法分别参照文献只。Art治疗方法和细胞移植方法分别参照文献2-3执行。各组具体治疗方案如下：正常对照组及模型组腹腔注射生理盐水1ml/kg/dArt治及模型组
9、：腹腔注射生理盐水1ml/kg/d，。Art治疗组：腹腔注射Art 100mg/kg/d。BMSCs移植组：BMSCs以2 0106/ml的浓度从尾静脉回输组：BMSCs以2.0106/ml的浓度从尾静脉回输给模型鼠，每只2ml。联合治疗组：按BMSCs移植组方法行BMSCs,次日按Art组方法腹腔注射,Art。以上各组均于首次治疗后第42天处死，留取血清及肝组织备检。标本采集方法标本采集方法标本采集方法标本采集方法标本采集方法标本采集方法标本采集方法标本采集方法?分别给大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.35ml/100g麻醉，开腹，取心脏血作肝功0.35ml/100g麻醉，开腹，取心脏血作肝功能
10、、肝纤维化指标和转化生长因子1(TGF 1)和肿瘤坏死因子(TNF)检1(TGF-1)和肿瘤坏死因子(TNF)检测，同时取肝组织福尔马林固定12h以上石蜡包埋连续4切片作HE染色上，石蜡包埋，连续4m切片，作HE染色和MASSON胶原纤维染色。RTRT-PCRPCR检测肝组织检测肝组织检测肝组织检测肝组织-SMAmRNASMAmRNA、RTRT PCRPCR检测肝组织检测肝组织检测肝组织检测肝组织 SMAmRNASMAmRNA、TGFTGF-1 mRNA1 mRNA的表达的表达的表达的表达肝组织总RNA按试剂盒说明书操作以总RNA1为模?肝组织总RNA按试剂盒说明书操作。，以总RNA1g为模板
11、，用oligo(dT)作为引物。TGF-1(547bp)引物系列：上游5-GCG GTG CTC GCT TTG T-3,下游5-GGA AGG 游,下游GTC GGT TCA T-3;-SMA(542bp)引物系列：上游5-CTG TCC CTC TAT GCC TGT GG-3,下游5-AGG GCT GTG ATC TCC TTC TG 3;actin(300bp)上游5 AGCGTG ATC TCC TTC TG-3;-actin(300bp)：上游5-AGC TGA GAG GGA AAT CGT GCG-3,下游5-GTG CCA CCA GAC AGC ACT GTG-3。RT-
12、PCR反应在50作用15min，95作用2min，然后进行PCR扩增，反应条件为：9430s，5530s，7230s，PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳凝胶成像分析系统测定其灰度值以目的条糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统测定其灰度值，以目的条带与-actin条带灰度值之比作为半定量标准，实验结果采用Quantity one 5.3.2软件进行分析。2 2 结果结果结果结果2 2 结果结果结果结果大鼠大鼠大鼠大鼠BMSCsBMSCs的分离培养过程中形态的分离培养过程中形态的分离培养过程中形态的分离培养过程中形态大鼠大鼠大鼠大鼠BMSCsBMSCs的分离培养过程中形态的分离培养过程中形态的分离培养过
13、程中形态的分离培养过程中形态学观察、鉴定学观察、鉴定学观察、鉴定学观察、鉴定?新分离的大鼠骨髓间充质干细胞呈圆形，数量较多，悬浮于培养液中，培养4小时后，部分细胞开始贴壁48小时后完全贴壁除去少量未贴壁开始贴壁，48小时后完全贴壁，除去少量未贴壁的造血干细胞和血细胞。继续培养，贴壁细胞逐渐伸展伸出伪足细胞由圆形逐渐变化为梭形渐伸展，伸出伪足，细胞由圆形逐渐变化为梭形、多角形或多个突起的不规则形。8天后开始传代培养。通过流式细胞仪检测细胞表面分子，大鼠培养。通过流式细胞仪检测细胞表面分子，大鼠BMSCs表面分子CD44、CD90阳性表达率分别为99.99%，100%，而CD34、CD45阳性率分
14、别为1.12%，0.05%，证实培养的细胞为骨髓间充质干细胞。各组大鼠肝脏病理变化各组大鼠肝脏病理变化各组大鼠肝脏病理变化各组大鼠肝脏病理变化各组大鼠肝脏病理变化各组大鼠肝脏病理变化各组大鼠肝脏病理变化各组大鼠肝脏病理变化：?正常组大鼠肝小叶结构完整清晰，肝细胞呈多边形索状分布，肝板间有不规则肝窦(图1a)。模型组肝小叶增生明显，肝细胞索排列紊乱，桥形坏死区成条形或索状排列，胶原纤维构成的纤维间隔破坏界板，分割包绕肝小叶，部分形成假小叶(图1b)。Art治疗组及BMSCs移植组胶原纤维较模型组明显减轻，仍有胶原纤维增生分割包绕肝小叶，但未见明显的假小叶形成(图1c、图1d)。联合治疗组肝小叶结
15、构接近正常，仅呈轻度灶性增生或肝窦内增生(图1e)。bdabcde图1 各组大鼠肝组织学病理观察(Masson staining100)图1 各组大鼠肝组织学病理观察(Masson staining100)a.正常对照组；b.模型组；c.Art治疗组；d.BMSCs移植组；e.联合治疗组正常对照组；模型组；治疗组；移植组；联合治疗组各组肝功能指标检测结果各组肝功能指标检测结果各组肝功能指标检测结果各组肝功能指标检测结果各组肝功能指标检测结果各组肝功能指标检测结果各组肝功能指标检测结果各组肝功能指标检测结果组别组别nALB(g/L)ALT(U/L)AST(U/L)DBIL（mmol/L)正常对照
16、组2032.913.04 37.413.68 91.006.64 361.2451.34 模型对照组2020.142.86 120.5211.61 143.919.20 1635.23164.26 985 64162 27*Art治疗组2024.353.12*82.5319.24*138.539.25*985.64162.27BMSCs移植组2026.312.42*75.3615.28*142.6411.83*894.62256.41*联合治疗组2029.133.48*66.4714.63*135.3212.54*679.1594.63*注：*P0.05 vs正常对照组；p0.05 vs模型对
17、照组；p0.05 vs联合治疗组各组血清肝纤维化指标检测结果各组血清肝纤维化指标检测结果各组血清肝纤维化指标检测结果各组血清肝纤维化指标检测结果（+s,ug/Ls,ug/L）x组别组别nHAPIIIPIV-CLN正常对照组2091.249.76 18.242.51 15.942.34 83.2611.54 模型对照组20312.4322.45 75.223.14 57.363.51 269.1725.42 Art治疗组20152.3110.15*54 374 26*43 122 68*192.5724.36*Art治疗组2054.374.26*43.122.68*BMSCs移植组20178.2
18、418.56*45.293.76*38.343.57*187.6619.43*联合治疗组20125.1915.42*36.185.57*31.263.25*142.6314.35*注*P0 05 vs正常对照组p0 05 vs模型对照组p0 05 vs联合治疗组注：*P0.05 vs正常对照组；p0.05 vs模型对照组；p0.05 vs联合治疗组各组血清各组血清各组血清各组血清TGFTGF-11、TNFTNF-含量比较含量比较含量比较含量比较各组血清各组血清各组血清各组血清TGFTGF 11、TNFTNF 含量比较含量比较含量比较含量比较(+s s，ng/L,n=20)ng/L,n=20)x
19、项目对照组模型组Art治疗组BMSC移植组联合治疗组TGF-1 10.684.23 41.268.46 27.816.48*24.368.52*19.265.63*TNF-79.6312.55 142.4323.34 95.2614.36*93.1512.53*85.3215.67*注：*P0 05 vs正常对照组；p0 05 vs模型对照组；p0 05 vs联合治疗组注：P0.05 vs正常对照组；p0.05 vs模型对照组；p0.05 vs联合治疗组各组大鼠肝组织各组大鼠肝组织-SMAmRNASMAmRNA、各组大鼠肝组织各组大鼠肝组织 SMAmRNASMAmRNA、TGFTGF-1mRN
20、A1mRNA表达的变化。表达的变化。M：DNA marker 1：正常对照组：正常对照组2：模型组：模型组3：Art治疗组治疗组4：BMSCs移植移植组组5：联合治疗联合治疗组组移植移植联合治疗联合治疗各组各组各组各组-SMAmRNASMAmRNA、TGFTGF-各组各组各组各组 SMAmRNASMAmRNA、TGFTGF1mRNA1mRNA表达情况比较表达情况比较表达情况比较表达情况比较(+s,n=20)s,n=20)x项目各组条带灰度值占-actin灰度值百分比(%)项目对照组模型组Art治疗组BMSC移植组联合治疗组TGF-1 10.684.23 41.268.46 27.816.48*
21、24.368.52*19.265.63*TNF79 6312 55142 4323 3495 2614 36*93 1512 53*85 3215 67*TNF-79.6312.55 142.4323.34 95.2614.36*93.1512.53*85.3215.67*注*P0 05正常对照组 0 05模型对照组 0 05联合治疗组注：*P0.05 vs正常对照组；p0.05 vs模型对照组；p0.05 vs联合治疗组结结结结 论论论论结结结结 论论论论?青蒿琥酯与骨髓间充质干细胞联合使用有助于改善实验性肝纤维化大鼠的肝脏功能。助于改善实验性肝纤维化大鼠的肝脏功能。?青蒿琥酯与骨髓间充质干细胞联合使用有助于改善实验性肝纤维化大鼠的血清肝纤助于改善实验性肝纤维化大鼠的血清肝纤维化指标。?青蒿琥酯与骨髓间充质干细胞联合使用有助于降低实验性肝纤维化大鼠的血清TGF-助于降低实验性肝纤维化大鼠的血清TGF-1、TNF-含量。?青蒿琥酯与骨髓间充质干细胞联合使用有助于降低实验性肝纤维化大鼠肝组织中-助于降低实验性肝纤维化大鼠肝组织中SMAmRNA、TGF-1mRNA表达。青蒿琥酯联合BMSC 移植治疗肝纤维化有?青蒿琥酯联合BMSCs移植治疗肝纤维化有确切的疗效。二者联合治疗能起到较好的协同作用。