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1、第 4 3卷第 2期 2 0 1 4年 4月 湖 北 林 业 科 技 Hu b e i F o r e s t r y S c i e n c e a n d Te c h n o l o g y Vbl _ 4 3。NO 2 A_Pr。2 01 4 杜鹃花表达序列标签资源中的微卫星信息分析 王书珍 张传进程华 方元 平 项 俊郑永 良金卫斌(经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室；黄冈师范学院化学与生命科学学院黄冈4 3 8 0 0 0)摘要：从 NC B I 数据库下载杜鹃花表达序列标签序列 1 3 2 3 条，去冗余后得到 9 1 2条 E S T。采用 Ta n d e m r
2、 e p e a t f i n d e r 软件分析，最终在 6 l条 E S T序列中找到 6 5个 S S R位点，出现频率为 7 1 2 7 2。二碱基重复是杜鹃花 E S T内S S R的主 要重复类型，占6 6 1 5 3 8 ；单碱 基和 三碱 基重复次之，分别 占据 1 5 3 8 4 6 和 9 2 3 0 8 。四碱 基、五碱 基、六碱基 类型 的 S S R相对比较少。多达 9 0 7 6 9 2 的 S S R位点为完美型微卫星重复。这些富含 S S R位点的 E S T序列将为开发微卫星特 异性引物，并用于杜鹃花群体生物多样性和遗传结构分析提供理论依据。关键词：杜鹃花
3、；微卫星；表达序列标签；遗传多样性 中图分类号：Q7 8 6，$6 8 5 2 1 文献标识码：A 文章编号：1 0 0 4 3 0 2 0(2 0 1 4)0 20 0 0 7 0 4 Ana l ys i s o f Si mpl e S e qu e n c e Re p e at s I n f o r mat i o n i n Ex p r e s s e d S e q ue n c e Ta g Re s o u r c e s o f Rho do de n dr on s i ms i i Wa n g S h u z h e n Z h a n g C h u a n j
4、 i n Ch e n g Hu a F a n g Yu a n p i n g Xi a n g J u n Zh e n g Yo n g l i a n g J i n We i b i n (Hu b e i Ke y La b o r a t o r y o f E c o n o mi c F o r e s t Ge r mp l a s m I mp r o v e me n t a n d Re s o u r c e s Co mp r e h e n s i v e Ut i l i z a t i o n，Co l l e g e o f Ch e mi s t r
5、y a n d Li f e S c i e n c e，Hu a n g g a n g No r ma l Un i v e r s i t y Hu a n g g a n g 4 3 8 0 0 0)Ab s t r a c t：A t o t a l o f l 3 2 3 Rh o d o d e n d r o n s i ms i i E d o wn l o a d e d f r o m t h e NaB l d a t a b a s e we r e a n a l y z e d，f r o m wh i e h 9 1 2 n o n-r ed u n d an
6、t Es 1 we r eo b t a i n ed S i x t y-fiv eES T-S S Rs d i s t il b u t ed i n 6 1 E S T s we r ef o u n d b yt h eT an d e m r e p e a tf i n d e r s o f t wa r e t h a f r e q u e n c y o f 7 1 2 7 2 Es p e c i a l l y，d i n u c l e o t i d e r e p e a t Was t h e ma i n t y p e i n Rs i ms i i，a
7、c c o un t i n g f o r 6 6 1 5 3 8 of a l l S S 1 1 e mo n o n u c l e o t i d e an d t r i n u c leo t i d e r e p e a t s t o o k u p t 0 1 5 3 8 4 6 an d 9 2 3 0 8 ，r e s p e c t i v e l y B y c o n t r a c t，t he r e s t t y p e s i n c l u d i n g t e t r a n u c l e o t i d e。p e n t anu c l o
8、 o t i d e and h e x anu c l e o t i d e r e pe a t s we r e t h e l e ast T o t a ll y，9 0 7 6 9 2 of t h e s e S S R l o c i we r e perfe c t r e p e a t s Th ese ES T s e q u e n c e s c o n t ain i n g S S R l o c i wo u l d f a c i l i t a t e t h e f u r t h e r d e v e l o p me n t of s p e c
9、 i fi c S S R ma r k e r s，as we ll as t he s t u d y o f b i o d i v e r s i t y and g e n e t i c s t r u c t u r e of Rs i ms i Ke y wo r d s：Rh o d o d e n d r o n s i ms i i；mi c r o s a t e l l i t e；e x p r e s s e d s e q u e n c e t a g；g e n e t i c d i v e r s i t y 杜 鹃花 R 0 0 P r D s i m
10、s i i是 杜 鹃 花 科 Er i c a c e a e 杜 鹃花属 Rh o d o d e n d r o n常绿或者落叶 灌木，既是世界 四大名花之一，也是 中国十大传统 名花之一 1 。全世界野生杜鹃花有上千种，从热带 到极地都有分布，中国约含有 6 0 0多种。在 中国，除了新疆和宁夏外，其他各省份均有野生杜鹃花的 分布 2 。杜鹃花被广泛用于园林绿化和盆栽观赏，在森林生态系统 中对水土保持及生态系统 的稳定 意义重大。部分杜鹃花富含优质蛋白、膳食纤维和 水溶性维生素，因此可以药食兼用 在止咳平喘，内 伤和风湿、心血管系统疾病、神经系统疾病治疗，以 及抗炎镇痛等方面具有极高的药
11、用价值】。杜 鹃花花色鲜艳、外形美观，像江西井冈山、湖北龟峰 山等地 区都对杜 鹃花进行 了文化旅游开发。自然环境的变化、人类活动 的干扰，以及人类 对杜鹃花资源的认识不足和盲 目利用，已经严重破 收稿 日期：2 O 1 4 一O 4 1 O 基金项 目：经济林木种质改 良与资源综合 利用湖北 省重点 实验室开 放基金 项 目“麻 城龟峰 山杜 鹃群 落结构组 成及空 间分布格局 分 析”(2 0 1 3 0 0 0 4 0 3)。作者简介：王书珍，(1 9 8 4)，女，博士，主要 从事植 物遗传 学研究工作。金卫斌为通讯作者。8 湖北林业科技 第 4 3卷 坏了杜鹃花生境 的生态系统，导致
12、野生杜鹃花分布 区域缩小。生存力低下、分布区域狭窄的杜鹃花种 已经面临着严重的生存威胁，目前对杜鹃花种群的 保护 比较薄弱l_ 2 。遗传多样性是生物多样性 最基 本的组成部分，也是物种适应环境和进化的物质基 础，更是保护生物学研究 的核心 目标。因此，深入 研究杜鹃花种群的遗传多样性和遗传结构是保护 杜鹃花资源生物多样性 的前提，也是进一步开发利 用杜鹃花的基础。对 杜鹃花遗传多样性 的研究则 需要分子标记的开发l_ 5 。简单重复序列又叫微卫星，是一类 由 1 6个 碱基重复基序组成的串联重复 D NA标记_ 6 。S S R 标记在基因组中广泛分布，数量众多、变异性强、共 显性遗传，因而
13、被 广泛 用于植物 的遗传 多样性分 析、遗传连锁 图谱构建、起源进化、系统发育、基 因 定位和克隆等研究中 7-1 1 。采用 S S R标记对杜鹃 花的种质资源进行遗传多样性研究是保护和进 一 步开发利用杜鹃花的前提。目前杜 鹃花 中可利用 的 S S R标记 比较少，限制 了 S S R标记在杜鹃花生 物多样性 保 护和遗 传改 良中的应 用。本研 究 对 NC B I 数据库现有的 E S T序列 进行分析，旨在 开 发杜鹃花 E S TS S R标记，为探讨其在分子遗 传 学研究中的应用奠定基础。1 材料与方法 1 1 杜鹃花 E S T序列的来源及预处理 从 NC B I数 据 库
14、(h t t p：wwwn c b i n l m n i h g o v )下载杜鹃花 ES T序列，并保存 为 F a s t a 格式。采用 C D-HI T E S T(h t t p：we i z h o n g l a b u c s d e d u me t a g e n o mi c a n a 1 y s i s s e r v e r c d h i t e s t 去除冗余 的 E S T。采用 在线软 件 E S T-t r i m me t(h t t p：p g r c i p k-g a t e r s l e b e n d e mi s a d o wn l
15、 o a d e s t t r i mme r p 1)去除 E S T序列 5 端 和 3 端 5 O b p内重复次数达 5次以上 的 p o l y A或 者 p o l y T。1 2 杜鹃花 E S T _ S S R筛选 用 Ta n d e m r e p e a t f i n d e r(h t t p：t a n d e m b u e d u t r f t r f h t m1)在线软件分 析 E S T序 列 内 的 S S R位点，筛选标准为 1 6碱基重复单元。依 据在苦瓜、莲、慈姑、茭白L 等物种中开发 S S R引物的经验，本文在分析杜鹃花 E S T_ S
16、 S R时 设定的标准为：单碱基重复大于 2 0次，二碱基重复 大于 1 0 次，三碱基重复大于 7次，四碱基 以上的重 复单元其重复次数大 于 5。根据 S S R出现的频率 对 S S R位点进行分类和描述。s s R出现频率一 2 结果与分析 2 1 杜鹃花 ES T S S R的 出现频率 NC B I 数据 库 内登 录 的杜 鹃花 E S T 序 列共 1 3 2 3 条，无冗 余 ES T 序列 9 1 2条。Ta n d e m r e p e a t f i n d e r软件分析，在 6 1 条非冗余 E S T内检测 到 6 5个 S S R位点，出现频率为 7 1 2
17、7 2 9 6。检 测 到的 E S T-S S R包含了 1 6 碱基单元类型，不 同重 复单元出现的频率与碱基数有明显 的关系见表 1。二碱基重 复是 杜 鹃花 S S R 的主 要重 复类 型，占 6 6 1 5 3 8 ；单碱基和三碱基重复次之，分别 占据 1 5 3 8 4 6 和 9 2 3 0 8 。出现频率最低 的是 四 碱基重复，其次是五碱基和六碱基重复类型。表 1 杜鹃花不同重复单元 ES T-S S R 比例 在杜鹃花 E S T-S S R内，9 0 7 6 9 2 9 6 的重复序列 是没有被中断的完美型 S S R(p e r f e c t)；6 1 5 3 8
18、为 2个以上的同种重复序列被 3个碱基 以下的非重复 序列碱基所 间隔的非完美型 S S R(i mp e r f e c t)；一种 重复序列与其它种类的重复序列被 3 个 以下的非重 复序列所 隔的复合型 S S R(c o mp o u n d)占总 S S R 序列的 3 【)7 6 9 ，具体见表 2。表 2 杜鹃花不同 E S T-S S R的分类 2 2 杜鹃花中 E S T-S S R的特征 单碱基重复类型 以 A T重复比较 常见，重复 次数为 2 5 5 0次，主要是 2 5 3 4次。二碱基重复 第 1 期 王书珍等：杜鹃花表达序列标签资源中的微卫星信息分析 9 类 型为
19、 AG C T，次数主要分布在 1 0 3 0之 间，多 分布在 1 5 2 0区间内。在所检测的 E S T序列 内，没有发现 AC G T重复。E S T S S R序列 内出现的 三碱 基 重 复类 型 包 括 AGA TC T、C C A T GG、C TT AAG等，大 多重复 1 O 1 4次，其 中 C c A T GG重复在 c D NA序列 g i 6 5 3 0 1 7 7 8内出现了 3 1 次。四碱基重复仅发现 1例，为重 复 7次 的 AT AC GT AT基 序。五 碱基 重复 类 型 有 C C GC C G GC GG和 T C TT C GAAGA二种类型。此
20、外，本 研 究 还 发 现 以 C AAAA T TT TG、C AAAAC GTTT TG、G GC AC T AGT GC C等 3种六碱基重 复单元的 S S R位点。3 讨论 传统开发 S S R标记的方法需要构建部分基 因 组文库，并在文库构建前后 对富含 S S R序列 的克 隆进行筛选，还要经过 阳性克隆测序、引物设计、引 物适用性和多态性检测 等步骤，过程 比较繁琐，并 且对操 作 者 技术 要 求 比较 高I 1 卜 。开 发 E S T-S S R引物可以省去文库构建、杂交、测序等繁琐 的 操作】。研究表 明 E S T-S S R在 同类科属植物 中 的通用性也更强一些L
21、 6 。NC B I 数据库 内 E S T子 数据库的不断扩充 为 E S T S S R标记 的开发提供 了大量的信息资源 6 。杜鹃花 E S T资源中具有丰 富的 S S R标记，即 7 1 2 7 2 的无冗余 E S T序列均含有 S S R位点。杜鹃花的 E S T-S S R 以单碱 基、二碱基、三碱基重 复居多，而二碱基重复 占主导地位，与多个物种 中 的分布 隋况一致l_ 8 。We b e r 等将微卫星分为完 美型、非完美型、复合 型等三类 1。Wi n t e r 等则认 为真核生物基因组中完美型、非完美型、复合型微卫 星所 占的比例 随物种 的不 同而存在差异，完美
22、型 S S R的比例要显著高于不完美型和复合型_ 1。在 杜鹃 E S T-S S R内，完美 型占 9 0 7 6 9 2 ，远远高于 不完美型(6 1 5 3 8 9 6)和复合型(3 0 7 6 9 )。不 完美型 S S R常常代表着序列之间存在着较多的插 入、缺失、碱基置换等基 因突变。因此从 S S R的分 类来看，杜鹃花基因编码区内的变异程度相对比较 匮乏。微卫星标记的多态性与其核心序列 的重复 次数关系密切，核心序列重复次数越高，微卫星标 记越有可能表现出更高 的多态信息，进而更好地对 物种进行 目标基因定位、连锁图谱构建等遗传学分 析。D e n d a u w 等 以 R
23、s i ms i i h y b r i d Me v r Va n B e l l e为材料，通过测序方法得到 了 2 2 0个微卫 星 位点_ 1 。S c a r i o t 等 以意大利 杜鹃 品种 为研究对 象，比较了 1 O对 S S R引物与 AF L P标记、E S T标 记在有效性、多态性 和经济性上 的差 异 2。De l ma s 采用焦磷酸测序技术从高山玫瑰杜鹃 Rh o d o-d e n d r o n f e r r u g i n e u m 基 因组 内分离出 1 0 2个新的 S S R标记r 2。本研究对 E S T S S R序 列特征 的分 析将为采用
24、 磁珠 富集法 从杜 鹃花基 因组 中开 发 S S R标记提供参考。综上所述，杜鹃花 E S T S S R的重复单元 比较 丰富，出现频 率 比较高，这些 结果为 进一步 开发 E S T-S S R引物标记提供了依据。同时对后续工作 中分析杜鹃花种质遗传多样性、遗传结构、分子标 记辅助育种等研究有重要的意义。表 3 杜鹃花非冗余 E S T中不同类型 S S R的分布情 况 重复单元 重复次数 4 O 1|飞 AG C T AGA TCT CCA TGG 1 7 G ATAC GTAT C C Gc c G GC GG TCTTC GAAGA CAAAA TTTTG CAAAAC GTT
25、TTG GGC AC T AGT GC C 1 0 湖北林业科技 第 4 3 卷 参考文献 1 吴福建，李风兰，黄凤兰 杜鹃花研究进展 J 东北农业大学学 报，2 0 0 8，3 9(1)：1 3 9 1 4 4 2 朱春艳，李志炎，鲍淳松 我国杜鹃花资源的保护与开发利用 _ J 中国野生植物资源，2 0 0 7，2 6(2)：2 8 3 0 3 殷建忠，周玲仙，王琦 云南产 l 1 种野生食用鲜花营养成分分 析评价 J 食品研究与开发，2 0 1 0，3 1(O 3)：1 6 3 1 6 5 4 李少泓，孙欣 杜鹃属植物的化学成分及药理作用研究进展 J 中华中医药学刊，2 0 1 0，2 8
26、(1 1)：2 4 3 5-2 4 3 7 5 朱春艳，李志炎，鲍淳松 我国杜鹃花资源的保护与开发利用 J 中国野生植 物资源，2 0 0 7，2 6(2)：2 8 3 O 6 包文风，王吉明，尚建立 基于公共数据库的西瓜 E S T-S S R信 息分析与标记开发口 华北农学报，2 0 1 1，2 6(2)：8 5 8 9 7 Uu F，S u n F，L i J，e t a 1 A mi c r o s a t e l l i t e-b a s e d l i n k a g e ma p o f s a l t t o l e r a nt t i l a p i a(Or e o c
27、 h r o mi s mos s a mb i c us x Or e o c h r o-一 mi s s p p )a n d m a p p i n g o f s e x d e t e r mi n i n g lo ci J B MC g e no mi c s，2 01 3，1 4(1)：5 8 8 O l i v e r a P D，K i l i a n A，We n z l P，e t at D e v e l o p me n t o f a g e n e t i c l i n ka g e ma p f or S h a r o n g o a t gr a s
28、s(Ae g i lop s s h a r o ne n s i s)a n d ma p p i n g o f a l e a f r u s t r e s i s t a n c e g e n e J Ge n o me，2 0 1 3，5 6 (7)：3 6 7 37 6 9 Matl e z S，C a s t a g n o n e C，Es p a d a M，e t at F i r s t I n s i g h t s i n t o t h e Ge n e tic Di v e r s i t y o f t h e P i n e wo o d Ne ma t
29、o d e i n I t s Na tiv e Ar e a Us i n g Ne w P o l y mo r p h i c Mi c r o s a t e l l i t e L o c i J P l o S o n e，2 01 3，8(3)：5 91 6 5 1 0 D a ws o n D A，B a l l AD，S p u r g i n L G，e t a t Hi g h u t i l i t y c o n-s e r v e d a v i a n mi c r o s a t e l l i t e ma r k e r s e n a b l e p a
30、r e n t a g e a n d p o p u l a t io n s t u d i e s a c r o s s a w i d e r a n g e o f s p e c i e s J B MC g e n o m i c s，2 01 3，1 4(1)：1 7 6 1 1 许 晓军，张海琪，张超 等中华鳖表达 序列标 签资源 中的微 卫星信息分析 J 经济 动物学报，2 0 1 3，1 7(1)：1 5 1 8 1 2 Wa n g S Z，P a n L，Hu K，e t atDe v e l o p me n t a nd c h a r a c t e r i
31、z a tio n o f p o l y mo r ph i c mi c r o s a t e l l i t e ma r ke r s in Mo mo r d i c a c h a r a n t i a(c u c u r b it a c e a e)口 A me r i c a n J o u ma o f B o t a n y，2 0 1 0，9 7(8)：7 5 7 8 1 3 P a n L，Q u a n z，L i S，e t a 1 I s o l a ti o n a n d c h a r a c t e r i z a ti o n o f mi c r
32、 o s a t e l l i t e ma r ke r s i n t he s a c r e d】lo t u s(Ne l u mb o n u d e r a Ga e r t n )J Mo l e c u l a r E c o l o g y No t e s，2 0 0 7，7(6)：1 0 5 4 1 0 5 6 1 4 Wu Z H，Wa n g S Z，Hu J H，e t a 1 Dev e l o p m e n t a n d c h a r a c-一 t e r i z a t i o n o f mi c r o s a t e l l i t e ma
33、 r k e r s f or S a g i t t a r i a t r i t-c,l ia v a r s i n e n s i s(A l i s m a t a c e a e)J A me r i c a n J o u r n a l o f Bot a n y，2 0 1 1，9 8(2)：3 63 8 1 5 Q u a n z，P a n L，K e W，e t a 1 S i x t e e n p o l y m o r p h i c mi c r o s a t e l l i t e m a r k e r s f r o m Z i z a n i a l
34、 a t i f o fi a T u r c z (P o a c e a e)J M o l e c u l a r Ec o l o g y Re s o u r c e s，2 0 0 9，9(3)：8 8 7 8 89 1 6 We b e r J L，Ma y P E A b u n d a n t c l a s s o f h u ma n D N A p o l y mo r p h i s ms wh i c h c a n b e t y p e d u s i n g t h e p 0 1 y me r a s e c ha i n r e a c ti o n J
35、Ame ri c a n J o u r n a l o f Hu ma nGe n e ti c s，1 9 8 9，4 4：3 8 8 3 9 6 1 7 Wi nte r AK，F r e d h o l m M，Th o ms e n P D Va ri a b l e(d G-d T)n(d Cd A)n s e q u e n c e s i n t h e p o r c i n e g e n o me J Ge n o m ilo s，1 9 9 2，1 2(2)：2 81 2 8 8 1 8 S m u l d e r s MJ M，B r e d e me i i e r
36、 G，R u s K o r t e k a a s W，e t a L Us e o f s h o r t mic r o s a t e l l i t e s f r o m d a t a b a s e s e q u e n c e s t o g e n e r-a t e p o l y mo r p hi s ms a mo ng Ly e o p e r s i c o n e s c u l e n t u m c u l tiv a r s a n d a c c e s s i o n s o f o t h e r L y c o p e r s i e o n
37、s p e cie s J T h e o r e t i c a l a nd Atp p l i e d Ge n e tic s，1 9 9 7，9 4(2)：2 6 4 2 7 2 1 9 De n d a u w J，De Ri e k J，Ar e n s P，e t a 1 De v e l o p me n t o f s e-q u e n c e d t a g g e d mi c r o s a t e l l i t e s i t e(S TMS)ma r k e r s i n a z a l e a J Ac t a Ho r ti c u h u r a e，
38、2 0 0 1，5 4 6：1 9 3 1 9 7 2 0 I S c a r i o t V，De K e y s e r E，Ha n d a T，e t a 1 C o m p a r a t i v e s t u d y o f t he d i s c rimi n a tin g c a p a c i t y a nd e f f e c ti v e n e s s o lf AFLP，S T M S a n d ES T ma r k e r s i n a s s e s s i n g g e n e tic r e l a tio n s h i p s a mo n
39、 g e v e r g r e e n a z a l e a s J Ha n t B r e e d i n g，2 0 0 7 a，1 2 6(2)：2 0 7 21 2 2 1 De l ma s C EL，L h u i ll i e r E，P o r n o n A，e t a 1 I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i 0 n o f mi e r o s a t e l l i t e l o ci i n Rh o d o d e n dr o n f e r r ug i n e U l T l(E r i e a e e a e)u s i n g p y r o s e q u e n ci n g t e c h n o lo g y U A m e r i c a n J o u r n a l【o f Bo t a n y，2 0 1 1，9 8(5)：1 2 O 一 1 2 2 (责任编辑：郑京津)