药品分析方法验证指南-USP.pdf

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1、分析方法验证指南分析方法验证指南 1、目的 本文件的目的是为分析方法验证的数据收集提供基本指南。该指南参考了 USP，EEC(BP/EP)和 ICH 中的分析方法验证指南，能够满足公司的产品的分析方法验证工作。2、范围 本文件中-提供的定义和程序是为了促使公司质量方针的基本原则符合所有关于方法验证的法规要求。本指南适用于 API、原料、中间体的检测和放行的分析方法，并为新约物的应用收集支持性的数据。本指南是为了规范验证为公司的产品提供一个通用和分析方法验证方案。现有的方法中的小变化不需要全面验证，如：对柱子的同定相的生产厂家变化，样品准备的变化（搅拌和超声，震摇和超声）。在实际分析中，方法验证

2、需要提供更多的信息或细节，需要制定的特殊的方案。这个指南不包括微生物分析方法的验证。3、参考文件 USP，法定方法的验证 ICH 指南 Q2AQ2B，分析方法验证程序。公司关于有效数宁修约原则 4、定义 降解物降解物：降解物是由于一个物质经一段时间的化学变化（经过诸如光照、温度、pH、水分，经与容器发生反）产生，也叫降解产物或分解产物。大剂量原料药大剂量原料药：原料药在产品中的最大剂量大于 2g/天。定量限定量限(LOQ)：指试样中的被分析物能够被定量测定的最低值，其测定结果具有一定的准确度和精密度。线性：线性：在设计的测定范同内，检测结果与供试品中被分析物的浓度直接呈线性关系的程度。通常相关

3、系数(R)在回归线上有一定的斜率(m)。小剂量原料药：小剂量原料药：原料药的在产品中的最大剂量小于或等于 2g 天。测量精密度（测量精密度（ICH-重复性）重复性）：多次测定同一样品时的重现性(%RSD)。在 HPLC 或 GC 中也叫进样精密度。方法精密度方法精密度：同一样品或标准品（若有时）准备多份供试品在测定含量时的重现性(%RSD)。回收回收精精密度密度：测定同一标准时对准确度和线性的评估。也叫水平精密度。报告限度报告限度(RL)：低于某一数值的时候报告中就不体现。报告限度一般大于或等于定量限。再现性再现性(ICH-中间精密度中间精密度)：在不同检测条件下对样品检测结果的重现性。（不同

4、的实验室、分析人员、仪器、试剂、分析时间、日期等）5、指南、指南 A、总则、总则 因为在对产品的物理性质的评估时，分析方法会因测定的准确性和精密性而有所不同，故验证的可接受标准也不同于一般的检测测方法。一个可接受的标准可能需要根据方法的特性和检测的指标来确定。验证项目的选择可参照该指南后面所附的表 8-推荐验证项目。在验证之前，应当为验证的分析方法提供一个清楚并简明的格式。该方法应提供所有必要的细节（参数、条件等）。可以用以下几种方式来描述这些在分析方法验证过程中将要用到的数据。在验证过程中得到的任何意外的或计划外的结果，在此都应当调查并形成文件（包括合理评什的取消某个无效数据）。任何超标的结

5、果也应在验证报告中讨论并记录方法的局限性（若有）。方法应按照 USP 中名称分类，参照表 1。这里需指出并不是所有的分析方法都适合这 1 到 4 类。有特殊的方法时，每个数据（以下）都应反复考虑其适用性以满足分析方法的目的。表 1：分析项目 检验类别 定量，面积%，wt%定性 精密度 是 是 否 是*准确度 是 是 a*否 检测限 否*是*否 定量限 否 是 否*否 报告限度 否 是 否*否 选择性 是 是 是*是 范围 是 是*否 线性 是 是 否*否 中间精密度 是 是 是 是 是 耐用性 是 是*否 可能需要根据其自然特性作详细检测。a 可能需要对相关响应因子(RRF)根据以下方法作进一

6、步的检测。B、选择性；、选择性；l、要求：a)选择性的研究一般优先于其它验证项目。b)收集被分析物的相关文件（色谱图、分析报告、参考文献等），包括杂质、降解物、溶液、相关的或相近的相关物质。c)应有对典型样品的分析。新方法应能对相关降解物和/或杂质具有明确性和选择性。若杂质或降解物的标准不存在，通过对含有杂质或降解物的产品用不同的程序来检测的结果进行对比来研究选择性，这个样品的成分应已得到鉴别确认。为了更适合，这应当包括快到有效期的或相关的强降解条件下的的样品：光照、加热、湿度、酸碱水解、氧化等。2、可接受标准：为证明选择性，需要有重要成分的积极响应和对一些干-扰物质的响应的控制。鉴别试验对降

7、解物和杂质的选择性不作要求。c)精密度、回收率、线性和范围精密度、回收率、线性和范围 1、要求 a)线性/回收率：准备两份样品（两份样品，分别在两天准备，每个浓度总共准备 4 份）+每天用新的标准（如果需要）。典型的做法是，准备的样品做成五个不同的浓度。具体使用的浓度或多或少由产品本身和或所使用的仪器决定。+注意：注意：在预定的范围内分析物应该加入到合适的赋形剂或空白溶液中，应该用可靠的有代表性的分析试样（比如：大批量的 API）。定量溶液的制备应该采用线性/回收率制备的同一-批样品，以免引入研究的可变性。b)准确度一方法的精密度由分析的线性和回收率数据决定。c)范围一具体的范围一般是由线性数

8、据和所要使用的程序决定。这些值的范同在分析方法中能够达到一定的线性、准确度和精密度。d)回收率（由线性/精确度评估）一是由测定单个样品时的%rsd 的值得到，由每个浓度的四个点组成的回收率决定的。2、可接受的标准：所有数据都府符合表 2 的标准。3、报告：a)每个浓度的单个和平均百分含量（原料药验证）或回收率（最终产品的验证）都应该计算和报告。在 API 验证中，因为没有赋形剂，系数就用百分数表示。检出量 回收率百分含量=X100 加入量 表 2：一般方法可接受的标准 D 范围（%）样 品 的每 个 浓度 准 备的份数 精密度 线性 回 收 率 精 密 度（%RSD）可接受的平均回收率（与理论

9、值对比）相 关 系数（R）斜率（m）含量 API 5 50-150%A 每 个 浓度 4 份 1%0.990 0.95-1.05 1%降解物含量 低剂量原料药 5 0.05-150%C 每 个 浓度 4 份 10%(0.5%)25%(0.950 0.875-1.125 10%(0.5%)25%(0.5%)类别降解物含量 高剂量原料药 5 0.03-150%C 每 个 浓度 4 份 10%(1.0%)25%(0.950 0.875-1.125 10%(0.5%)25%(2%）降解物含量：API&大剂量制剂 0.1%（1%）1%（1%）残留溶剂 浓度的25%a（1%）浓度的10%a（1%）a 浓度

10、是指最初检测时的数据。注解：当一个分析物的检测结果低于报告限度时，结果仍然要报告以便与其它有检测结果对比（即计算绝对差）。若一个分析物的检测结果为未检出，那在计算绝对差时应看作是0。若两个分析物的结果都是“未检出”或低于“报告限度”，那中间精密度可看做通过。3、报告一报告与中间精密度结果的对比的结果作为绝对差。每个分析都包括系统适应性结果和样品检测的定量结果（如适用）。G、检测限、检测限 1、要求 a)按照一个恰当的方法来稀释分析物来确定检测限。稀释的倍数是直到分析物不能被检测到为止。b)在做检测限测试的样品需平行测定三次以确认结果。2、可接受的标准：以信噪比为 3：1 时的三针进样进行确认。

11、要注意检测限经常会受分析方法的条件的影响，会因仪器和柱子等的不同而发生变化。3、报告一在方法的最后讨论中对检测限的结果报告。H、定量限、定量限 1、要求：准备一份不含赋形剂或分析物的溶液，或一份由指定方法检测可能达到检测限的溶液。其测定结果应当具有一定的精密度、准确性和线性，并且是能够被定量测定的最低量。2、可接受的标准：以信噪比为 10：1 时进样进行确认。定量限经常会受分析方法的条件的影响，会因仪器和柱子等的不同而发生变化。3、报告-在方法的最后讨论中对定量限的结果报告。I、报告限度、报告限度 l、要求 a)准备并分析一份在报告限度内的样品以得到典型图谱，放在分析方法中。一般而言，限度应符

12、合表 5 中所例的 ICH 指南。在验证总结报告中应有对更高报告限度的证明。表 5：报告限度*报告限度 小剂量原料药（2g/天）0.05%大剂量原料药（2g/天）0.03%2、可接受标准一定量限必须不大于给定的报告限度。（一般以信噪比为 10:1 时进样进行确认）3、报告一在最后的方法中的系统适应性部分中报告。J、耐用性、耐用性 l、要求 a)若测量法易受不同分析条件的影响，分析条件可以调整以便于测试。调整变化要符合耐用性要求，典型调整变化有：样品制备、萃取时问、溶剂的成分、流动相的 pH 值的变化、不同的柱子、温度、流速等等。一般而言，把一个标准品或系统适应性溶液用来分析，观察关键系统适应性

13、参数（如分离度、信噪比等等）。我 6 中例举了一些 HPLC 方法的变化。表 6-HPLC 方法的变化 方法变量 推荐范围 流速 10%缓冲液离子强度 20%柱温 室温（20-25），周围环境温度应该 30-40 其它所有温度为5至 10 缓冲液的 pH 0.5 个 pH 单位 流动相成分 有机相5%柱 同一厂家的三个批号，若可以的话选两根柱子来自不同厂家（相同的固定相、填充物和柱子的尺寸）检测波长 5nm b)用不同时间段的样品和标准品溶液与新制的标准品溶液的对比结果来分析样品的稳定性（一般每隔 24 小时到 5 天）。溶液应储存在预先设定的条件下，以模拟正常的实验室操作条件（如冷冻、冷藏或

14、室温）。溶液的稳定性由方法中每次设定的时间点的计算结果决定，与每次时间为零时的溶液所测得的结果计算绝对差。2、可接受标准 a)记录每次变化所得的效果。b)当预定的变化所测得的结果符合表7所给的结果时，样品和标准溶液可确定是稳定的。表 7-样品标准溶液稳定性 可接受标准：与零点的绝对差（样品或标准品）类别主成分 1 类别降解物 0.1 类别杂质 0.05 类别 3 3、报告、报告 a)在最后的报告中包括所有的耐用性参数或预先设定的条件。最后耐用性所得到的条件应分析方法中以允差范围的形式描述（如调节 pH 值到 2.90.2）。b)样品的标准溶液的稳定性中应记录在环境中（如放置在实验室、冷藏等）持

15、续的时问，并且在这段时间样品的成分没有改变。在每个时间点用标准品校正的含量结果都应报告。在最后的报告中，用于分析溶液的时限要明确的指出。K、相对响应因子、相对响应因子 1、要求 a)当用质量百分含量报告产品的降解物和杂质时，用标准品（若有）测定相对响应因子。对每个可获得的降解物或杂质的分析，每次制备两份溶液含 1.0%的降解物或杂质包括 100%的活性成分。若给定的降解物和杂质时所测得的相关响应系数的值的范围在 0.8-1.2 之外时，那就作为校正系数在最后的计算中算入，以对降解物和杂质进行定量。若因为不存在降解物而无法检测到相关系数时，那相关系数就定为 1.0。b)若降解物的标准足作为方法的

16、一部分，就要对已知样品的纯度计算公式进行校。c)用到了已知浓度的降解物或己知峰面积的杂质，那相对响应因子的计算如下式：面积 DEG/浓度 DEG RRF=-面积 PARENT/浓度 PARENT 2、报告 a)对每个降解物或杂质的研究都应报告。b)在降解物或杂质的计算中包括 RRF 值。L、验证报告摘要、验证报告摘要 验证总结报告应当包括以下几个方面的内容：1、目的一记录验证的日的、方法改进的背景、所提供的原料药或产品、仪器概要和参考文献。2、验证的项目 a)验证项目的结果（如精密度、耐用性等等）应在报告中列出来。b)包括所有用到的标准品、样品、报告限度、稀释剂、赋形剂利系统适应性溶液的色谱图

17、。c)分析方法验证应该提供完整文件。包括为解释某一重要的数据所例的图表。d)最后的报告数据应当列出适当的有效数据。该验收标准不包括在最后的报告中所要报告的有效数据的个数。3、分析方法 a)方法对细节描述应该充分，并给出合适的格式与适当的数字和表格。b)方法中应当包括操作参数和操作法。如用臂摇设备，方法才能成功：而在平台上摇，方法就会失败时。则用臂摇的方法就需要详细的说明。当有多种操作方法时，方法验证试验应选择多个进行检测。c)操作规程中应写明试剂配制方法利试剂稳定储存的周围环境光照利温度条件。应包括特殊处理要求（如避光、使用棕色玻璃瓶等）。d)可能发生的任何物理作用（如因为与 PEEK 管的相

18、互作用而产生的不可重现性）或化学反应（光热敏性）都应描述并作为参考。4、偏差一在验证报告中应当有一单独的部分对验证过程中出现的任何偏差或突发事情进行描述。以于更多的细节的总结也可以提供一个参考文件的清单，参考文件清单上要写明文件的题目和日期。O可能需要根据其自然特性做特定检测。*当制剂和组分含量检测方法相同时则在制剂的选择项下进行选择。*分别检测过滤的和没有过滤的标准（若有）济液来评价分析物在过滤器上的粘合程度。*在改进和验证类别（定量）含量前，主要的方法（如 KF、LOD）需要先建立和验证，以便得到同一值 Table 8-推荐检测项目 选择性 准确度 回收率 线性 范围 测量精密度 方法精密

19、度 中间精密度 LOD LOQ 报告限度 耐用性 RRF 颜色/澄明度-API X X X 颜色/澄明度-溶液限度测试 X X X 溶解性 X X X X X X X X X 剂量均匀度*O O O O O O X X O Filter Qualification*X X GC X X X X X X X X o o X X O HPLC-含量 X X X X X X X X X X HPLC-稳定性样品测试 X X X X X X X X o o X X O ICP-含量 X X X X X X X X o o o ICP-重金属 X X X X X X X o o 鉴别-HPLC X O

20、O X 鉴别-IR 和 NIR X X X X X 鉴别-TLC X O O X 鉴别-UV X O O X Identity-Wet Chemical X O X Identity-X-Ray Diffraction(XRD)X O O X Loss on Drying by Oven(干燥失重)X X X 水分-Cpmputrac*X X X X X 水分-Karl Fisher 库仑法 X X X X X X X X X 水分-NIR*X X X X X X X 水分-Karl Fisher 容量滴定法 X X X X X X X X X NIR-Homegenous Solutions X X X X X X X X X 渗透压 X X X X 颗粒度 X X X X pH X X X Sieve Analysis X X X 旋光度 X X X X X X 滴定含量 X X X X X X X X O UV-Quantiation of Dyes and Colorants X X X X X X X X Viscosity 粘度 X X X