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1、PCR-DGGE技术PCR-DGGE技术 编辑整理：尊敬的读者朋友们：这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（PCR-DGGE技术）的内容能够给您的工作和学习带来便利。同时也真诚的希望收到您的建议和反馈，这将是我们进步的源泉，前进的动力。本文可编辑可修改，如果觉得对您有帮助请收藏以便随时查阅，最后祝您生活愉快 业绩进步，以下为PCR-DGGE技术的全部内容。PCR-DGGE技术一、实验原理变性梯度凝胶电泳(denatured gradient gel electrophoresis，DGG
2、E）最早是Lerman 等人于20 世纪80 年代初期发明的，起初主要用来检测DNA 片段中的点突变 。Muyzer 等人在1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究 。后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（TGGE）。该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域,目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为取决于其分子大小和电荷.不同长度的DNA片段能够被区分开,但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。DGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度
3、但序列不同的DNA片段区分开来。一个特定的DNA片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域和解链行为。一个几百个碱基对的DNA片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基组成。当变性剂浓度逐渐增加达到其最低的解链区浓度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链。当变性剂那浓度再升高依次达到其他解链区域浓度后,最高的解链区域也发生解链，从而双链DNA完全解链.不同的双链DNA片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域和解链区域的解链浓度也是不一样的。当进行DGGE电泳时，一开始变性剂浓度比较小，不能使双链DNA片段最低的解链区域解链,此时DNA片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样
4、。然而一旦DNA片段迁移到一特定位置，其变性剂浓度刚好能使双链DNA片段最低的解链区域解链时，双链DNA片段最低的解链区域立即发生解链。部分解链的DNA片段在胶中的迁移速率会急剧下降。因此同样长度但序列不同的DNA片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链变性剂浓度,因此它们会在胶中不同的位置分开.然而，一旦变性剂浓度达到DNA片段最高的解链区域变性剂浓度时，DNA片段会完全解链,成为单链DNA分子，此时他们又能在胶中继续迁移.因此如果不同DNA片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分开来.在DNA片段的一端加入一段富含GC片段可以解决这个问题.含有GC夹子的DNA片段
5、最高的解链区域在GC夹子这一段序列处，它的解链变性剂浓度很高,可以防止DNA片段在DGGE胶中完全解链.当加入GC夹子后，DNA片段中基本上每个碱基处的序列差异都能区分开来。二、实验步骤1。样品预处理2.样品DNA的提取及纯化 提取方法根据各样品特点自主选择.3. PCR扩增 Touchdown PCR method用于DGGE的PCR引物及其扩增程序：（1） V3区的DGGE引物200bp左右的片段正向引物：341F-GC（5CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3)；5 GC-clamp,有利于检测发生于高熔点区
6、的突变。反向引物：518R (5GTATTACCGCGGCTGCTGG3)PCR条件:10x PCR buffer 2.5ulMgCl2(25mmol/L） 2.5ul dNTP(10mM/L） 0.5ulforwardpri（10pmol/ul) 0。5ulreverse-pri(10pmol/ul） 0.5ulTemplate DNA 12 ul add ddH2O to 25ulPCR程序：94 5min （Taq added）94 1min65 1min72 1min- 20 cycles之后每两个循环降低复性温度1 -94 1min55 1min72 1min94 1min55 1m
7、in 10 cycles72 1min72 7min（2） V3V5区的DGGE引物高于500bp的片段Bacterial正向引物341357：341FGC(5CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGCCTACGGGAGGCAGCAG3）;反向引物907926:907R(5CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3)PCR程序:94 5min (Taq added）94 1min65 1min72 1min- 20 cycles之后每两个循环降低复性温度1 -94 1min55 1min 12 cycles72 3min72 7minArchara正向
8、引物344363：ARC344FGC（5- CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGACGGGG YGCAGCAGGCGCGA3）反向引物915-934：ARC915R（5GTGCTCCCCCGCCAATTCCT3）PCR程序：94 5min （Taq added)94 1min65 1min72 1min- 20 cycles之后每两个循环降低复性温度1 -94 1min61 1min 12 cycles72 1min72 10min（3） V6V8区的DGGE引物480bp左右的片段正向引物:968F(5CGCCGGGGGCGCGCCCCGGGCGG
9、GGCGGGGGCACGGGGGGAACGCGAAGAACCTTA3）反向引物：1401R（5-CGGTGTGTACAAGACCC3）PCR程序：94 5min （Taq added）94 1min65 1min72 3min- 20 cycles之后每两个循环降低复性温度1 -94 1min55 1min 15 cycles72 1min72 10min4。预实验（DGGE 条件优化)DGGE有两种电泳形式：垂直电泳和水平电泳。前者是指变性剂梯度或温度梯度的方向和电泳方向垂直；后者是指两个方向是平行的。在分析微生物群落的 PCR 扩增产物时,一般先要用垂直电泳来确定一个大概的变性剂范围。垂直
10、电泳时，胶从左到右是变性剂梯度.在胶的左边，变性剂浓度或温度低，DNA 片段是双链形式，因此沿着电泳方向一直迁移。在胶的另一边，由于变性剂浓度或温度高,DNA 一进入胶立刻就发生部分解链，因此迁移很慢。在胶的中间，DNA 片段有不同程度的解链。在变性剂浓度或温度临界于 DNA 片段最低的解链区域时,DNA 的迁移速率有急剧的变化。因此，DNA 片段在垂直胶中染色后呈 S 形的曲线，根据垂直电泳确定的范围，再用水平电泳来对比分析不同的样品.5.制胶（1)试剂配制 40% 丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺 (Acrylamide/Bis 37。5:1）Ragent amountArylamide 38.9
11、6gBisacrylamide 1.04gAdd ddH2O to 100ml 10 过硫酸氨 （Ammonium persulfate)Reagent amountAmmonium persulfate 0。1gAdd ddH2O 1.0mlstore at -20 for about a week 50TAE BufferReagent AmountTris Base 242g121gAcetic acid glacial (冰乙酸) 57.1ml28。55ml0。5M EDTA pH8.0 100ml50mlAdd ddH2O to 1Lto 500mlStore at room tem
12、perature Denaturant stock solution (8.0)For 100ml use： 0 10 20 30 40% 50% 60% 70 80% 90 10040 Acrylamide/Bis (ml） 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 2050TAE Buffer (ml) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2Formamide （ml） 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40Urea (g） 0 4。2 8.4 12。6 16。8 21 25。2 29。4 33.6 37。8 42 0 25 35 45 55 65
13、% 75%40% Acrylamide/Bis （ml) 20 20 20 20 20 20 2050TAE Buffer (ml) 2 2 2 2 2 2 2Formamide (ml) 0 10 14 18 22 26 30Urea (g） 0 10。5 14.7 18。9 23。1 27。3 31.5（2）制胶高浓度端：Syringe，高浓度胶70 Denaturant/8。0 gel 10ml 14.5ml20ml24ml10% APS 80l 116l160l192lTEMED 6l 8。7l12l14.4l低浓度端：Syringe，低浓度胶30% Denaturant/8.0 ge
14、l 10ml 10 APS 80l TEMED 6l 上相非变性胶5ml 0% Denaturant/8。0% gel40l 10 APS3l TEMED（3）制胶步骤 按照BioRad 475型梯度生成仪使用说明书操作.具体操作步骤见视频教程及网上资源（Harvard）。灌完胶后，立即用水冲洗注射器,避免凝固，并用水饱和正丁醇封胶，使液面水平保持水平。约凝固1h后，再用非变形胶灌注。插入梳子，待凝固，出现缩胶补充。(4）DGGE电泳条件 (根据不同PCR产物电泳条件不同） 水温：60胶浓度：8.0（丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺 37。5：1）变性梯度范围：30 70（100%变性剂中含7mol/
15、L尿素和40去离子甲酰胺）上样量：15 20ul PCR产物电压:200V电泳时间:6h30minDGGE运行条件：1xTAE buffer，60，80V 运5min，200V运行6.5h（5）染色EB染色:染色20min,然后用去离子水漂洗几次,254nm紫外分析。Bassam硝酸银染色步骤：固定：10%的冰乙酸，30min （固定和终止共配置900ml）洗脱：双蒸水洗脱，32min银染：AgNO3 1g/L，37%的甲醛1.5ml/L，30min。配制500ml洗脱：双蒸水，1min（沥干时间不要超过10s）显色：30g/L Na2CO3，37%的甲醛1.5ml/L，200l 10g/L
16、Na2S2O3。10下预冷。配制800ml.终止：10%的冰乙酸；5min洗胶：用无菌双蒸水洗胶，33min固定液：10乙酸 900ml90ml 100% + 810ml ddH2O = 900ml 10% 乙酸银染试剂：1g/L AgNO3，1.5ml/L 37甲醛 500ml（提前配制）0。5g AgNO3 + 0.75ml 37甲醛 + ddH2O定容至500ml 显色试剂：Na2CO3 30g/L，1。5ml/L 37%甲醛 800ml（使用前加入200l 10g/L Na2S2O3）24g Na2CO3 + 1。2ml 37%甲醛 + ddH2O定容至800ml0.01g Na2S2
17、O3 + 1mlddH2O，用时取200l6.样品的DGGE 分析(1)切胶PCRDGGE验证用细菌的正向引物341357：341FGC(5- CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGCCTACGGGAGGCAGCAG3)、反向引物907 926：CCGTCAATTCMTTTGAGTTT；古菌的正向引物344 - 363：ARC344FGC(5-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGACGGGG YGCAGCAGGCGCGA- 3）、反向引物915934：ARC915R(5GTGCTCCCCCGCCAATTCCT
18、- 3）扩增切取得条带，然后作DGGE电泳看是否与原DGGE电泳位置一致，一致就作下面步骤。(2)克隆测序7。图谱分析和条带序列分析。1、 Bio-rad QUANTITY ONE 软件对DGGE图谱分析2、 Dice coefficient(戴斯系数）计算各样品间相似性3、 HRT多样性指数分析，了解连续样品中菌落结构变化情况4、 条带测序 构建发育树，进行系统发育分析8.DGGE技术的缺陷及优化： 在用分子生物学方法分析微生物群落结构组成时，有很多偏差。不同细菌的基因组大小和核糖体 RNA 拷贝数不同；提取基因组总 DNA 时细胞的裂解效率不同；DNA提取和纯化时有偏差；PCR 扩增过程中
19、有偏差。除了这些，在应用DGGE 技术分析微生物群落结构组成时还有很多其他的缺陷。DGGE 一般只能分析 500 个碱基对以下的 DNA 片段,因此得到的系统进化相关的信息就很少。在研究复杂环境生态系统（如土壤，人体肠道）时，其中微生物种类很多。但DGGE图谱中一般只有一二十个条带,这些条带反映的是群落中的优势菌群。一般只有在总的微生物群落中占 1%以上的种群才能被检测出来，系统中的弱势菌群不能被检测到。为了降低分析群落多样性时的复杂度，一种方法是先根据 GC 含量的不同，将基因组总 DNA 分成各个部分，再分别 PCR-DGGE 分析.另一个方法是使用类群特异性（groupspecific）
20、引物对基因组总 DNA 进行 PCR 扩增，再用于DGGE/TGGE 分析。在设计 PCR 引物去扩增某些特定菌群时,由于某些菌群的序列相互之间同源性不是很高，因此需要设计简并性引物。此时，相同的微生物会有 2 个条带,这会对微生物群落结构组成造成高估。另外，同一个细菌也可以有多个核糖体 RNA 操纵单元，它们的序列可以有微小差异，这也会高估微生物群落多样性.DGGE 的电泳条件不一样，即使相同的样品所得的图谱也会有差异。在应用DGGE时，如果所用电压太低，需要的电泳时间就很长，变性剂梯度会有变化,因此导致图谱也会有变动.另外，DGGE 的一个很大的优点是可以对胶中所感兴趣的条带进行研究,得到
21、它们的序列，从而可以直接获得和系统生态功能相关的微生物种群的系统进化信息。以前研究DGGE胶中单一条带序列组成的一个比较普遍的方法是先构建整个微生物群落的16S rRNA 克隆文库,然后再对文库中的克隆进行扩增，通过DGGE 和原始样品的条带进行对比,能迁移到相同位置处的克隆的序列就是原始条带所含的序列。然而，已有研究表明,不同的 DNA 条带在DGGE 胶中可以迁移到相同的位置，因此单一DGGE 条带可能含有不止一种序列。这种情形在分析复杂环境样品时会更多。另一个研究DGGE/TGGE 胶中单一条带序列组成的方法是直接从胶中回收DNA，然后构建其克隆文库,再对其中的克隆进行测序。现在越来越多
22、的研究人员采用后一种方法。然而，PCR 过程中产生的异源双链（heteroduplex）和单链 DNA（single-stranded DNA）也会对分析单一条带序列造成偏差。人们已经普遍意识到异源双链 DNA 会在DGGE胶中产生虚假条带，然而对单链 DNA 造成的偏差还没有引起足够的重视。我们实验室以某处理工业焦化废水的活性污泥为研究对象,详细地分析了单链 DNA 在分析TGGE 胶中单一条带序列组成时所造成的影响,发现它会大大高估单一条带中的序列多样性.另外，我们还对比了 3 种去除单链 DNA 的方法，发现变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（denatured polyacrylamide gel
23、 electrophoresis， d-PAGE）纯化的效果最好。我们建议在进行DGGE/TGGE 电泳之前，尤其是要分析单一条带序列时,要先用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对PCR 产物进行纯化，然后再走电泳。9。注意事项：1、配置试剂时一定要用去离子水，制胶洗膜时用的各个容器也要用去离子水洗涤干净，以防止氯离子污染。2、制胶是实验的关键。在往玻璃板中灌胶时，要匀速地转动滑轮,将凝胶液匀速地灌入玻璃板。3、灌完胶后，立刻清洗注射器,以防丙烯酰胺凝固，堵塞管子。4、DGGE 的电泳缓冲液要超过“RUN”刻度线，不要超过“Maximam”刻度线。5、点样时，要用小型注射器，伸入点样孔底部点样。6、银染的整个过程中，一定要戴手套.以避免手接触胶而带来的污染.7、每次用完仪器后要及时清理,清洗玻璃板培养皿等玻璃仪器。