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1、 实验研究 原代猪肝细胞培养体系及培养模式的初步探讨陈柯高毅杨继震【摘要】目的探索一高密度、高效率的原代猪肝细胞培养方法，为生物人工肝的生物材料提供一种有效的培养模式。方法采用改良!#$%二步胶原酶灌注法分离肝细胞，分别将&()*的肝细胞加入胎牛血清、猪门静脉血清的培养体系中进行方瓶静止培养及聚球培养。结果肝细胞在接种后呈明显的+,-./012 聚集趋势。门静脉血清培养体系中肝细胞的 3$4567%、89:合成能力明显高于胎牛血清组。在培养后的前 2 周门静脉血清培养体系中聚球细胞模式优于微载体静止培养模式。结论与胎牛血清培养体系相比，猪门静脉血清培养体系更适合原代猪肝细胞高密度培养。聚球培养
2、是一种较为理想的原代猪肝细胞培养模式。【关键词】细胞，培养的；动物，实验!#$%&()&*+,-./#.#)+0,&$#.1-$,1$+#,2&)()+,-)%(&)/+1 31(-&/%14!#$%&，()*+，*($,+-.&/01&23456&/5 78&/&439:;4.;?+3/72+539，5.&A+45 B+9+534=B&C+D39 E/+F&4+5=，;3/-.7;&();$.9:?7#?/%A7-,:%/BBC-7D C5$-597%#6-?./B.9 976:9,.9C7%?1:-.C,-A-.4-:7%:%BBC-7D C5$-597%#6./5$B.9 47.:9-7
3、B7C7:$7D9E:13&$4F.9C7%?:-.C,-A G9?:9DA-/4,-G.1A-9B5A7.%C.$:#%:A 6-?./E=?%-?,G9 9AC-7D$,C5$-59/:-:C.%C%-9:-7.%.B&()*G7-?;#HI C,-./012 7%JKLK 6/756 A5$6%-/G7-?()6$HI B-:$C:$B A956（M+!）:%/-?:-G7-?()6$HI.9C7%.9-:$D7%A956（FFN!）E;14#.4K.A-?:-.C,-A#.-.#-?9 G7-?67C9.C:9979A:%/A.6.B-?6:-:C?/.%67C9.C:9979A:4.
4、5-;O-.O?9.7/A G9B.96/E=?6.9?.$.#7C:$C?:9:C-97A-7CA:%/-?A,%-?-7C B5%C-7.%A.B:$4567%:%/59:G9 6:7%-:7%/B.9&GPA 7%M+!C5$-59 A,A-6:%/?9.7/A G:A 4-9-?:%-?:-.B67C9.C:9979AE:9/G7-?M+!C5$-59 A,A-6，FFN!C5$-59 A,A-6 7A 6.9 A57-:4$-.C5$-5917%#976:9,?:-.C,-A 7%?7#?/%A7-,:%/-?C5$-597%#6./.B A?9.7/7A-?6.A-9.67A7%#
5、6./5$E【=1%&)$4】+$A，C5$-59/；3%76:$A，$:4.9:-.9,国家自然基金资助项目：广东省“五个一”重点课题（2Q&R);(;）作者单位：&();)*广州第一军医大学附属珠江医院肝胆外科以缓解急性严重性肝病或肝损伤的临床症状和作为肝移植前过渡性“桥梁”为目的的生物人工肝研究在全世界受到普遍关注。现阶段，生物人工肝的研究工作主要集中在生物材料的研究上，主要内容是：寻求肝细胞来源及探索高密度、高功能长期离体肝细胞培养，从数量和质量上满足生物人工肝的需要(，;。鉴于人体正常肝细胞来源困难，人们常用哺乳动物的肝细胞及人肝细胞系作为人工肝的生物材料，前者来源丰富且功能活性高，
6、是较为理想的生物人工肝的生物材料。但离体肝细胞体外培养要求高，增殖生长困难，细胞密度很难满足于人工肝的要求。为解决这一矛盾，我们采用原胶酶二步原位肝脏灌注法分离获取肝细胞，分别在胎牛血清培养体系和猪门静脉血清培养体系中进行方瓶+,-./012微载体静止培养及在门静脉血清中进行聚球培养，在形态学和生物功能上加以比较研究。材料和方法(E实验动物、材料：实验动物：本地杂种猪&只，体重&S()P#，雌雄不限，(S;月龄，由中山医科大学实验动物中心提供。主要试剂：胰岛素、胰高血糖素、转铁蛋白、氢化考的松、!型胶原酶、苔盼蓝、+,1-./012 微载体等由!7#6:公司提供。自配&)#HI 甲基硅树脂乙酸
7、乙酯溶液；()#HI 锇酸、;)#HI 戊二醛、梯度丙酮溶液由第一军医大学电镜室提供；!O&)扫描电镜为日本产品。门静脉血清在实验中收集。O2;中华肝胆外科杂志;)(年 O 月第 R 卷第 O 期+?7%T U:-.47$7:9,!59#，39;)(，N.$ER，V.EO万方数据!方法（#）猪肝细胞的分离培养：采用改良$%&%(二步胶原酶灌注法分离肝细胞，每只猪肝细胞悬液随机等量分配到以下)组进行：!胎牛血清方瓶微载体静止培养；猪门静脉血清方瓶微载体静止培养；#猪门静脉血清聚球培养。实验共分*次进行，每只猪的处理过程相同。在实验中*只猪共收集到门静脉血#)+,。以!+-.,/(的离心速度离心提
8、取门静脉血清。把第一次离心提取的血清再以!+-.,/(的离心速度离心)次，提炼成精制门静脉血清。共精炼门静脉血清 0#1,。精炼门静脉血清抽滤除菌并分装备用。培养瓶硅化：取#*个#+,培养方瓶，向每个方瓶中加入!2),*+&.3 甲基硅树脂乙酸乙脂溶液，轻轻摇匀，吸出多余的溶液。置 4+5电烤箱烘干备用。微载体预处理：称取!+,&的 6789:%;，?&!A$洗涤)次，并用 A$浸泡过夜。经#*磅)+,/(高压消毒。消毒后再用无血清的 B?C?基础培养基无菌状态下浸泡#+D 以上备用。胎牛血清方瓶微载体静止培养（!E*）：猪肝细胞微载体培养：将经过预处理的 6789:%;)微载体按!&.3 的
9、浓度加入经过*+&.3 甲基硅树脂乙酸乙酯溶液硅化的#+,的培养瓶中。肝细胞按*F#+4.3 接种于含微载体的培养瓶中，同时加入含#+,.3 胎牛血清、#+$&.3 胰高血糖素、#+$&.3 转铁蛋白、!+$&.3 氢化可的松、#+$&.3 胰岛素、!+$&.3头孢他定的 B?C?培养基至*+,，置培养瓶于)05，*+,.3 6G!，#+H湿度的二氧化碳培养箱中，前 1 D 每#*2)+,/(旋转摇晃#次。1 D 后每!D 旋转摇晃#次。I D 后停止摇晃，置于培养箱中静止培养。培养!1 D 后换液。以后每两天换液#次，每次换去#+,培养上清。收取培养上清，以#+-.,/(的离心速度离心，去除
10、细胞碎片。测定上清中清蛋白、尿素浓度时用。猪门静脉血清方瓶微载体静止培养（!E*）：在B?C?基础培养基中按#+,.3 的浓度加入精炼的猪门静脉血清，其他处理同胎牛血清培养组。猪门静脉血清肝细胞聚球培养（!E*）：肝细胞分别按*F#+4.,的密度接种于各含硅化方瓶中，培养及培养条件同猪门静脉血清方瓶微载体静止培养组，前 1 D 每#*2)+,/(旋转摇晃#次。1 D 后每!D 旋转摇晃#次。I D 后停止摇晃，置于培养箱中静止培养。培养!1 D 后换液。以后每两天换液#次，每次换去#+,培养上清。收取培养上清，以#+-.,/(的离心速度离心，去除细胞碎片。测定上清中清蛋白、尿素浓度时用。（!）
11、肝细胞功能和形态学检查：光镜观察：用G7,JKL 倒置相差生物显微镜及全自动显微摄影装置对肝细胞微载体培养及肝细胞聚球进行动态观察并摄影。微载体粘附培养的细胞计数方法：分别于培养的第#，!，)，1，*，4，0，#I:在每个培养方瓶中取#,均匀的样品，离心（#+-.,/(，*,/(）后，去上清液，加入等量的#&.3 结晶紫柠檬酸溶液，然后置于)05温箱内保温#D 以上，剧烈振荡并用吸管反复吹打，待微载体沉到管底时，迅速吸取上清液，在血细胞计数板上计算细胞核数并绘出细胞生长曲线。扫描电镜观察：于微载体肝细胞培养的第 0 天，在均匀的状态下取细胞培养样品，尽量去除培养基，平衡液冲洗)次。常规)+&.
12、3 戊二醛固定 1 D，#H锇酸固定)+,/(，丙酮酸梯度脱水各#+,/(，乙酸异戊酯置换 1 D 以上，MNOP6MN M6!6+!（日本）临界干燥器干燥后，真空喷溅铂金离子，$1*+扫描电子显微镜观察细胞生长情况并摄影。清蛋白及尿素合成功能检测：分别收取不同培养时间的细胞培养上清液，用 A%QR,=(全自动生化分析仪测定上清中清蛋白及尿素含量。聚球培养的细胞计数方法：分别于培养的第 0 及#I 天在每个培养方瓶中取#,均匀的样品，加入胰蛋白酶消化离心（#+-.,/(，*,/(）后，去上清液，进行计数。结果#本实验成功的采用了改良$%&%(二步胶原酶灌注法分离猪肝细胞，平均每只猪肝获取!SI
13、!F#+#+个肝细胞，平均活力 T)SIH，每克猪肝平均能获取 0S+#F#+0个肝细胞。!各体系前 0:细胞数见表#。第#I 天微载体培养的胎牛血清培养体系中肝细胞数为（#S#U+S*)）F#+I，门静脉培养体系中肝细胞数为（)S#U+S0#）F#+I。门静脉血清培养体系中肝细胞聚球培养细胞数计数：第 0 天肝细胞数为（)S#!U+S!4）F#+0，第#I 天肝细胞数为（#S)T U+S*#）F#+I。)肝细胞形态学：倒置显微镜下观察结果：培养后 1 D 可见有的微载体上开始有肝细胞附壁生长，*)!中华肝胆外科杂志!+#年 1 月第 0 卷第 1 期6D/(V M%J=89W/=-7$K-&
14、，PJ-!+#，X90，Y91万方数据其后微载体表面粘附生长的肝细胞逐渐增多。部分微载体由于肝细胞相互作用而出现“桥联”现象（图!），形成成片状或串珠葡萄状联合体，部分微载体与肝细胞产生“滚雪球”效应。培养后#$可见!%&以上的微载体表面都有肝细胞粘附，肝细胞粘附贴壁后的形态为不规则多边形的上皮样细胞形态，随后见肝细胞铺展生长。培养#$后活性肝细胞大多直接或间接地牢固粘着于微载体。肝细胞在微载体表面粘附生长类似于肝细胞在培养瓶中单层贴壁培养。虽然各培养体系中肝细胞的生存时间长短不同，但死亡前均有以下特点：肝细胞形态开始变为不规则形，胞浆内可见明显的颗粒，并有空泡形成，细胞边缘不清，渐渐细胞脱离
15、微载体，细胞核消失最后脱落死亡。胎牛血清培养体系培养后$接种的肝细胞开始粘附微载体壁并伸展，可见双核肝细胞，有的肝细胞在微载体壁上连接成丘岛状。#$后有()*+,)*的肝细胞粘附。接种后&-细胞开始增殖，接种(-开始出现衰老细胞，在 -左右肝细胞布满微载体表。培养后.周左右肝细胞开始变粗糙，细胞边缘模糊不清，多数细胞内可见颗粒及空泡，肝细胞开始从微载体上脱落，其后 -左右肝细胞脱落死亡。猪门静脉血清培养体系中肝细胞前#$细胞形态与胎牛血清培养体系的变化大致相同，但双核细胞明显较前两种多。培养&-微载体表面大部分粘满新生肝细胞，细胞相互连接成球状及条索状，新生细胞周围可见衰老的细胞浮起。培养!-
16、左右，肝细胞已基本布满微载体表面，此种状态可维持到.-左右。培养.#-后开始见肝细胞脱离微载体，至培养.(-后时肝细胞基本脱落，仅有少量微载体上粘有肝细胞。电镜显微镜观察结果：于培养!-时，取样在扫描电镜下观察，见肝图!培养#$可见微载体间的细胞“桥联”（/)）图 电镜下串在一起的肝细胞微载体“串珠”（/,&)）图#培养第,天后可见肝细胞聚集成“细胞球”（/#)）图$培养第!)天后细胞增生成“水藻球”（/#)）细胞呈半球状紧密贴附于微载体上，细胞表面的微绒毛清晰可见，有如“仙人球”状，粘附于微载体上的肝细胞数量多少不一、分布不均，且可见两个或数个微载体借“细胞桥”相互聚集成患珠状（图）。在倒置
17、相差显微镜下观察门静脉血清培养基中原代猪肝细胞聚球培养的动态过程中，我们发现：肝细胞在接种后#$肝细胞开始聚集成球，肝细胞球的直径大多在(+!&#!0 之间，每个肝细胞球约聚(&中华肝胆外科杂志)!年#月第,卷第#期1$23 4 56789:;2?=A，B7=)!，C:D,，E:D#万方数据集!#$个细胞，这时细胞间的连接致密，容易离散，在光镜下观察有如一朵朵散开的“细胞花”；培养第%天后细胞间相互连接致密，细胞增生聚集成“细胞球”（图&），培养第!天后细胞增生形成球形及不规则的柱形，有如海洋中浮生的“水藻”类植物（图）；培养第$天左右聚球“水藻”开始枯萎，细胞内开始出现空泡颗粒，细胞核开始溶
18、解，细胞脱落死亡；培养第$&天聚球细胞完全脱落死亡。(肝细胞生化功能检测：采用)*+,-./全自动生化分析仪检测不同培养体系不同培养方法在不同培养时间内培养上清液中的清蛋白及尿素合成功能（图 0，图 1）。数据分析表明，两培养体系中微载体培养及聚球培养的肝细胞生物合成功能在培养后%#!2 内均较高，且在培养!#!$2 时上清液中清蛋白、尿素浓度最高。但在微载体培养的门静脉血清培养组中培养� 2 后其肝细胞功能明显高于胎牛血清培养体系培养组，门静脉血清中的肝细胞在培养到 0 2 左右时仍具有功能活性，培养 0 2 后肝细胞仍具有生物活性；肝细胞聚球培养在培养后的&#$2 时其功能活性明显高于
19、微载体培养组（图%，图 3），但至$&2 时肝细胞聚球基本丧失生物功能。图!培养体系中肝细胞合成蛋白能力变化图 培养上清液中尿素浓度变化图#不同培养模式中肝细胞合成清蛋白能力的变化图$培养上清液中尿素浓度变化讨论肝脏的血供大约%4来源于门脉系统，肝脏生长发育和功能维持主要依赖于门脉系统提供的营养环境。也就是说在体肝细胞是在以门静脉血为主的“培养基”中生长并维持其功能。门静脉血提供给体内肝细胞生长和维持其生物功能所必需的各种营养物质，包括各种氨基酸、能量物质成分，此外还提供了多种生长因子。本实验正是以此为基础，在基础培养基中添加猪门静脉血清，并以此作为培养体系培养肝细胞。实验结果表明，肝细胞能在
20、这一体系中长期生存并维持其生物功能。从实验数据可以看出，门静脉培养体系中的肝细胞在增殖前即培养前&2 功能较低，培养后的%#!2 维持较高功能状态。肝细胞培养至第 0$天（%周以上）仍有一定的生物合成功能，基础培养上清中白蛋水平仍高于起始水平。本体系培养的肝细胞其生存时间及生物功能维持的时间明显长于胎牛血清培养体系（&2）。在国外报道的较好的培养体系中肝细胞生存时间一%&$中华肝胆外科杂志$!年 月第%卷第 期567/8 9*:.;7.?AB?C，D:?$!，E(%，F(万方数据般都在!#周。所以此培养体系较之其他培养体系来说，具有一定的优越性，是$%&中生物材料得以长期保存并维持功能较为理想
21、的液态环境。微载体细胞培养方法自()*年由+,-.,/,0 首先介绍以来，就被迅速推广应用于相关的各个研究领域，其主要魅力在于微载体作为细胞培养的载体具有以下两个方面的优越性：在单位体积内提供给细胞贴壁生长的表面积大。目前已成为商品化的微载体主要由葡聚糖、聚丙烯酰胺、交联明胶、聚苯乙烯、颗粒状纤维素和中空玻璃等六大类型。常用的微载体是表面包被薄层胶原基质的葡聚糖凝胶类微载体即 12345,6 系列产品，在我们前期实验工作中已证实其中的 12345,678 型微载体是细胞培养较为理想的载体。基于以上原因，本实验采用 12345,678 型微载体作为原代猪肝细胞培养的载体，分别在含有 99:0;&
22、猪门静脉血清及胎牛血清的培养体系中进行细胞培养，结果表明，在两培养体系中原代猪肝细胞均能粘附于微载体上生长，肝细胞产量可达 92 等8研究表明，在没有粘附剂的培养体系中进行“肝细胞凝聚球”的培养中，由于凝聚球的结构与正常肝细胞超微结构类似，细胞形态改变小，所以培养体系中的离体肝细胞能存活!)周，并能维持其正常的生理功能。10=234-等!，#的研究表明，较之离体的肝细胞来说，小块肝片中的肝细胞其特异性转录基因能较好的保持正常，进而证实了肝细胞三维结构对其特异性能功的影响。我们的实验发现，肝细胞在悬浮状态下进行聚集球培养后?!，有 9A (9A的肝细胞聚集形成多个直径在)?8!:的肝细胞聚球；培
23、养后第?天肝细胞数达到94CK LE4I,=:EIK J4=2LE5 32H,=3EJEIE=00EM,K2K3,:G NEHH4-OE-K4，(*，#：?!97?!*G?P0,-5EQ&R，F,+,05,%G B,:EH,:,=L0,4004S JEL,:,:L=-,K E-,H=34I23,LE4,=34K：=H,TCEKE3,J4=KCII,KKJC0 LE4=3EJEIE=0 0EM,？%73EJ UQ=-K，(*，?：*72 V，$,:E,WG BH,4E5=0=QQ,Q=3,IC03C,4J=3 0EM,I,00K：EK34732HEI,4Q=-E/=3E4-，LE4:=3E6 5
24、,H4KE3E4-=-5:=E-3,-=-I,4J JC-I3E4-=0=I3EME3E,KG V 1,00$E40，(,0K4-%&G W,H,-5,-I,4J 0EM,KH,IEJEI 3=-KIEH3E4-4-3EKKC,4Q=-E/=3E4-G R40 1,00$E40，(E:=2 IC03C,G Z-+E34 1,00 W,M$E40%-E:，(*，88：#)(7#*!G（收稿日期：(79)7?修回：(77?(）释名 分型 分期原发性肝癌和肝内胆管细胞癌的 FNR 分期（二）吴志全!#$病理分类HF，HN 和 HR 的分类同 F，N 和 R 的分类相对应。N9组织学检查切除的区域标本含淋巴结数!8 个。%组织病理学分级分化情况不明。高分化。?中等分化。8低分化。!未分化。分期标准期FN9R9#期F?N9R9$%期F8N9R9$期FNR9F?NR9F8NR9%期F!任何 NR9%$期任何 F任何 NR注：（）F 分类中将肝脏分为两叶，分界线为胆囊床及下腔静脉连线的投影线。（?）区域淋巴结指肝门淋巴结。2 BCQ，%H?99，+40G*，N4G!万方数据