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1、收稿日期:2009-08-10作者简介:韩磊(1969?),女,山东寒亭人,潍坊职业学院副教授,博士。主要研究方向:植物遗传育种研究。多元线性回归模型在水稻紫米花色素与相关物质分析中的应用韩磊1,汪旭东2,吴先军2(1.潍坊职业学院,山东?潍坊?261031;2.四川农业大学水稻研究所,四川?温江?611130)摘?要:在水稻紫米发育过程中,对花色素、类黄酮、多酚、苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶进行提取和测定,并对测定的结果进行统计分析。分析结果表明:总酚和苯丙氨酸解氨酶的活性对花色素的偏回归系数不显著;类黄酮对花色素的偏回归系数达显著水平,多酚氧化酶的活性对花色素的偏回归系数达极显著水平,建立了
2、最优二元回归方程。用标准偏回归系数测得类黄酮对花色素的相对影响占0.5723,多酚氧化酶活性对花色素的相对影响占 0.5725。花色素与类黄酮和多酚氧化酶活性的复相关达极显著水平;类黄酮与多酚氧化酶活性的偏相关系数不显著。关键词:花色素;类黄酮;多酚;苯丙氨酸解氨酶活性;多酚氧化酶活性;线性回归?中图分类号:S511文献标识码:A引 言黑米多为长粒形,米粒表皮呈黑色、紫色及褐色。黑米色素属于黄酮类花色素。目前,黑米可供直接食用、熬粥、制糕、做饼、酿酒以及用于食疗、药疗,也可从中提取自然色素用于食品工业。根据 本草纲目!记载,黑米具有滋阴补肾、健脾胃、明目活血之功效。黑米中的功能因子黄酮类花色素
3、,具有维持血管正常渗透压;减轻血管脆性;防止血管破裂和止血作用;能够降低血压;改善心肌营养;降低心肌耗氧量;对先天性过敏皮炎很有效果;黑米还有接骨生肌的功效;对头晕、贫血、白发也有疗效;还有延缓衰老、改善缺铁性贫血、抗应激反应以及免疫调节;抑制癌细胞和抗癌作用等 1。苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine Ammonia Lyase,简称PAL)是莽草酸途径中的关键酶,它催化由苯丙氨酸到各种酚类物质的第一步反应,为多种酚类及黄酮类终产物提供前体物质。多酚氧化酶(PolyphenolOxidase,简称 PPO)是催化酚类物质氧化聚合形成色素的重要酶类。类黄酮代表了一大类植物次生代谢产物,其
4、中包括花青苷、黄酮醇、黄烷酮和异黄酮等,有些类黄酮物质是花色素生物合成途径的中间产物和底物。本文通过统计分析的方法,研究它们之间的关系,希望能为花色素的实验室合成提供理论基础,从而能够人工生产这些花色素。1材料与方法1.1供试材料紫米纯系黑珍米。1.2方法1.2.1发育过程中糙米花色素、类黄酮及多酚的提取和测定参考刘敬兰与 Antonia Procissi etc.2,3的方法稍加修改。将处于不同发育时期糙米的果皮和种皮小心完整地剥下,放入 1.5mL离心管,每管只放一粒种子的果皮和种皮。用尖镊子沿管壁将皮磨碎,加入 0.9mL 甲醇,滴 2滴2N 盐酸(酸化甲醇作对照)。放入 65 水浴箱暗
5、保温 1h。10,000rpm离心 2m in,取 100?L上清液,按照糙米色由浅至深的顺序用 BECKMAN DU800分光光度计测 280nm(总酚)、325nm(类黄酮)、530nm(花色素)、600nm 下的吸光度。以#OD530-OD600=0.1作为花色素的单位 4。1.2.2多酚氧化酶的提取和活力测定参考胡桂兵等5的方法稍加改动。取一粒种子的果皮与种皮,放入 1.5mL的离心管,加 3滴磷酸缓冲液(pH5.5),在 4 冰箱中研磨,补足磷酸缓冲液至 1mL,保温30m in;加 0.4mL 0.1mol/L邻苯二酚(对照用磷酸缓冲液,无邻苯二酚),混匀,35 水浴 15m in
6、,10000rpm离心 2m in;取 100?L上清,用 BECKMAN DU800测 325nm下吸光度,以磷酸缓冲液为对照。隔 15m in再测一次。酶活力以每15nin光密度变化 0.01为一个活性单位。1.2.3苯丙氨酸解氨酶的提取和活力测定参考叶小利等6的方法稍加改动。取一粒种子的果皮与种皮,放入 1.5mL的离心管,加 3滴硼酸缓冲液(pH 8.7),在 4 冰箱研磨,保温 30min,补足硼酸缓冲液至 1mL,加0.4mL 0.02mol/L苯丙氨酸(对照用硼酸缓冲液,无苯丙氨酸),混匀,30 水浴 30m in,加 0.25mL 5mol/L HCL停止反应,10000rpm
7、离心 2min,取 100?L 上清液,用 BECKMAN DU80055第 5卷第 3期潍坊高等职业教育Vo.l 5 No.32009年 9月W eifang H igherVocationalEducationSep.2009测 290nm下吸光度。隔 15min再测一次。酶活力以每 15min光密度变化 0.01为一个活性单位。1.3数据处理数据处理及统计方法参照荣廷昭等7的方法。为了方便统计,用 x1代表总酚;x2:类黄酮;x3:苯丙氨酸解氨酶活性;x4:多酚氧化酶活性;y:花色素;n=10:重复次数;m=4:因变量个数。2结果与统计分析2.1一级数据%x1=23.7246,%x2=3
8、.1937,%x3=0.121%x4=0.1208,%y=4.5198%x21=56.71470788,%x22=1.0672494%x23=1.0672494,%x24=0.00157116%y2=3.53648584,%x1x2=7.69140555%x1x3=0.31130642,%x1x4=0.28985086%x2x3=0.04666169,%x2x4=0.03915344%x3x4=0.00171769,%x1y=11.35829793%x2y=1.63665528,%x3y=0.09330255%x4y=0.064215142.2二级数据SSx=%x2-(%x)2n?SSy=%y
9、2-(%y)2nSPxy=%xy-%x%ynx?=%xn?y?=%ynSS1=0.429043364,SS2=0.047277441SS3=0.00239748,SS4=0.000111896SSy=1.493626636,SP12=0.114480048SP13=0.02423876,SP14=0.003257692SP23=0.00801792,SP24=0.000573544SP34=0.00025601,SP1y=0.635253222SP2y=0.193166754,SP3y=0.03861297SP4y=0.009615956,x?1=2.37246x?2=0.31937,x?3=
10、0.0121,x?4=0.01208,y?=0.451982.3多元线性回归2.3.1四元线性回归方程的确立及测验由二级数据得正规方程组SS1b1+SP12b2+SP13b3+SP14b4=SP1ySP21b1+SS2b2+SP23b3+SP24b4=SP2ySP31b1+SP32b2+SS3b3+SP34b4=SP3ySP41b1+SP42b2+SP43b3+SS4b4=SP4y将上述方程组的系数组成系数矩阵 A,常数组成常数项矩阵 K,矩阵 B是未知数。A=0.429043364?0.114480048?0.02423876?0.0032576920.114480048?0.0472774
11、41?0.00801792?0.0005735440.02423876?0.00801792?0.00239748?0.000256010.003257692?0.000573544?0.00025601?0.000111896K=0.6352532220.1931667540.038612970.009615956?B=b1b2b3b4求 A矩阵的逆矩阵 A-1得(Cij)4&4A-1=(Cij)4&4=8.708644132?-15.77035881?-23.32648069?-112.2207576-15.77035881?79.620431?-145.3890845?360.77635
12、58-23.32648069?-145.3890845?1293.571129?-1443.553715-112.2207576?360.7763558?-1443.553715?12842.23591解出 B矩阵得 biB=b1b2b3b4=A-1 K=0.5060706573.217154167-6.83508534666.15187889?=y?+b1x?1+b2x?2+b3x?3+b4x?4得 y依 x1,x2,x3和 x4的四元线性回归方程:y=-2.492525081+0.506070657x1+3.217154167x2-6.835085346x3+66.15187889x4四元
13、回归关系的假设检验(表 1)表 1?四元线性回归的方差分析表Table 1 VariableAnalysis ofQuaternary Linear Regression变异原因DFSSMSFF0.05,(4,5)四元回归41.3151208540.3287802149.209231499*5.19离回归50.1785057820.035701156总 和91.493626636?F F0.05,(4,5),所以四元线性回归为显著。偏回归系数的测验(表 2)经过测验只有 x4对 y的偏回归系数达显著水平。所以先剔除 Upi最小且不显著的自变量 x1,然后作三元回归分析。2.3.2三元线性回归方
14、程的确立与测验b i=bi-b1Ci1/C11(i(1)?C ij=Cij-Ci 1C1 j/C11?a=y?+b 2x?2+b 3x?3+b 4x?4得三元回归方程 y=3.721396504+4.133590265x2-5.479553161x3+72.67317333x4三元线性回归关系的测验(表 3)56?潍坊高等职业教育2009年 9月?表 2?偏回归系数的测验表Table 2 Test ofBiasedRegression Coefficient变异来源DFSS=UpiMSFF0.05F0.01因 x1的偏回归10.0294084250.0294084250.8237387336.
15、6016.26因 x2的偏回归10.1299927770.1299927773.641136354因 x3的偏回归10.0361158270.0361158271.011615058因 x4的偏回归10.3407561670.3407561679.544681606*离回归50.1785057820.035701156表 3?三元线性回归的方差分析表Table 3V ariableAnalysis ofTernary L inear Regression变异原因DFSS=Uy.234)MSFF0.01多元回归31.2857124290.4285708112.36772078*9.78离回归60
16、.2079142070.034652368总和91.493626636?F F0.01,所以该回归在 0.01水平上极显著。偏回归系数的测验(表 4)表 4?偏回归系数的测验表Table 4 Test ofBiasedRegression Coefficient变异原因DFSS=UpiMSFF0.05F0.01因 x2的偏回归10.3346232080.0809521969.656575492*5.9913.74因 x3的偏回归10.024389362-0.0044509760.703829586因 x4的偏回归10.4634365840.00637699713.37387921*离回归60.
17、2079142070.034652368?经过测验 b2 在 0.05水平显著,b3 在 0.05水平不显著,b4 在 0.05水平显著。所以将 x3从三元回归方程中剔除,作二元回归分析。2.3.3二元线性回归方程的确立与测验bi=bi-b3Ci 3/C33?Ci;=Cij;-Ci3C3 j/C33Cij=Cij-Ci 1C1 j/C11?=y?+b2x?2+b4x?4得二元回归方程:y=-1.343419112+3.359354487x2+59.81142956x4二元回归关系的测验(表 5)表 5?二元线性回归的方差分析表Table 5V ariableAnalysis ofDualLin
18、ear Regression变异来源DFSSMSFF0.01多元回归21.2240596770.612029839115.89293022*9.55离回归70.2695669590.038509566总和91.493626636?所以该回归在 0.01水平上极显著。偏回归系数的测验(表 6)表 6?偏回归系数的测验表Table 6 Test ofBiasedRegression Coefficient变异来源DFSS=UpiMSFF0.05F0.01因 x2的偏回归10.4261139450.42611394511.06514535*5.5912.25因 x4的偏回归10.7754221270
19、.77542212720.13583137*离回归70.2695669590.038509566?b2达显著水平,b4达极显著水平,均为正相关。因此建立二元回归方程y=-1.343419112+3.359354487x2+59.81142956x4为最优回归方程。用标准偏回归系数检测各自变量对 y的相对影响bi s=biSSiSSy?b2S=0.572371273b4S=0.572569803所以类黄酮对花色素的相对影响为 0.5723,多酚氧化酶活性对花色素的相对影响为 0.5725。57?第 3期韩磊,汪旭东,吴先军:多元线性回归模型在水稻紫米花色素与相关物质分析中的应用?2.3.4复相关
20、分析复相关系数及测验R2y.24=Uy.24/SSy=0.819521859Ry.24=0.905274466?F=R2y.24/2(1-R2y.24)/7=15.89293025查表 F0.01(2,7)=9.55,F F0.01(2,7),所以 Ry.24达极显著。表明花色素与类黄酮和多酚氧化酶活性的复相关为极显著。且由 Ry.242=0.819521859可知,花色素变异平方和的 81.95%可由类黄酮和多酚氧化酶的线性关系来说明。简单相关系数决定系数:r2ij=SP2ijSSi SSj简单相关系数:rij=r2ij偏相关系数:rij=rij-rikrjk(1-r2ik)(1-r2jk)
21、r2y2=0.528407232?ry2=0.726916248r2y4=0.553258791?ry4=0.74381368r224=0.062182039?r24=0.249363267r24 y=-0.634700929?ry2.4=0.836488933ry4.2=0.845894759偏相关系数的标准误为Sr.ij=1-r2ij10-3?t=rij(1-r2ij)/7对于 ry2.4=0.836488933,?t=4.038698987对于 ry4.2=0.845894759,?t=4.196171032对于 r24 y=-0.634700929,?t=-2.173074999查表
22、t0.05,7=2.365,t0.01,7=3.499,所以 ry2.4,ry4.2极显著,r24.y不显著。对于 ry2.42=0.8364889332=0.699713735,说明若多酚氧化酶活性固定,则花色素的变化有 70%可由类黄酮的线性关系来说明。同样对于 ry4.22=0.8458947592=0.715537943,说明若类黄酮固定,则花色素的变化有 71.6%可由多酚氧化酶活性的线性关系来说明。3讨论花色素合成起始于苯丙氨酸,合成过程中有许多中间产物,其中包括总酚、黄酮类物质。酚类物质被 PPO氧化成醌而呈现颜色,有些类黄酮可以直接作为花色素合成的底物。合成过程中有许多酶的参与
23、,如 PAL,CA4H,4CL,CHS,F3H,DRF,ANS,3GT,F3 H,F3 5 H,我们只选取PAL进行研究,因为 PAL的提取和活力测定技术较为成熟,而且是花色素合成过程的第一个酶。总酚与花色素的相关性不显著,PPO与花色素的正相关达极显著,可能因为以总酚估计种类繁多的酚类物质对花色素的贡献不具有代表性;类黄酮与花色素的正相关达显著水平,PAL的活性与花色素的相关性不显著,可能因为生物体内许多次生物质的合成都要经过 PAL 的催化,生物体通过自身的调控使得 PAL不能作为相关次生物质合成的限制因子,这样各种次生代谢才能够得以正常进行。致谢:我们感谢四川农业大学水稻研究所的徐正军研
24、究员提供便利的实验室条件,感谢殷兆晴老师提供统计参考工具,感谢肖彬、谭权和罗全新等老师对田间材料的管理。参考文献:1韩磊,汪旭东,徐建第,汪秀志,张红宇.有色稻米研究现状分析 J.中国稻米,2003,(5):5 8 2 Antonia Prociss,iSilvana Dolfin,i Angela Ronch,iandChiara Tonelli L ight-Dependent Spatial and Te mporal Ex?pression of Pigment ReguLatory Genes in Developing M aizeSeeds.The P lantCel,l 199
25、7,9:1547 1457 3刘敬兰,陈连文.黑米色素的提取和稳定性的初步研究 J.河北师范大学学报,1995,19(2):71 74 4 叶小利,李加纳,唐章林,梁颖.甘蓝型油菜种皮色泽及相关性状的研究 J.作物学报 2001,27(5):550 556 5胡桂兵,李大成,李平,欧阳若,高飞飞,王卫华.荔枝果皮色素酚类物质与酶活性的动态变化 J.果树科学,2000,17(1):35 40 6叶小利,李加纳,唐章林.甘蓝型黑籽和黄籽油菜种子发育过程中种皮色泽差异研究 J.中国油料作物学报,2001,23(2):14 18 7荣廷昭,李晚忱主编.田间试验与生物统计 M.成都:四川大学出版社,20
26、01TheApplication ofMuLtivariate LinearRegressionModel in theAnalysis ofAnthocyanidin and ItsCorrelative Factors in PurpleRiceHAN Lei1,WANG Xudong2,WU X ianjun2(1.Weifang Vocational College,Weifang 261031,China;2.Rice Institute of Sichuan AgricuLtural University,Wenjiang 611130,China)Abstract:The qua
27、ntity of anthocyanidin,flavonoid,polyphenols,Phenylalanin a mmonialyase(PAL)andPolyphenol oxidase(PPO)were extracted andm ensurated in the develop m ent of purple rice.The resuL tswereanalysed.Statistical analysis showed:biased regression coefficients of polyphenols and PAL activity to antho?cyanidi
28、n were not up to significant leve,lthose of flavonoids and PPO activity to anthocyanidinwere up to sig?nificant and highly significant leve,l respectively.Opti m ization dual regression equationwas constructed.Therelative influences of flavonoids and PPO activity to anthocyanidin were 0.5723 and 0.5
29、725,respectively fromthe point of nor mal biased regression coefficien.t Duplicate correlative coefficient of flavonoids and PPO activi?ty to anthocyanidinwasup to highly significant leve,l and biased correlative coefficient of flavonoids to PPO ac?tivity was not up to significant leve.lKey words:anthocyandin;flavonoid;polypheno;l PAL activity;PPO activity;linear regression58?潍坊高等职业教育2009年 9月?