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1、老芒麦种质资源遗传多样性的 SAP 分析顾晓燕1，郭志慧1，张新全1，周永红2，白史且3，张昌兵3，蒋忠荣4，刘新1，周朝杰1，马啸1*(1 四川农业大学动物科技学院草业科学系，四川 雅安 625014;2 四川农业大学小麦研究所，四川成都，611130;3 四川省草原科学研究院，四川 成都 611731;4 四川省甘孜藏族自治州畜牧科学研究所，四川 康定 626000)摘要:利用 SAP 标记，对来自亚洲的 84 份老芒麦种质的遗传多样性和遗传关系进行了分析。23 个引物组合共产生 337 条扩增带，其中 203 条为多态性带，多态性比率为 60 24%。各种质间遗传相似系数的变幅为 0 7
2、83 0 965，平均值为 0 865。来自于青藏高原和蒙古的种质间的平均遗传相似性(GS)值最小(0 830)，而来自于俄罗斯和蒙古的种质间的平均 GS 值最大(0 897)。对 84 份种质的聚类分析表明，供试种质可以划分成 2 大类，而且聚类结果与原始相似性矩阵间具有很高的吻合度(r=0 88)。同时，主向量分析(PCoA)也得到了与聚类分析类似的结果。方差分析(AMOVA)表明在总的遗传变异中有 79 62%发生在地理类群内，有 20 38%发生在类群间(ST=0 204)，类群间和类群内的变异均为极显著(P 0 0001)。基于各地理类群间 ST值进行的聚类分析也表明青藏高原类群明显
3、区别于其他地理类群。这种聚类模式可能依赖于种质地理来源赋予其的特殊生态地理适应性。本研究结果对于今后老芒麦种质的利用和品种选育提供了有益信息。关键词:老芒麦;种质资源;遗传多样性;SAP中图分类号:S543 03;Q943文献标识码:A文章编号:1004-5759(2014)01-0205-12DOI:10 11686/cyxb20140125研究和了解植物种质间的遗传变异，对于其在育种上的有效利用非常有益。根据遗传变异的信息，可以确定具有优异农艺性状的亲本组合1，拓宽植物品种的遗传基础，防止其育种进程中的渐进性遗传衰退。另外，遗传多样性还可以为物种保护计划的制定和实施提供参考和借鉴。老芒麦(
4、Elymus sibiricus)，别名西伯利亚野麦草，是披碱草属的模式种，为多年生、疏丛型、自花授粉的异源四倍体禾草，具有 StStHH 的染色体组构成2。它是欧亚大陆的广布种，在北美的阿拉斯加和加拿大北部也有少量分布3。老芒麦一般生长于湿润的草地、河滩、灌木丛中或森林边缘地带。在中亚及中国新疆、内蒙古和青藏高原地区，老芒麦作为一种重要的牧草在草地畜牧业中发挥了巨大作用4-6。目前对老芒麦种质的遗传多样性研究很少。袁庆华等7 发现 21 份老芒麦种质在 13 个农艺和形态学性状上存在高度变异。但形态性状具有不少缺点，如数目有限、易受环境影响和非均匀分布等。DNA 分子标记的发展，极大地增加了
5、研究遗传多样性的方法，它可以揭示整个基因组上可能存在的大量变异8。序列相关扩增多态性(sequence related amplified polymorphisms，SAPs)是一种简单的分子标记系统，已经在植物分子作图和基因定位上被证明其有效性9。该技术是基于正向和反向引物对模板 DNA 的 PC(polymerase chain reaction，聚合酶链式反应)扩增，引物具有 3 个明显不同的序列框:5端存在的 10 11 个随机碱基序列，紧跟着 CCGG(正向引物)或AATT(反向引物)的碱基序列，最后是位于 3端的 3 个选择性碱基。从技术的可操作性来看，每个引物 5端的 10个随
6、机碱基序列可以促进任意序列的扩增，即类似于 APD(random amplified polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA 标记)标记的结果10。正向引物的 CCGG 序列可以优先与具有丰富 GC 碱基的外显子序列退火结合，而反向引物的 AATT 序列可优先与具有丰富 AT 碱基的内含子和启动子序列退火结合9。引物 3端的 3 个选择性碱基可以对模板 DNA 进行选择，与在 AFLP(amplified fragment length polymorphism，扩增片段长度多态性)选择性扩第 23 卷第 1 期Vol 23，No 1草业学报ACTA PATACULTUAE SI
7、NICA205 2162014 年 2 月*收稿日期:2013-08-19;改回日期:2013-09-11基金项目:国家科技支撑计划(2011BAD17B03，2012BAD13B06)，四川省科技支撑计划(2011NZ0098-11)和国家自然科学基金(31101763)资助。作者简介:顾晓燕(1989-)，女，甘肃兰州人，在读硕士。E-mail:mobei_ttxs126 com*通讯作者。E-mail:maroar126 com增中使用的引物的 3端很相似11。基于这种独特的引物设计，SAP 标记具有相对于其他标记更好的重复性、稳定性和简易性。SAP 标记已经应用于芸苔属(Brassic
8、a)9、南瓜属(Cucurbita)12、野牛草(Buchloe dac-tyloides)13、紫花苜蓿(Medicago sativa)14、黑麦草(Lolium)15 和芍药属(Paeonia)16。Budak 等17 发现在揭示遗传关系相近的野牛草品种间的遗传多样性时 SAP 标记比 SS(simple sequence repeats，简单重复序列)、ISS(inter-simple sequence repeat，简单序列重复区间扩增多态性)和 APD 标记更加有效。比较具有不同地理分布的植物种质，是进化生物学和植物育种学的重要研究内容。因此，老芒麦地理分布的遗传变异研究，对于收集
9、和管理其种质资源非常重要。然而，目前还未见对不同国家或大的生态区来源的老芒麦种质的遗传多样性水平研究的报道。本研究的目的在于:1)评价 SAP 标记在老芒麦种质研究中的有效性;2)确定来自于3 个国家的84 份老芒麦种质间的遗传关系;3)检测遗传多样性水平与地理来源的关系。这是首次关于利用 SAP 标记检测老芒麦遗传多样性的研究报告。1材料与方法1 1植物材料84 份老芒麦供试种质分别从美国国家遗传资源库(NPGS，USDA)、四川农业大学小麦研究所和四川草原科学研究院获得(表 1)。种质的护照信息显示它们分别采集自俄罗斯(西伯利亚地区为主)、蒙古国、中国新疆、中国的青藏高原地区(川西北高原为
10、主)。每份材料取 10 20 粒种子，置于有盖培养皿内的吸水滤纸上萌发。萌发后的种子转移至内含砂子 泥炭混合基质的盆钵内生长，盆钵置于温室内。植株生长至开花期进行形态学鉴定，标本凭证保存于四川农业大学草业科学系。1 2DNA 提取每份种质采集 5 10 个单株的等量新鲜叶片，用液氮研磨成粉，保存于 80低温冰箱内。基因组 DNA 提取参照 Doyle18 描述的 CTAB(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)法进行。对比已知浓度的标准 DNA 与样本 DNA 在 0 8%(w/v)琼脂糖凝胶上的电泳图谱，利用 Quantity One
11、 软件(Bio-ad，USA)，计算出老芒麦各种质的 DNA 浓度。将所有样本的基因组 DNA 用 0 1 TE 缓冲液 1 mmol/L Tris-HCl，01 mmol/L EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸)，pH 8 0 稀释至 10 ng/L，储存于 80冰箱内，供 SAP 扩增使用。1 3SAP 扩增引物由上海生工生物工程技术公司合成(表 2)。PC 反应混合液(20 L 总体积)由 0 2 mmol/L dNTPs，03 mol/L 正向和反向引物，2 5 mmol/L Mg2+，10 Taq buffer，1 U Taq
12、DNA 聚合酶(北京天根生物技术公司)，40ng 模板 DNA 组成。扩增在 PTC-200 热循环仪内进行(MJ esearch，Waltham MA，USA)，采用以下 PC 程序:94初变性 5 min;94变性 1 min，35退火 1 min，72延伸 2 min，共 5 个循环;在随后的 30 个循环中，退火温度增加至 50;最后 72延伸 8 min。PC 扩增产物在 2%琼脂糖凝胶(含有 0 1 mg/mL 的溴化乙锭)上用 0 5 TBE(tris-borate-edta，三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸)缓冲液进行电泳分离，并用 BIO AD 自动凝胶成像系统照相保存。
13、1 4数据分析只记录清晰可辨的 SAP 扩增条带，排除弱带和弥散带。对所有材料，有带(即具有相同分子量)记作 1，无带记作 0，形成原始二元数据矩阵。用 NTSYS-pc2 11x 软件分析二元矩阵，计算各种质间的 Nei 和 Li19 遗传相似系数，利用 SAHN 模块，基于UPGMA 法进行聚类分析，构建聚类树形图。利用 NTSYS-pc2 11x 软件基于聚类树矩阵计算其协表征矩阵(co-phenetic matrix)，再利用 Mantel 检验，计算遗传相似性(GS)矩阵与协表征矩阵间的相关系数，从而反映聚类结果与 GS 矩阵的符合度20。利用 WINBOOT 软件21 基于 boo
14、tstrap 重抽样法，对聚类树形图节点分支的可靠性进行了检测22，设定重复抽样次数为 1000。除聚类分析外，利用 NTSYS-pc2 11x 软件，基于 GS 矩阵还进行了主向量分析(PCoA，principal coordinates analysis)，特征向量以二维形式显示。PCoA 分析可以直观地观察各种质间的相关程度，这是因为二维图上各点之间的距离，反映了各点所代表的各种质之间的遗传相似性。602ACTA PATACULTUAE SINICA(2014)Vol 23，No 1表 1老芒麦种质材料地理来源Table 1List of geographical origin of E
15、 sibiricus germplasm material序号No材料编号Accession code地理来源Geographical origin序号No材料编号Accession code地理来源Geographical origin1W6 21536蒙古 Mongolia43Y0737新疆和静 Hejing，Xinjiang2W6 21365蒙古 Mongolia44Y0488新疆和静 Hejing，Xinjiang3PI 639813蒙古 Mongolia45Y0473新疆和静 Hejing，Xinjiang4PI 639771蒙古 Mongolia46PI 595174新疆 Xinj
16、iang5PI 634231蒙古 Mongolia47Y0760新疆库车 Kuche，Xinjiang6PI 634230蒙古 Mongolia48Y0909新疆木垒 Mulei，Xinjiang7PI 628726蒙古 Mongolia49PI 595169新疆 Xinjiang8PI 610886蒙古 Mongolia50Y1690新疆清河 Qinghe，Xinjiang9PI 610876蒙古 Mongolia51Y0822新疆特克斯 Tekesi，Xinjiang10PI 610866蒙古 Mongolia52Y0549新疆温宿 Wensu，Xinjiang11PI 610862蒙古
17、Mongolia53PI 628677新疆焉耆 Yanqi，Xinjiang12PI 610857蒙古 Mongolia54Y0860新疆伊吾 Yiwu，Xinjiang13PI 610850蒙古 Mongolia55Y0867新疆伊吾 Yiwu，Xinjiang14PI 610860蒙古 Mongolia56Y0811新疆昭苏 Zhaosu，Xinjiang15PI 639791蒙古 Mongolia57Y005新疆乌鲁木齐 Wulumuqi，Xinjiang16PI 639807蒙古 Mongolia58Y0486新疆乌鲁木齐 Wulumuqi，Xinjiang17PI 611013俄罗斯
18、西伯利亚阿尔泰区 Altay，Siberia，ussia59PI 595162新疆 Xinjiang18PI 610994俄罗斯西伯利亚 Siberia，ussia60PI 499458甘肃山丹 Shandan，Gansu19PI 598795俄罗斯西伯利亚阿尔泰山 Altay Mountain，Siberi-a，ussia6162PI 636676ZY3117甘肃夏河 Xiahe，Gansu甘肃夏河 Xiahe，Gansu20PI 598800俄罗斯西伯利亚阿尔泰区 Altay，Siberia，ussia63Y2906甘肃合作 Hezuo，Gansu21PI 598789俄罗斯西伯利亚赤塔
19、Chita，Siberia，ussia64204451甘肃合作 Hezuo，Gansu22PI 598787俄罗斯阿穆尔州 Amurskaya Oblast，ussia65204441青海青海湖 Qinghai Lake，Qinghai23PI 598781俄罗斯布利亚特 Buryatiya，ussia66504463青海青海湖 Qinghai Lake，Qinghai24PI 598780俄罗斯远东地区滨海边疆区 The seaside borderand east in ussia6768204404204251西藏日喀则 ikaze，Xizang西藏丁青县 Dingqing，Xizang
20、25PI 598479俄罗斯阿尔泰区 Altay，ussia69W6 23559四川红原 Hongyuan，Sichuan26PI 598777俄罗斯哈巴罗夫斯克区 Khabarovsk，ussia70PI 639859四川红原 Hongyuan，Sichuan27PI 406467俄罗斯西伯利亚 Siberia，ussia71ZY3040四川红原 Hongyuan，Sichuan28PI 370673俄罗斯克拉斯诺亚尔斯克边疆区 KrasnoyarskiyKray，ussia72川草 2 号Chuancao No2四川若尔盖 uoergai，Sichuan29PI 345600俄罗斯克拉斯诺
21、亚尔斯克边疆区 KrasnoyarskiyKray，ussia73204081四川红原龙日坝 Longriba，Hongyuan，Sichuan30PI 345599俄罗斯赤塔州 Chita，ussia74204089四川红原刷金寺 Shuajingsi，Hongyuan，Sichuan31PI 326266俄罗斯阿穆尔州 Amurskaya Oblast，ussia75205185四川红原刷金寺 Shuajingsi，Hongyuan，Sichuan32PI 598782俄罗斯布利亚特 Buryatiya，ussia76205171四川若尔盖包座 Baozuo，uoergai，Sichuan
22、33PI 610991俄罗斯布利亚特 Buryatiya，ussia77205172四川若尔盖求吉 Qiuji，uoergai，Sichuan34PI 326267俄罗斯赤塔州 Chita，ussia78205173四川若尔盖巴西 Baxi，uoergai，Sichuan35PI 598478俄罗斯新西伯利亚 New Siberia，ussia79205179四川若尔盖巴西 Baxi，uoergai，Sichuan36PI 557455俄罗斯 ussia80205226四川阿坝麦尔玛乡 Maierma，Aba，Sichuan702第 23 卷第 1 期草业学报 2014 年续表 1Contin
23、ued序号No材料编号Accession code地理来源Geographical origin序号No材料编号Accession code地理来源Geographical origin37Y2027新疆布尔津 Buerjin，Xinjiang81205165四川松潘 Songpan，Sichuan38Y1823新疆阿勒泰 Aletai，Xinjiang82205119四川稻城木拉乡 Mula，Daocheng，Sichuan39Y0877新疆巴里坤 Balikun，Xinjiang83205151四川理塘 Litang，Sichuan40Y1914新疆哈巴河 Haba river，Xinji
24、ang84SAU001(205083)四川雅江高尔寺山 Gaoersi mountain，Yajiang，Sichuan41Y1971新疆哈巴河 Haba river，Xinjiang42Y2003新疆哈巴河 Haba river，Xinjiang表 2SAP 正向和反向引物序列Table 2Sequences of forward and reverse SAP primers正向引物 Forward primers反向引物 everse primersMe1，5-TGAGTCCAAACCGGATA-3Em1，5-GACTGCGTACGAATTAAT-3Me2，5-TGAGTCCAAACCG
25、GAGC-3Em4，5-GACTGCGTACGAATTTGA-3Me3，5-TGAGTCCAAACCGGAAT-3Em5，5-GACTGCGTACGAATTAAC-3Me4，5-TGAGTCCAAACCGGACC-3Em8，5-GACTGCGTACGAATTCTG-3Me5，5-TGAGTCCAAACCGGAAG-3Em9，5-GACTGCGTACGAATTCGA-3Me9，5-TGAGTCCAAACCGGTAG-3Em10，5-GACTGCGTACGAATTCAG-3Me10，5-TGAGTCCAAACCGGTTG-3Em11，5-GACTGCGTACGAATTCCA-3Me11，5-TGA
26、GTCCAAACCGGTGT-3Em12，5-GACTGCGTACGAATTATG-3Me12，5-TGAGTCCAAACCGGTCA-3Em13，5-GACTGCGTACGAATTAGC-3Em14，5-GACTGCGTACGAATTACG-3Em15，5-GACTGCGTACGAATTTAG-3Em16，5-GACTGCGTACGAATTTCG-3Em19，5-GACTGCGTACGAATTCCG-3对每对引物扩增的条带而言，下列参数即:总扩增带数(total number of bands，TNB)、多态性带数(number ofpolymorphic bands，NPB)、多态性条带百
27、分比(percentage of polymorphic bands，PP)、多态性信息量(polymorphicinformation content，PIC)也可称作杂合度(heterozygosity，H)、条带信息指数(band informativeness，BI)、分辨力(resolving power，P)和标记指数(marker index，MI)按下文所述进行计算。PP=NPBs/TNB，PICi=2fi(1 fi)，式中，PICi是第 i 个标记的 PIC 值，fi是扩增带等位基因(即记为“1”的条带)的频率，而(1 fi)是无效带等位基因(即记为“0”的条带)的频率23。
28、对每个引物组合而言，计算 PIC 应该求平均值 或称之为平均杂合度(averageheterozygosity，Hav)，即 PICav=Hav=PICi/N，式中，N 是各引物对产生的多态性带数(NPB);BIi=1 (2|0 5 fi|)，式中，BIi是第 i 个标记的 BI 值，fi是各种质具有的扩增带(即记为“1”的条带)的频率，而 P=BIi。对每对 SAP 引物而言，计算 BI 时应该求平均值，即 BIav=BIi/N，式中，N 是各引物对产生的多态性带数(NPB)。对每个引物组合而言，标记指数(MI)可以按下述公式计算:MI=NPB PICav24，式中，NPB 是每对 SAP
29、引物组合产生的多态性条带数。为了解老芒麦种质不同地理类群间和类群内的 SAP 变异，利用 ALEQUIN 3 1 软件进行了分子变异方差分析(AMOVA)25，计算类群间的遗传分化系数 ST。同时利用 AMOVA 分析，还可以得到不同地理类群间的遗传距离(称之为 统计量)26。方差成分及类群间遗传距离的显著性检测采用 9999 次随机置换进行。802ACTA PATACULTUAE SINICA(2014)Vol 23，No 12结果与分析2 1SAP 分析从 140 个引物组合中，筛选出 23 个可以产生清晰可辨条带的引物组合。这 23 个引物组合对 84 份老芒麦种质共产生 337 条扩增
30、带，分子量范围为 75 1580 bp(图 1)。其中，203 条(60 24%)为多态性带(表 3)。单个引物组合产生的多态性带为 2 19 条。平均每个引物组合产生 14 7 条带，其中多态性带为 8 8 条。单个引物的PIC 值在 0 151 0 438 之间变化，平均值为 0 284(表 3)。引物组合的平均条带信息指数值为 0 408，变幅为0 230(Em9+Me15)0 696(Em12+Me16);23 个引物组合的标记分辨力(P)的变幅为 1 119(Em12+Me5)9 333(Em1+Me10)，平均值为 3 631。具有较高的分辨力和标记指数的引物组合一般同时具有较高的
31、多态性，能够辨别更多的种质。图 1引物组合 Me5+Em19 对 84 份老芒麦种质的扩增带型Fig 1SAP profile of E sibiricus collections amplified using the primer pair Me5+Em19a=No1 44，b=No45 84，M=marker2 2种质间的遗传相似性84 份种质间的遗传相似性(GS)系数变幅为 0 783(204251 与 PI610886)0 965(205119 与 205151)，平均值为0 865。图2 描述了3486 个 GS 值的频数分布。前2 个最高的 GS 值频数分别分布在0 886 0
32、891 和0 8800 885。约 95%的 GS 值分布在 0 810 0 921 之间，只有 0 8%的 GS 值高于 0 93，同时也只有 0 1%的 GS 值低于 0 80。这说明供试材料间的遗传关系较近。2 3聚类系统树和主向量分析(PCA)对种质的划分基于SAP标记的UPGMA系统树(图3)，揭示了84份老芒麦种质间的遗传关系。系统树可以在不同的GS902第 23 卷第 1 期草业学报 2014 年表 323 对 SAP 引物对 84 份老芒麦种质产生的总扩增带数(TNB)、多态性带数(NPB)、多态性条带百分比(PP)、多态性信息量(PIC)、条带信息指数(BI)、条带分辨力(P
33、)和标记指数(MI)Table 3Total number of bands(TNB)，number of polymorphic bands(NPB)，percent polymorphism(PP)，polymorphicinformation content(PIC)，band informativeness(BI)，resolving power(P)and marker index(MI)ofthe 23 primer combinations used to generate SAP markers in 84 E sibiricus accessions引物对Primer pai
34、rs总扩增带数TNB多态性带数NPB多态性条带百分比PP(%)多态性信息量PIC条带信息指数BI条带分辨力P标记指数MIEm1+Me11496429035105424 8813157Em1+Me51695625036605534 9763292Em1+Me10241979170326049193336 198Em2+Me15171270590280038946673 363Em3+Me41496429019502482 4761752Em3+Me9141071430265037333572 650Em3+Me111585333027003512 8102162Em4+Me13169562502
35、4203122 8102175Em4+Me16181372220259034845243 367Em5+Me191585333027404203 3572190Em9+Me151066000015102301 3810906Em9+Me191674375021802591 8101526Em10+Me5181161110270039643572 974Em10+Me151364615022002781 6671321Em10+Me16151066670241031731672 411Em10+Me191077000019702351 6431377Em11+Me8178470603660557
36、4 4522925Em11+Me9191368420318048262624 129Em11+Me121254167020902761 3811047Em11+Me141176364037005683 9762591Em11+Me161176364033805073 5482363Em12+Me5722857035905601 1190717Em12+Me161585333043806965 5713502总值 Total3372036024028604118352458 024平均值 Average1478 85892028404083 6312503水 平上将供试种质划归为不同的组群。在G
37、S=图 2基于 203 条多态带计算出的 84 份老芒麦种质间的遗传相似系数的分布Fig 2The distribution of genetic similarities among84 E sibiricus accessions based on SAP data0 84 的水平上，供试种质可以被划分成 2 个明显不同的组群。第组群包括来自于俄罗斯(20 份)、蒙古(16 份)和中国新疆(23 份)的种质。第组群包括全部来自于青藏高原的 25 份种质。第组群又可划分为 3 个亚组:亚组 1 包括甘肃种质 3 份、青海种质 2份，西藏种质 1 份;亚组 2 包括 13 份四川种质和 2 份
38、甘肃种质;亚组 3 包括 3 份四川种质和 1 份西藏种质。协表征矩阵与 GS 矩阵间的相关系数达 0 88，说明聚类结果与原始 GS 矩阵能较好地吻合。基于 Bootstrap分析所得的对系统树分支节点置信度的支持值(boot-strap value)被标注在图 3 中聚类图上。共有 19 个分支节点具有高于 50%的置信度。第和第组分支012ACTA PATACULTUAE SINICA(2014)Vol 23，No 1节点被 91%和 100%的 bootstrap 值支持，表明了青藏高原来源的种质类群()与其他地理来源的种质类群()具有明显差异。基于 84 份种质 GS 矩阵的主向量分
39、析(PcoA)的结果表明，第 1 和第 2 主向量分别可以解释 16 7%和 5 8%的遗传变异。依据图 4 上各种质间的空间关系，可以直观地看出 84 份材料被明显划分成两大组，其中青藏高原组又可划分成 3 个亚组。这与 UPGMA 聚类结果保持一致。图 3基于 SAP 数据利用 UPGMA 法获得的老芒麦种质的聚类树形图Fig 3Dendrogram of E sibiricus accessions based on SAP data using UPGMA method主要的分组用 I、II、II-1、II-2 和 II-3 表示;节点分支只标注大于50%的自举(bootstrap)值
40、。Major clusters are labelled as I，II，II-1，II-2 and II-3 Onlybootstrap values over 50%are shown112第 23 卷第 1 期草业学报 2014 年图 4基于 SAP 数据描述 84 份老芒麦种质间遗传关系的主向量分析Fig 4Two-dimensional principal coordinate analysis depicting genetic relationshipsamong 84 E sibiricus accessions based on SAP data2 4老芒麦地理类群的遗传结构
41、分析根据采集地及其生态条件的差异，可以将供试种质划分为四大类群，即青藏高原、新疆、蒙古和俄罗斯类群。基于扩增带(记为 1 的带)和无效带(记为 0 的带)的频率，对群体遗传结构进行了分析。AMOVA 分析结果显示:在总的遗传变异中有 79 62%发生在类群内，有 20 38%发生在类群间(ST=0 204)，群体间和群体内的变异均为极显著(P 0 0001)(表 4)。表 44 个老芒麦地理类群的分子方差分析(AMOVA)Table 4Analysis of molecular variance(AMOVA)of four germplasm groups of E sibiricus变异来源
42、Source of variation自由度d f方差和Sum of squares变异组分Variance component变异百分率Percentage of variation(%)P 值P values类群间 Among groups3467 38630203800001类群内 Within groups801969 642462796200001总计 Total832437 023092212ACTA PATACULTUAE SINICA(2014)Vol 23，No 12 5老芒麦地理类群的聚类分析基于 AMOVA 分析，可以得到类群间两两比较的ST值，它可以代表标准化的类群间遗
43、传距离(pairwiseSTdistance)(表 5)。青藏高原类群与其他类群间的遗传距离均比较大，而剩余 3 个类群间的遗传距离比较小。类群间成对 ST的变幅为 0 0371(蒙古类群与俄罗斯类群间)0 3547(蒙古类群与青藏高原类群间)。为更好地了解各类群间的遗传关系，利用表 5表 54 个地理类群间的成对 ST遗传距离Table 5Pairwise STdistances amongfour ecogeographic groups地理类群Ecogeographic groups蒙古Mongolia俄罗斯ussia新疆Xinjiang俄罗斯 ussia00364新疆 Xinjiang
44、007920 0480青藏高原 Qinghai-Tibet Plateau029860288602562中的 ST距离，进行 UPGMA 聚类分析(图5)。4 个地理图 5基于 AMOVA 获得的遗传距离对 4 个老芒麦地理类群的 UPGMA 聚类Fig 5UPGMA clustering of four geographic groupsof E sibiricus using genetic distancesgenerated from AMOVA群被明显划分成两支，一支为青藏高原类群，另一支包括蒙古、俄罗斯和新疆类群。青藏高原类群明显区别于其他 3 个类群，这与对 84 份种质的 UP
45、GMA 聚类结果一致(图 3)。3讨论3 1SAP 标记的多态性和变异形态 农艺性状和生化标记(同工酶和种子贮藏蛋白)是评价植物种内遗传多样性的常用手段7，27-30。由于不受环境影响、不受限于植物的发育阶段，分子标记目前已成为遗传多样性评价的强有力的主流研究手段。虽然目前有关利用分子标记研究老芒麦种质遗传变异的报道很少，但 APD、SS、AFLP、PC FLP 等 DNA 分子标记已广泛用作披碱草属植物的群体遗传结构和种间系统进化研究31-34。SAP 标记综合 APD 标记的简便性和AFLP 标记的高多态性和稳定性于一身，其上下游通用引物可以搭配使用，极大地提高了引物的利用效率，是一种进行
46、遗传多样性评价、品种鉴定和系统进化研究的有效工具9，13。本研究得到的老芒麦种质的 SAP 多态性比率(PP)为 60 24%，低于已报道的禾本科植物野牛草(95%)13 和鸭茅(Dactylis glomerata)(84 4%)35，而且也低于对青藏高原地区老芒麦 SAP 研究的结果(86 48%)36。本研究利用 23 个引物组合共扩增出 337 条带，其中多态性带 203 条，平均每个引物组合扩增多态性带 8 8 条，说明 SAP 的扩增产率较高，非常适合对大规模种质的遗传变异检测。由于 SAP 可以采用更加灵敏的聚丙烯酰胺凝胶银染或荧光标记来检测扩增带，而本实验采用的是较为简便的琼脂
47、糖检测法，这可能是本研究所得的多态性比率较低的部分原因。84 份老芒麦种质间的平均遗传相似系数(GS)为 0 865，表明供试材料间具有较近的遗传关系，这很可能与老芒麦的繁育方式相关。一般来说，相对于异花授粉和常异花授粉植物而言，自花授粉植物具有较高的群体间遗传变异和较低的群体内遗传变异37。由于老芒麦存在较高的异交率，并非严格的自花授粉植物，属于常异花授粉植物，所以每份种质都可以看作是一个内部存在较高变异的小群体，而本实验采用的是混合单株提取 DNA 法(bulked DNA)，可能会掩盖种质内的遗传变异，降低决定种质间遗传关系的多态性带的数目;加上种质间在繁殖后代过程中存在一定的基因流(花
48、粉流)38，这两种因素可能会在一定程度上降低种质间的遗传差异，导致种质间较高平均 GS 值的出现。根据地理来源的不同，将供试种质划分为四大地理类群。地理隔离、生态隔离和繁殖隔离会极大地影响植物的种内遗传多样性39。所以青藏高原类群与其他 3 个类群种质间平均 GS 值均较小，其原因可能是青藏高原与其他三地区的生态地理环境存在的巨大差异所致。本研究运用 AMOVA 分析的结果表明:老芒麦地理类群内的遗传变异占总变异的 79 62%，类群间的遗传变异占总变异的 20 38%，基于 Shannon 指数的分析结果与 AMOVA 分析结果非常接近。另外在 4 个地理类群中，青藏高原类群具有最高的 Sh
49、annon 多样性(Ho=0 2398)。这表明进行老芒麦遗传资源的挖掘利用时，应更多地重视本地优异资源特别是青藏高原地区资源的收集、保护及隔离繁种。3 2供试种质间及其地理类群间的遗传关系根据表现所有供试种质间遗传关系的聚类树形图和主向量空间分布图来看，各种质的聚类分布与地理来源312第 23 卷第 1 期草业学报 2014 年有较强的关系40。种质的地理来源代表了不同的宏观生态环境，而这些不同的生态环境条件是造成种质间的遗传变异的主要因素41。本研究供试种质被分成两大类的原因，可能主要依赖于青藏高原种质的特有生态地理适应性。由于青藏高原的高海拔及它被喀喇昆仑山、阿尔金山和祁连山等著名高山与
50、其他种质的来源地区隔离开来42，造成其植物种质可能具有特定的生态地理适应性。需要注意的是，来自于新疆、蒙古和俄罗斯的种质并没有按地理来源被清晰的分开，可能与这 3 个国家或地区接壤且并无明显生态条件差别有关。另外，种质繁殖后代过程中的遗传交换可能会加剧种质间的遗传相似性。同样，基于 AMOVA 分析产生的类群间 ST值的聚类分析也反映了相似的实验结果。虽然 AMOVA 分析表明地理类群间的变异仅占总变异的20 38%，但达到了极显著水平，这从另一个侧面反映了青藏高原种质类群与其他类群间存在较大的遗传差异。本结果与 Chen 等43、陈智华等44 和苗佳敏等45 对垂穗披碱草(Elymus nu