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1、书书书第!卷第#期!$年#月生态学报%&%(&)*)+,&%-,.,&%/012!，.02#345，!$!#：$%&()*)+,(-&(.基金项目：国家自然科学基金资助项目（6$#7$88$）；宁夏大学科研基金资助项目（9:$7$;）收稿日期：!$7$;$;；修订日期：!$!），男，宁夏隆德人，硕士，主要从事微生物分子生态学研究2(?41：1ABC DEF2 GHF2 ID!通讯作者&0JJGKL0DHDM 4FNO0J2(?41：B5PC DEF2 GHF2 ID/)0.1-,).,2：OG LJ0PGIN B4K QD4DI4115 KFLL0JNGH R5 NOG.4N0D41.4NFJ
2、41-IGDIG S0FDH4N0D 0Q&OD4（.02 6$#7$88$）；OG.4NFJ41-IGDIGS0FDH4N0D 0Q.DME4 TDUGJKN53(,41 1-：!$7$;$;；5(#1 1-：!$!8$6,)+7-#!8：*,VF，34KNGJ2?4D15 GDM4MGH D?01GIF14J?IJ0R41 GI010M52(?41：1ABC DEF2 GHF2 ID元基因组文库分析技术研究进展李W 武8，赵W 勇!，王玉炯8，!（82 宁夏大学生命科学学院西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，银川W#$!8；!2 上海水产大学食品科学学院，上海W!$=$）摘要：随着
3、新的分析技术的不断出现和成熟，促进了微生物分子生态学及相关学科的诞生和迅速发展。其中，元基因组文库分析技术即是近年来微生物分子生态学研究领域兴起的一种新的分析技术。就元基因组分析技术诞生的背景及该技术的原理进行了讨论，着重阐述了元基因组文库分析技术在寻找新基因、开发新的生物活性物质、研究群落中微生物多样性、人类元基因组测序等方面的应用。另外，归纳总结了目前国际上常用的诸如 X&:为基础的筛选、荧光原位杂交（Q1F0JGKIGDN!#!$%O5RJHY4N0D，S,-Z）、底物诱导的基因表达筛选（KFRKNJ4NG DHFIGH MGDG GELJGKK0D KIJGGDDM，-,+(）、基因芯
4、片等元基因组文库筛选方法，并就不同方法的优缺点进行了分析和讨论，指出了目前元基因组文库分析技术存在的主要问题并对今后该技术的发展进行了展望。关键词：微生物分子生态学；元基因组文库分析技术文章编号：8$=66（!$）$#!$W 中图分类号：，=6W 文献标识码：%514-.(9,.2-+.)2,(*).*,:7-78-.-*89,9 2!)19*,VF8，9Z%)0DM!，V%.+F_0DM8，!8&()*+,-*$,-(,./!#$-(,.01%2*$!,.,-3-,$2$!,*1 4$!5!6*$!,.782!*5 9!,5,:!2*5;#,%-2#!*，72,5,.)!.72!2#，?!:
5、!*4!A-#!$(，B!2%*#$!8，=!*!=,55:,.C,1 72!2#，7*:*!C!#-!#4!A-#!$(，7*:*!$=$，=!*!#$%&()$*)+)$，;）：;=?;=,5:97-(：OG HGUG10LDM 0Q?0HGJD?01GIF14J R010M5 O4UG RGGD BHG15 4LL1GH D NOG HGUG10L?GDN 0Q D0UG1 NGIOD010MGK4DH 4LLJ04IOGK FKGH D NOG KNFHGK 0Q?IJ0R41 HUGJKN5，BOIO O4UG RGGD 4IIG1GJ4NDM NOG Q0J?4N0D 0Q DGB
6、 JGKG4JIO QG1HKKFIO 4K?0HGJD?01GIF14J?IJ0R41 GI010M5 4DH NK JG14NGH KFRPGINK2 OG NGIOD010M5 0Q 3GN4MGD0?I&10DG*RJ4J5%D415KKK 0DG 0Q KFIO NGIOD010MGK JGIGDN15 FKGH D NOG KNFH5 0Q?IJ0R41 GI010M52,D NOK JGUGB，BG K5KNG?4NI4115 JGUGBGH 4DHHKIFKKGH NOG R4IMJ0FDHK 0Q Q0J?4N0D，LJDIL1G 4DH 4LL1I4N0DK 0Q NOK
7、NGIOD010M5 D NOG?IJ0R41 GI010MI41 KNFHGK2SFJNOGJ?0JG，NOG 4LL1I4N0DK 0Q NOK?GNO0H D NOG HKI0UGJ5 0Q DGB MGDG 4DH D0UG1 R0I4N415KNK，D NOG KNFH5 0Q OF?4D?GN4MGD0?IK 4DH?IJ0R41 R0HUGJKN5 D 4 I0?FDN5 BGJG GENGDKUG15 HKIFKKGH OGJG2 VG 41K0 KF?4JYGH HQQGJGDN4LLJ04IOGK IFJJGDN15 FKGH D KIJGGDDMK 0Q?GN4MGD0?
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9、*)+,(-&(.!#$%&(：/)*(0*-1/,(1)2,-*()*)+3；/-+.)/,(*).*,21-13-.-*34,4微生物分子生态学是研究生态环境中微生物与其周围生物以及微生物与环境之间相互关系的学科。它主要以微生物基因组 567 的序列信息为依据，通过分析样品中 567 分子的种类和数量来反映微生物区系的组成和群落结构及其变化，进而研究微生物与生物环境、微生物与非生物环境之间的相互关系及其分子机制 8。随着新的分析技术的不断出现和发展，促进了微生物分子生态学及相关学科的诞生和迅速发展，这些技术对促进微生物分子生态学的发展发挥着巨大的作用，元基因组文库分析技术即是近年来微生物分
10、子生态学研究领域兴起的一种新的分析技术。本文将对元基因组分析技术的原理，应用及元基因组文库筛选策略等展开论述。)*背景介绍微生物是地球上已知种类最多、数量最大、分布最广泛的生物类群，自然界中仅原核微生物的总量大约在9:8;:8;个?。如何开发和利用地球上丰富的微生物资源是科学家长期不懈的追求目标。一直以来，人们对微生物世界的认识主要依靠传统的分离培养方法，由于自然界中的微生物只有很少一部分能被现有方法分离培养，如海水中只有;&;8=;&8的微生物可以被培养，土壤中只有;&B 1C67 基因克隆文库分析技术的诞生，使得研究者突破了传统分离培养方法的限制，加快了人们对微生物世界的认识。但是由于该方
11、法本身诸多不足，如 DEC 扩增本身及引物设计带来的偏差，8B 1C67 基因本身在原核生物基因组中只占总基因组的;&;A 左右，因此，不能完全解析生态系统中微生物多样性，也不能由此获得这些微生物种群的详细的生理生化、遗传、生态和功能多样性方面的信息，F。随着研究的需要，一种新的技术即元基因组文库分析技术在近年来得以形成，该技术目前正处在发展阶段，并将不断成熟。+*元基因组概念及元基因组文库分析技术原理元基因组（/-+.)/）是指一个群落中的不同微生物基因组的总和，也叫环境基因组或群落基因组 G。它是通过直接提取环境样品总 567，并用合适的限制性内切酶对 567 进行切割，获得大片断的环境样
12、品567 后直接与载体连接构建克隆文库，然后对文库进行筛选或者直接进行高通量测序的分析技术。和 8B1567 文库不同，元基因组文库是直接对全基因组 567 进行的克隆，理论上可以获得对研究样品中所有的微生物的全基因组的序列信息 F，因此获得的遗传信息远大于 8B 1567 文库。同时元基因组文库选用的是能容纳大片断的载体，如 H7E 载体可以保证大于 8;I2 的 567 片断在!#$%&#$(#)*不丢失 J。正是由于插入片断大小的提高，加之在原核细胞中，多数基因及其调控因子成簇排列在染色体上 8;，这就可以通过克隆大片断 567 的策略，直接捕获编码酶、蛋白等的基因或基因簇，借助外源启动
13、子使其在宿主中表达 88。因此，元基因组文库中有大量有用的可供开发的基因资源，如果用合适的方法加以筛选，就可以发现新的基因和新的代谢途径及产物等。所以，元基因组文库构建技术将使人们对自然环境中的微生物有全新的认识 8?，8等人构建了马尾藻海的微生物群落元基因组文库，用随机鸟枪法（%!)*L+.)/4!)+0.4M0.(,.+）进行测序，一共测定了 8;&9A:8;G个碱基的序列，从中鉴定了 8&?:8;个以前未知的基因。C).N).等人 8F对一个农田土壤样品用两种方法构建了?个 H7E 文库（BO8 和 BO?），其中BO8 含有 9G 个克隆，BO?含有?9AF 个克隆，通过向培养基中加入
14、不同酶的水解底物，然后根据酶的水解特性，如克隆表面颜色变化等来对 BO8 中的蛋白酶、567 酶、几丁质酶和抗菌物质等进行筛选，从中筛选到了 8?个有活性的克隆，而 BO?中仅对具有溶血活性的克隆进行初步筛选，就得到了?J 个目标克隆。HP-等人构建8F;?Q A 期Q Q Q 李武Q 等：元基因组文库分析技术研究进展Q!#：$%&()*)+,(-&(.了蒙特里海湾表层水的/01 文库，以 234 5670 基因为标记对文库进行筛选，发现了一个含 289:;插入片断的克隆，该片断属于!。对该片断的深入研究发现 406=3类群可能具有新的获能方式，而这种获能方式一直被认为只有古菌才具有 2，2=
15、。!&#研究群落中微生物多样性，解析群落结构和功能通过构建元基因组文库进行高通量测序，从而发现新的尚未被培养的微生物，了解环境样品微生物多样性，并对其功能进行预测，进而研究微生物群落结构和其生态学功能之间的关系。?A).2B等人构建了一个处理矿山酸性排水的生物膜上的微生物元基因组文库，并用鸟枪法对群落进行测序，从中鉴定出了!#$%&#()*+5)C#DD 和,(%#)-&+-#DD E 个几乎完全的基因组和其他 个基因组的部分序列，并根据微生物之间的基因的功能互补揭示了它们的碳氮固定和产生能量的代谢过程和这些微生物在极端环境中的生存策略。同年美国科学家 F.5 23等人启动了迄今为止最大的 2
16、 项元基因组项目，他们对马尾藻海的微生物群落进行了序列测定，根据序列拼接信息，这些序列来自 2=99 个不同微生物种群的基因组 G70，其中 28=个是未知细菌种群的。由于元基因组文库中含有大量的序列信息，这些大片段的基因组 G70 序列能够提供给人们尚未培养微生物的生理生化、遗传、生态和功能多样性方面的大量的信息。通过序列对比，有时还能在带有 234 5670 基因的克隆中发现其他的功能相关的开放读码框（)#.5-H,.+I5-JA，K6LA）或者是操纵子（)#5).A），这样就可以把基于 234 5670 的系统进化和功能基因联系起来 E9。!&!#人类元基因组测序人类元基因组即人体内共生
17、微生物的元基因组。它是通过构建大插入片断文库，尽可能的将人体内全部微生物全基因组进行克隆，从而对该元基因组文库做进一步的分析。E99M 年 29 月 EN OEB 日，“人类元基因组计划圆桌讨论会议”在巴黎法国科学院召开，共有美、英、法、中等 2 个国家的=9 余名代表出席了会议，会议围绕对人体内共生微生物群落进行全序列测定的核心议题，针对测序策略和方法、项目对医学和健康领域的作用和影响、项目对生物技术产业的作用和影响等方面进行了 EH 的充分讨论和交流。“人类元基因组计划”被称为“人类第二基因组计划”，但其规模和广度将远远超过人类基因组计划，预计把人体内共生菌群的基因组序列测定出来其测序工作
18、量至少相当于 29 个人类基因组计划。“人类元基因组计划”有可能发现超过 299 万个新的基因。这些基因的发现对于阐明许多疾病的发生机理、研究新的药物、控制药物毒性等都将发挥巨大的作用。因此，“人类元基因组计划”将是继人类基因组计划以后又一项宏大的国际科学工程，而元基因组文库分析技术将会在该工程的实施过程中发挥巨大作用。目前，不同的实验室已经通过构建文库和测序获得了大量的基因片断，元基因组分析技术的一项长期目标将是通过不同 G70 片断间重叠部分（)P5*-#,.+I5-+J.A）及染色体步移（%-*:,.+）和亚克隆（(*).)(*).）等手段重建那些尚未培养微生物的基因组 E2。同时，面对
19、文库中丰富的基因资源，如何用最有效的筛选手段发现它们，从而更加深入的研究未培养微生物，更好的开发和利用它们的代谢产物等，是研究的热点之一。$#元基因组文库筛选方法元基因组文库中往往有成千上万甚至上百万的克隆，而其中可以直接根据其表型特性如克隆颜色或常规方法筛选的克隆很少，如 Q.EE等人在从文库中筛选具有分解脂肪能力的克隆时，仅从 N&R29M个克隆中筛选出了 2 个目标克隆。因此好的筛选方法将会使筛选工作事半功倍，以下对目前比较成熟的筛选方法进行简述。$&%#以 S16 扩增为基础的筛选以 S16 为工具，用进化相关基因如 234 5670 基因，或功能基因如(./，-+%/等的序列信息设计
20、引物对文库进行 S16 扩增是比较常用的文库筛选策略。如 TU*5 E等人对 2 个废水处理系统元基因组文库用 2345670 基因为标记构建亚克隆文库，随机从文库中挑了8E 个克隆进行测序并在 6GS 数据库中比对，发现这8E个克隆中 234 5670 基因全是比较新的，且有 2$M 的序列和 012$(%#3*&序列比较接近。另外，也可以用酶的编EN9EV生V 态V 学V 报V V VEN 卷V!#：$%&()*)+,(-&(.码基因如氨单加氧酶基因、铵氧化酶基因、苯酚羟化酶基因等的序列信息设计引物等进行筛选/0，/1。该法的不足是引物设计需要序列信息已知，文库中那些和现有基因序列完全不一
21、样的基因无法被筛选/2。另外，345 扩增长度有限，一般只能获得基因或基因簇的一部分，为了得到完整基因的序列信息还需要后续工作，为此也发明了不少新的 345 技术来获得全长序列/6，/7，但筛选工作比较费时费力。后来又有人提出了一种全新的思路，即利用整合子（,.+8).9）的特性设计 345 引物进行扩增，得到比较新的基因，该法在新基因发现上将起到比较重要的作用/:，;?)889 等人;A分析了/个健康人口腔样品混合物中微生物的元基因组文库，通过在培养基中加入四环素来筛选有四环素抗行的克隆，共从 01 个克隆中得到了 A7 个目标克隆，他们还对这些克隆中插入片段序列做了深入的分析。B 等人;/
22、构建了一个森林土壤样品的 C)9D,E 文库，共得到;6 个克隆，他们通过向 BF 培养基中加入底物三丁酸甘油酯来筛选脂肪分解酶类，最后通过克隆表型筛选得到 7 个目标克隆，并对这 7 个克隆=GH 进行限制酶切和后续酶活性试验，再对这 7 个进行亚克隆，最后成功的得到了 2 个可水解脂肪的克隆，对这 2 个克隆的序列分析发现，他们和已知脂肪分解酶的基因相似性在;0I J0-,).）是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶=GH 分子或5GH 分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞。KLMN 技术已经用于不同生态系统的研究中;1，该技
23、术也开始被用于元基因组文库的筛选中。如BR-O 等人;2构建了&(!)*#+%,!-.*#的 C)9D,E 文库，得到;/个克隆，并随机选取 627 个克隆，用&(!)*#特异性探针 4S:7?AA11 去筛选其中的 A2M 85GH 基因，发现其中有 A/个克隆为阳性克隆，该结果证明用 KLMN 技术筛选大插入片段元基因组文库的可行性。KLMN 技术的不足之处是该技术要求细胞具有良好的通透性，如果通透性不好，那么探针就很难进入到细胞内部和靶序列杂交;6。另外，探针设计需要序列信息已知，对序列全新的基因无能为力。!&!#底物诱导的基因表达筛选（9OQ98-,.EO(E+.T#899,).9(8
24、.,.+，MLUSV）该法是由 W-.-Q 研究小组首次提出来的;7，由于与微生物基础代谢相关的基因的表达一般是受底物或代谢中间产物等诱导的，这样，在文库筛选时，加入某种底物就可能诱导基因表达，反之亦然。根据这一原理研究者构建了一种特殊的基因表达载体#A7KUK3;7，该载体含有(*/启动子和绿色荧光蛋白结构基因,+0，当外源基因片断插入(*/启动子和,+0 基因之间时，用底物加以诱导，(*/启动子启动外源基因表达，同时,+0也跟着表达，然后借助荧光激活的细胞分拣技术（K*O)89(.(?-(,R-E(*9)8,.+，KH4M）进行筛选。W-.-Q 等人;7用 MLUSV 技术筛选了一个地下水
25、微生物群落的元基因组文库，用两种底物诱导，共从A1/)立即在 G-O8 上发表了一篇评论文章对其不足之处进行了讨论;:，EB)8.)指出，有些基因的表达除了受底物诱导外，还可能受其他因子的诱导，而且有些基因并不需要诱导，是本底水平表达的，同时，有些可诱导基因在新的宿主中有可能不可被诱导表达。但是考虑到元基因组文库中;6/X 1 期X X X 李武X 等：元基因组文库分析技术研究进展X!#：$%&()*)+,(-&(.含有大量的基因，这其中必然有一部分是可诱导的，因此，是可以被该技术检测到的。同时，由于该方法文库筛选时借助/012 技术，是一种半自动化文库筛选方法，在很大程度上节约了时间和成本，
26、而且，筛选用的底物不用同位素等特殊标记，减少了毒副作用，也降低了使成本。23456 可能会在以后的工业化筛选中成为很好的筛选技术 78。!&#用基因芯片技术进行文库筛选基因芯片技术是 79 世纪:9 年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一，是集微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术。该技术可以将极其大量的探针同时固定于支持物上，所以一次可以对大量的生物分子进行检测分析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、通量低等不足。由于该技术相比其他的分子技术具有高通量、高灵敏度、低成本、自动化等优势;9，在微生物分子生态学研究中可能发挥极其重
27、要的作用;。目前，该技术在微生物分子生态学中的应用主要包括：（(*),?-=A，BC0A）；（7）功能基因芯片（D.(,).-*+.-=A，/40A）；（E）群落基因组芯片（()FF.,=+.)F-=A，140A）;7。随着元基因组分析技术的发展，基因芯片技术有望成为元基因组文库筛选的有力工具;E。如 2G-;等人在对元基因组文库测序之前，首先用芯片进行初步筛选，这在很大程度上减少了测序量和后续的序列拼接等工作量。芯片技术在用于元基因组文库筛选时，除了其本身由于交互杂交等导致的特意性低，灵敏度较低等缺点外;H，由于元基因组文库本身的特点，如 IJ0 片断大小大大提高，样品复杂性提高等，这对芯片
28、设计提出了新的要求;8。另外，由于基因芯片探针设计需要已知序列信息，这使得对未知的功能基因等筛选几乎不可能。当然，由于芯片技术以其不可替代的优势已经在各种微生物生态系统中得到应用，该技术也有望在元基因组文库筛选中发挥作用。!&$#其他筛选策略常规的分子杂交，抗原抗体反应等技术也可以用于筛选，也有公司开发出了专门筛选某些酶、蛋白等的试剂盒，在食品工业、医药等领域有较好的应用前景;K。此外，在构建文库之前对样品有目的的进行富集，然后提取样品 IJ0 构建文库，这也可以提高目的克隆的数量，如在马尾藻海的微生物群落研究中，在提取样品IJ0 前先用滤膜过滤除去真菌细胞 8。也可以根据筛选目的的不同，在提
29、取 IJ0 前在目标样品中加入某些底物使得某类微生物快速生长而富集，或加入抑制某类微生物生长的底物，而使其他微生物得以快速生长而富集。#展望元基因组文库的构建和高通量快速测序已经比较成熟，目前元基因组文库分析技术主要面临两大难点，其一是高通量测序后如何对得到的大量序列数据进行正确的拼接从而组建完整基因或完整基因组，其二是如何有效地对文库进行筛选从而获得目的克隆。随着分子生物学、计算机科学、生物信息学、系统生物学等学科及相关技术的发展以及学科的相互交叉，相信必定会促进元基因组分析技术发展，也会有新的技术发明被用于元基因组分析中，使得元基因组文库分析技术在微生物分子生态学研究领域大有作为。%&(&
30、)*&+：*N,.?#.?.A-+,A D)M-*-,.+F,()G,-*()FF.,A,.D)?N-AA)(,-?()A=AFA&3.&O&/)?P,()G,)*&，799，8K（N7）：.A.F-T),=&B)(&J-*&0(-?&2(,&U 2 0，:V，:H（W，2,F,?U，X-+-J&0.-,M?,(F,()A()#,(F!)?D)().,.+*,M,.+F-,.G-(,-&1-.&O&P,()G,)*&，:K:，7H（E）：;H;79&;L X)AM,S Y，4)SA)=O，I-/Z&,+!?,MA,=,.IJ0)D A),*G-(,-&0#*&5.M,).&P,()G,)*&，
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