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1、动 物 医学进 展。2 0 1 2，3 3(1)：4 4 4 7 Pr o g r e s s i n Ve t e r i na r y M e d i c i ne 犬 白细胞介素 1 8基因的克隆与序列分析 侯静，古锋，徐 志文，朱玲L (1 四川农 业大学动物医学院，四川雅安 6 2 5 0 1 4；2 动物生物技术中 心四川省 重点 实验 室，四川 I 雅安 6 2 5 0 1 4)摘 要：为研究犬白细胞介素 1 8(I L 一 1 8)的生物学功能，从犬外周血 中分 离白细胞，经 C o n A刺激后，提 取 总 R NA，通 过 反 转 录一 聚 合 酶 链 反 应(R T-P
2、C R)扩 增 犬 I L 一 1 8基 因，连 接 p MD 1 9-T s i mp l e v e c t o r，转 化 DH5 c c 感受态细胞，经双酶切鉴定，获得 阳性重组质粒后进行序 列分析。结果表 明，获得 的犬 I L 一 1 8基 因全 长 为 5 8 2 b p，编码氨 基 酸 1 9 4个。将 犬与 Ge n B a n k中牛、猫、羊、猪、鼠、兔、狐、貉 I L-1 8基 因进 行 同源性 比 较，发 现 犬 I L 一 1 8与红狐 和貉 I L 一 1 8的 同源性 最 高，氨基 酸序 列 同源性 分别达 9 6 4 、9 1 2 ，与其他 物 种 则 存在 较
3、 大种属 差异。关键词：犬 I L _ 1 8基 因；白细胞；克隆；测序；同源性分析 中 图 分 类 号：Q7 8 5；$8 5 8 2 9 2 文 献 标 识 码：A 白细胞介素(i n t e r l e u k i n s，I L)是 由活化的单核 巨噬细胞或淋 巴细胞产生 的一类 主要 负责信号传 文章编号：1 0 0 7 5 0 3 8(2 0 1 2)0 1 0 0 4 4 0 4 递，联络白细胞群，调节细胞 的活化、增殖和分化作 用的细胞因子。白细胞介素 1 8(I L 一 1 8)属于 I L 一 1 细 收稿 日期：2 0 1 1-0 8 3 1 基金项 目：“长江学者和创新
4、 团队发展计 划”创新 团队项 目(I R T O 8 4 8)作者简介：侯静(1 9 8 8)，女，四川南充人，本科 生，主要从 事动 物检验检 疫研 究。通讯作者 1-5 3 许益鹏，章奕卿，李江红，等蜜蜂囊状 幼虫病毒病 的 Ne s t R NA聚合酶部分 基因 的克隆 和序 列分 析1,J 2 中 国畜牧 兽 P C R检测 J 科技通报，2 0 0 7，2 3(6)：8 2 4 8 2 7 医，2 0 1 0，3 7(1 1)：5 0 5 2 6 3 李 明，马呜潇，张轶博，等辽宁地区中华蜜蜂囊状幼虫病 1 1 Ma M，Ma C，L i M，Wa n g S，e t a 1 L
5、o o p-me d ia t e d i s o t h e r 一 的 RT-P C R检测 J 畜牧兽医科技信息，2 0 0 8(1 2)：2 6 2 7 ma l a mp l i f i c a t i o n f o r r a p i d d e t e c t i o n o f C h i n e s e s a c b r o o d v i r u s 7 沈克飞，曹兰，付利芝，等中蜂囊状 幼虫病 病毒特异性半 J J Vi r o l Me t h，2 0 1 1，1 7 6(1-2)：1 1 5 1 1 9 套式 RT-P C R检测 方法 的 建立 及应 用 J 动
6、 物 医学进 展，1 2 Z h a n g Y，L i u X，Z h a n g W，e t a 1 Di f f e r e n t i a l g e n e e x p r e s 一 2 0 0 9，3 0(1 2)：3 9 4 2 s i o n o f t h e h o n e y b e e s Ap i s me l l i f e r a a n d Ac e l a n a i n d u c e d 8 董欣妮，史平军，付长红，等 辽西地 区中华蜜蜂囊状 幼虫病 b y Va r r o a d e s t r u c t o r i n f e c t i o n
7、 1,J J I n s e c t P h y s i o l，2 0 1 0，5 6 病毒部分结构基因的克隆及分析 J 黑龙江畜牧兽 医，2 0 1 0，(9)：1 2 0 7 1 2 1 8 (3)：1 1 4 1 1 6 1 3 张国只中华蜜蜂中肠细胞培养及 C S B V感染 中华蜜蜂 和意 9 周亮，宋战昀，王全凯，等蜜蜂囊状 幼虫病 RT-P CR快速 大利蜜 蜂幼 虫 的蛋 白质 组分 析 D 广东 广州：中 山 大学，检测方法 的初步应用 J 蜜蜂杂 志，2 0 1 0，3 0(6)：9-1 0 2 0 0 9 1,1 o 马鸣潇，李明，袁春颖，等蜜蜂囊状幼虫病 RNA依赖的
8、 Ge n o t y pi n g o f Ho n e y b e e S a c b r o o d Vi r u s CA0 La n ，SH EN Ke f e i ，ZHANG Yi f a n ，LU O W e n-hua ，W ANG Ru i s he ng ，REN Qi n ，GUO J u n ，WANG Z h i d o n g。，DAI Ro n g-g u o (1 C h o n g q i n gAc a d e my o fAn i ma l S c i e n c e s，Ro n g c h a n g，C h o n g q i n g，4 0 2
9、 4 6 0，C h i n a；2 Ag r i c u l t u r a l T e c h n o l o g y E x t e n s i o n S t a t i o n o f S h a n g y i n g，S h u h u a，J i l i n，1 3 2 6 0 7，C h i n a)Ab s t r a c t：Ge n o t y p i n g wa s p e r f o r me d b a s e d o n RNA d e p e n d e n t RNA p o l y me r a s e g e n e p a r t i a l s e
10、 q u e n c e s o f s a c b r o o d v i r u s，t a r g e t e d b y p r i me r p a i r s S B 1 4 f S B 1 5 r t O i n t e r p r e t e v o l u t i o n a l r e g u l a r i t y o f S B VR e s u l t s s ho we d t h a t S BV wa s d i vi de d i nt o t hr e e d i s t i nc t g e ne t i c l i ne a g e s，Eu r op
11、e a n g e no t y pe c o ns i s t s of Ce n t r a 1 Eu r o p e a n s u b t y p e a n d Br i t i s h s u b t y p e Fa r Ea s t e r n g e n o t y p e c o n s i s t s o f e a s t e r n h o n e y b e e s u b t y p e a n d Eu r o p e a n h o n e y b e e s u b t y p e。a n d S o u t h Af r i c a g e n o t y
12、 p e Th i s s u g g e s t e d S BV wa s p r e s e n t g e o g r a p h i c c l u s t e r i ng u ni t a r i l y Ke y wo r d s：Sa c br o o d v i r u s；RNA d e pe nd e n t RNA p o l yme r a s e ge ne；g e n e t y pe；ho ne y be e 侯静 等：犬 白细胞介素 1 8 基 因的克隆与序 列分析 4 5 胞 因子家族成员，为近年发现的一种分布广泛 的细 胞 因子，是 一种 重要 的免 疫
13、调节 因子，具有 多种 生物 学功能。1 9 8 9年 Na k a mu r a等 从 内毒素休 克 的小 鼠血清中分离 出一种与 I L-2功能上有相似之处 的 蛋白因子，该因子可诱导静息脾非黏附细胞产生高 水平 I F N-7。1 9 9 5年 Ok a mn r a H等从先经热灭活 的痤疮丙酸杆菌接种后经脂多糖攻击引起 中毒性休 克 的小 鼠肝 脏 中克 隆出该 因子，因其 可 诱导 T细 胞 产生 I F N一 7，故命名为 I F N一 7诱导 因子(i n t e r f e r o n 一 7 一 i n d u c i n g f a c t o r，I GI F)1-3
14、7。1 9 9 5年 又 获 得 了人 I GI F的 c D NA克隆，并在大肠埃希菌 中成功表达，于 1 9 9 6年才正式命名为白细胞介素 1 8(i n t e r l e u k i n 1 8，I L 一 1 8)。T、B细胞几乎没有 I L 一 1 8 mRNA的表 达，主要由巨噬细胞产生。I L-1 8在清除细胞 内细 菌、病毒、真菌、原核生物 等方面起着特别有效的 作用，在抗微生物感染、抗 自身免疫疾病、抗肿瘤免 疫 中具 有 很 大 应 用 潜 力E s-7 。I L 一 1 8也 被 公 认 为 一 种可 以替代传统疗法的新型治疗剂和有效的免疫佐 剂 引。近年来，国内对人
15、、鼠、猪，、鸡、毛皮动物l_ g。妇等 I L 一 1 8基因克隆及相关研究均有报道。曹殿军等 1 用犬脾细胞刺激诱导提取核酸的方法克隆 I L 一 1 8基 因。本研究通过对犬外 周血 白细胞刺激诱导后，采 用 R T-P C R 技术 克 隆 犬 I L 一 1 8基 因，并 对 其 序列 进 行分析。1 材料与方法 1 1 材料 试验犬 由四川农业大学动物医院提供的健康成 年家犬。RNA抽 提试 剂盒 购 至 P r o me g a 公 司；C o n A、反转 录酶、T a q酶、R T P C R试 剂 盒、?a m H I、E c o R I、自细 胞 分 离液、Ma r k e
16、 r DL 2 0 0 0、胶 回 收 试剂盒、p MD1 9 一 T s i mp l e v e c t o r、质粒抽提试剂盒，均 购 至宝生 物工程(大 连)有 限公 司。1 2 方法 1 2 1 总 R NA 的提取无菌采取犬外周血，肝素 抗 凝，用 白细胞分 离液 分离 外周 血 白细胞，经 C o n A 刺激诱导，收集 白细胞。用 R NA 抽提试剂盒提取 总 RNA，操作方法严格按试剂盒说明书进行。电泳 观 察 R NA 的完 整 性，并 加 RNA 抑 制 酶 于 一7 O 保存备用。1 2 2 引物设 计 根据 Ge n B a n k上登 录 的犬 I L _ 1 8
17、序列(Yl 1 1 3 3)，用 O l i g o软件设计 1对引物，并在两 侧加酶切位点 l?a m HI 和 E c o R I，加上保护碱基。引 物设 计 序 列 如 下：P 1：5 -G G A T C CA T GG C T G C T A AC CT AAC C T AAI AGAAGAC一 3 ；P 2：5 -GAA T T C C T AG C T C T T G T T T T GA A C A GT GA AC 一 3 (划 线 部分为酶切位点)，该引物 由宝生物工程(大连)有限 公司合成。1 2 3 犬 I L-1 8基 因的克隆 1 0 L体系反转录：1 t L R
18、NA，上下 游 引物各 0 5“L，8 4 5 mi n后 冰 浴 5 rai n，然后 加 R NA 酶抑 制剂 及 反 转 录酶 各 1 L，4 2水 浴 1 h。1 0 L体系 P C R：1 L RT 产物，上下游引 物各 1 L，P C R Mi x 5 L，d d H2 O 3 L。反 应 程 序 如 下：9 5。C 5 rai n；9 5。C 4 5 S；5 4 3 0 S；7 2 4 5 S，3 5 个 循环；7 2 8 mi n。1 2 4 重组质粒构建琼脂糖凝胶 电泳鉴定 P C R 产 物，回收 5 8 0 b p处 的 D NA 片 段，与 P MD1 9-T s i
19、mp l e v e c t o r 连接。将重组质粒转化到 DH5 a感受 态细胞中，涂布 Amp 平板筛选。挑取单菌落，接种 到 L B中，3 7下摇床培养 1 2 h，抽取质粒。通过 B a m H I和 E c o R工双酶切鉴定 后，将 阳性重组质 粒送 至 宝 生 物 工 程(大 连)有 限 公 司 测 序。DNA S t a r 软件对测序结果进行分析。2 结果 2 1 重 组质粒 双 酶切及 P C R鉴 定 将重组质粒进行 B a m H工、E c o R I双酶切及 P C R鉴定，得 到 与 目的 基 因 大 小 一 致 的 特 异 性 片 段，说 明所克 隆的 目的基
20、因已成功插 入 p MD1 9 一 T s i mp l e v e c t o r，初步确定成功克 隆了犬 I L 一 1 8基 因 (图 1)2 0 0 0b p 50u0 0b。b p 5 0 0 b lp 2 0 0 bp 1 0 0 b p l _Ba m H I、E c o Rl的双 酶切 严 物；2 DNA标准 DL 2 0 0 0 1 Pr o d u c t s d i g e s t e d wi t hBn m H I a n dEc o R I；2 DNA M a r k e rDL 2 0 0 0 图 1 重组质粒双酶切鉴定 Fi g 1 Do u b l e e n
21、 z y me d i g e s t i o n a n a l y s i s o f r e c o mb i na n t c a n i n e I L-1 8 2 2 犬 I L-1 8碱基 测序及 相 关分析 测序结果与 Ge n B a n k上 的犬 I L 一 1 8基 因序列 完 全 一 致，全 长 为 5 8 2 b p。狐(E F 5 8 1 8 8 9)、貉(E U2 O 0 9 6 9)、羊(A J 4 0 1 0 3 3)、牛(NM 一 1 7 4 0 9 1)的 I L l 8阅读框均为 5 8 2 b p，结果显示氨基酸 同源性 为 9 6 4 、9 1 2
22、 、8 1 4 、7 9 9 。猫(D Q1 0 0 3 7 2)、4 6 动物 医学进展2 0 1 2 年第 3 3 卷第 1 期(总第 2 2 3 期)兔(E U4 1 9 1 2 7)和猪(N M一 2 1 3 9 9 7)则 缺失 1个 氨基 源性最高，与羊、猪、牛、猫同源性也较高(表 1)。由 酸，鼠(NM_ 0 1 9 1 6 5)增加 1个氨基酸，其同源性分别D NA S t a r 软件分析得到 I L-1 8氨基酸进化树可见犬 为 8 2 9、6 7 9 、8 3 9 、5 9 3 。犬 与貉、狐 的同 与貉、狐 的亲缘关 系最近(图 2)。表 1 犬和其他动物 I L 一
23、1 8氨基酸序列 同源性 比较 Ta b l e 1 Co mp a r i s o n a m in o a c i d s e q u e n c e h o mol o g y o f c a n i n e I L-1 8 a n d o t h e r a n i m a l I L-1 8 编号 8 2 9 7 9 9 7 9 8 注：1 犬 I L-1 8氨基酸序列；2 牛 I L-1 8氨基酸序列；3 猫 I L-1 8氨基酸序列；4 貉 I L-1 8氨基酸序列；5 兔 I L-1 8氨基酸序列；6 羊 I L-1 8氨 基酸序列；7 鼠 I L-1 8氨基酸序列；8 猪 I
24、 L-1 8氨基酸序列；9 狐 I L 一 1 8氨基酸序列。No t e：1 Ca n i n e I L-1 8 a mi n o a c i d s e q u e n c e；2 B o s t a u r u s I L一 1 8 a mi no a c i d s e q ue n c e；3 F e l i s c a t u s I L-1 8 a mi n o a c i d s e q u e nc e；4 Ny c t e r e u t e s pr o c y o n o i de s I L 一 1 8 a mi no a c i d s e q u e n c e
25、；5 Or y c t o l a gu s c u n i c u l u s I L-1 8 a mi n o a c i d s e q u e n c e；6 Ov i s ar i e s I L-1 8 a mi n o a c id s e q u e n c e；7 R a t t u s n o r v e g i c u s I L-1 8 a mi n o a c i d s e q u e n c e；8 S u s s c r o f a I L-1 8 a mi n o a c i d s e q u e n c e；9 Vu l p e s v u l p e s
26、 I L 一 1 8 a mi n o a c i d s e q u e n c e 26 8 Ca ni ne I L 1 8 Vu l pe s v“l pe I L1 8 Nyc t e r e ut e s pr o c yo no i d e s I L-1 8 Fe l i s c a t us I L-1 8 OS t a?2 7$l S I L 1 8 0v i s a r i e s I L 1 8 S u s s c r o f aI L 1 8 。Or yc t ol a gu s c un i c ul u s I L 1 8 Rat t u s no t v e g
27、i c us I L-1 8 Z)U j)j U)U Nu c l e o t i d e s u b s t i t u t i o n s(1 0 0)图 2犬 I L 一 1 8基因氨基酸序 列分 子进化树分析 Fi g 2 Ph y l o g e n e t i c t r e e a n a l y s i s o f c a n i n e I L一 1 8 a mi n o a c i d s e q u e nc e 3 讨论 为 5 8 2 b p。通过D N A S t a r 分别就犬 I L 一 1 8 与其他 犬作为伴侣动物，在我国的养殖范围不断扩展，哺乳动物进行
28、同源性分析，与 Ok a n o F等 从犬肺 病毒病对养犬业影 响甚大，病毒破坏了犬的免疫系 巨噬细胞中扩增的 I L 一 1 8 碱基序列一 致。通过犬与 统，出现发热发炎等症。而 I L 一 1 8具有免疫调节 的 其他动物的氨基酸序列 同源性 比较，结果显示其进 功能，能激 活免疫系统，维持机体 的稳定性。犬 化关系与基 因水平一致，犬 I L 一 1 8与 同属犬科动物 I L 一 1 8是一种重要的细胞 因子，能诱导 NK 细胞、T 的狐和貉同源性最高，与其他动物则存在较大种属 细胞及巨噬细胞产生 I F N 一 y，还能促进 T细胞增殖，差异。本试验为犬 I L 一 1 8的表达
29、及其活性、生物学 诱导 NK细胞杀伤和 T h l细胞的细胞毒活性 ，具 功能研究提供了材料。有抗肿瘤及抗病毒等作用 ，因而可成为核酸疫 参考文献：苗的重要 免疫佐 剂 i 7-I 8 。使其在 多态性 药物 的开 1 3 王军志 生物技术药物研究开发和质量控制 M 2 版 北京：发，疾病的预防与治疗等方面具有很大的潜在运用 科学出 版社，。：一 价 值，值 得 做 进 一 步 的 研 究。?k a H K?c h K：。ji a1 H ig h 1e v e1 n d u C o n A具有调节机体免疫反应，增强 白细胞的 t r e a t d w i t h p r o p i。i b
30、t i 。E J I n f e c t I mm u n 表达活性，因此本试验从外周血分离白细胞，C o n A 1 9 8 2，3 8(2)：4 4 0 刺激 培养 1 8 h，并 成功 克 隆犬 I L 一 1 8，得 到碱 基 序 列 E 3 O k a m u r a H，T s u t s u i H，K o m a t s u T，e t a 1 C l o n i n g o f a n e w 9 O 5 9 7 2 2 8 6 7 7 6 4 8 8 4 l 1 4 O 0 3 8 9 8 8 7 3 3 O 3 5 8 9 0 7 0 7 0 5 6 5 6 5 6 9
31、6 9 4 5 1 0 3 7 3 3 2 9 8 8 8 8 8 7 8 5 4 9 9 8 9 4 3 5 6 9 2 3 7 1 9 4 9 7 8 9 6 8 5 8 侯静等：犬 白细胞介素 1 8 基 因的克隆与序列分析 4 7 c y t o k i n e t h a t i n d u c e s I F N一 7 p r o d u c t i o n b y T c e l l s E J Na 一 1 1 t u r e，1 9 9 5，3 7 8：8 8 9 1 4 Ya ma u c h i K，C h o i I I J u，L u Ho n g，e t a 1 R
32、e g u l a t i o n o f I L 一 1 8 i n He l i c o b a c t e r p y l o r i I n f e c t i o n J ，J l mmu n o l，2 0 0 8，1 8 0 (2)：1 2 07 1 2 1 6 5 S e n n e l l o J A，F B y a d R，P i n i M，e t a 1 I n t e r l e u k i n 一 1 8，t o g e t h e r wi t h i n t e r l e u ki n 一 1 2，i n du c e d s s e v e r e a c
33、u t e p a n c r e a t i t i s i n o b e s e b u t n o t i n l e p t i n-d e fi c i e n t mi c e J P r o c Na t l A e a d S c i，2 0 0 8，1 05(2 3)：8 08 5-8 0 9 0 6 B r y s o n K J，we i X Q，Al e x a n d e r J I n t e r l e u k i n 一 1 8 e n h a n c e s a Th 2 b i a s e d r e s p o n s e a n d S U S c e
34、 p t i bi l i t y t o Le i s hma n i a me x i c a n a i n B AL B c mi c e J Mi c r o b e s I n f e c t，2 0 0 8，1 0(7)：8 3 4 83 9 7 Z a k i M H，Vo g e l P，B o d y Ma l a p e l M，e t a 1 I L-1 8 p r o d u c t i o n d o wn s t r e a m o f t h e n I r p 3 i n f l a mm a s o m e c o l o r e t a l t u mo
35、r f o r ma t i o n J J I mmu n o l，2 0 1 0，1 8 5(8)：4 9 1 2 4 9 2 0 8 刘 文强白细胞介素一 1 8研究进 展 J 动物 医学进展，2 0 0 9，3 0(4)：8 3 8 6 9 郑兰兰，贾云飞，崔保安，等猪 白介素 1 8基 因的克隆、表达 及 生物学 活性 检测 J 生 物工 程学 报，2 0 0 8，2 4(2)；2 1 4 2 1 9 1 0 1 赵丽，崔保安，陈红英，等海南鸡 白细胞介素 1 8成 熟蛋 白基因的克隆及在大肠 杆菌 中的表 达 J 华南 农业大 学学 报，2 0 0 8，2 9(1)：8 8-9 1
36、 1 2 1 3 1 4 1 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 张海玲，罗国良，赵春靠，等貉白介素一 1 8(I L 一 1 8)基 因的克 隆及序列分析 J 特产研究，2 0 0 8，1 9(3)：2 0 2 4 曹殿军，于立辉，闫丽辉，等犬脾细胞 白介素一 1 8(I L-1 8)基 因的克隆与序列分析 J 中国预防兽医学报，2 0 0 3，2 5(4)：2 6 2-2 6 4 S mi t h D ETh e b i o l o g i c a l p a t h s o f I L一 1 f a mi l y me mb e r s I L一 1 8 a n d I L-3 3
37、J J L e u k o c y t e B i o l，2 0 1 1，8 9(3)：3 8 3 3 9 2 朱永红，邹全 明白细胞 介素 l 8受体及 其介导 的信号转 导 口 细胞与分子 免疫学杂志，2 0 0 1，1 7(1)：9 8 一 1 0 0 杨文刚，刘俊华 白细胞介素 1 8与肿瘤治疗 的研究进展 A 现代肿瘤医学，2 0 0 9，1 1 3(2)：4 1 2 4 2 1 Lv J i a n x i n Ex p r e s s i o n o f t a r g e t i n g I Ll 8 一 EGF f u s e d p r o t e i n a n d i
38、 t s e f f e c t o n t h e a n t i n e o p l a s t i c a c t i v i t y n v i t r o J B u l l e S c i Te c hn o l，2 0 0 9，2 5(2)：1 8 3 Pa s q u i ni S，Xia n g Z，W a ng Y，e t a 1 Cy t o k i ne s a n d c o s t i mu l a t o r y mo l e c u l e s a s g e n e t i c a d j u v a n t s J I mmu n o l C e l l B
39、 i o l，1 9 9 7，7 5(4)：39 7-4 0 1 王福祥细胞因 子佐剂对 HI V DNA疫苗 免疫效 果的影 响 口 细胞与分子免疫学杂志，2 0 0 3，1 9(6)：6 2 0 6 2 2 Oka n o F，、S a t o h M，I d o T，e t a 1 Cl o n i n g o f e DNA f o r c a nine i n t e r l e u k i n 1 8 a n d c a ni n e i n t e r l e u k i n l b e t a c o n v e r t i n g e n z y me a n d e x p
40、 r e s s i o n o f c a n i n e i n t e r l e u k i n 一 1 8 J I n t e r f e r o n C y t o k i n e Ra s，1 9 9 9，1 9(1)：2 7 3 2 Cl o ni n g a nd S e qu e nc e An a l y s i s o f Ca n i ne I n t e r l e u ki n 一 1 8 Ge ne HOU J i n g ，GU Fe n g ，XU Z h i we n ，Z HU L i n g (1 C o l l e g e o fV e t e r
41、i n a r yMe d i c i n e，S i c h u a nAg r i c u l t u r a l Un i v e r s i t y，Y a a n，S i c h u a n，6 2 5 0 1 4，C h i n a；2 Ke yL a b o r a t o r y o fAn i m a l Bi o t e c h n o l o g y o f S i c h u a n P r o v i n c e，Y a a n，S i c h u a n，6 2 5 0 1 4 C h i n a)Ab s t r a c t：To 1 a i d t h e f
42、o u n d a t i o n f o r a f u r t h e r s t u d y a n d i n v e s t i g a t i o n o f t h e f u n c t i o n o f c a n i n e I L 一 1 8，t h e I L 一 1 8 g e n e wa s a mp l i f i e d b y RT PC R f r o m t h e t o t a l RNA o f c a n i n e p e r i p h e r a l b l o o d l e u c o c y t e i n d u c e d wi
43、 t h Co n A The RT PCR p r od uc t wa s c l o ne d i n t o p M D1 9 一 T s i mpl e ve c t or The n uc l e o t i d e s e qu e n c e h a d be e n d e t e r mi n e d a f t e r b e i n g i d e n t i f i e d b y d o u b l e r e s t r i c t i o n e n z y me d i g e s t i o n Th e r e s u l t s i n d i c a
44、t e d t h a t c l o n e c a n i ne I L一 1 8 g e n e wa s 5 8 2 bp i n l e n gt h e n c o di ng a po l y pe p t i d e o f 1 9 3 a m i n o a c i dCo m p a r e d wi t h t he ge ne o f V u l p e s v u l p e s，N y c t e r e u t e s p r o c y o n o i d e s，S u s s c r o f a，O v i s a r i e s，B o s t a u r
45、 u s，O r y c t o l a g u s c u n i c u l u s，R a t t u s n o r v e g i c u s，F e l i s c a t u s o n Ge n Ba n k，r e s p e c t i v e l y，t h e a mi n o a c i d h o mo l o g y o f c a n i n e I L 一 1 8 s h o we d 9 6 4 a nd 91 2 wi t h t ha t of Vu l pe s v ul pe s I L一 1 8 a nd Nyc t e r e ut e s pr
46、 o c yo n o i de s I L-1 8 The r e i s s i g ni f i c a nt d i f f e r e n c e b e t we e n I L一 1 8 ge ne s e qu e n c e s o f d o g a n d ot he r s p e c i e s Ke y wo r d s：c a n i n e i n t e r l e u k i n 一 1 8；l e u c o c y t e；c l o n i n g；s e q u e n c e a n a l y s i s；h o mo l o g y a n a l y s i s